Name: viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems
Uploaded: 2014-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
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We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

細胞および試薬の調製<ol><li> 100％コンフルエント-前日に、当該ウイルスのアッセイプレートの適切な宿主細胞（ 表1および2）90である。 </li><li>のdH 2 O中10％ホルムアルデヒドの定着液を調製しこの例では、14.44ミリリットルの蒸留H 2 O（のdH 2 O）を用いて36％のストックホルムアルデヒド5.56 mlと混合する。 注：適切な安全な取り扱い慣行や換気ホルムアルデヒドを使用して。 </li><li> 20％エタノールとのdH 2 O中の1％クリスタルバイオレット（CV）：クリスタルバイオレット染色を準備</li><li> 2回のプラーク培地（2×濃度の依存性細胞型を、 表2を参照）を準備。どんな試薬は無菌ではない場合、0.2μmのフィルターを用いてろ過する。 </li><li>固定オーバーレイの調製（ 表3） <ol><li>液体オーバーレイの場合は、のdH 2 O中アビセルの無菌の2.4％溶液を作成凝集を防止するために、目の水を含有するフラスコに粉末を加えるで急速にゆっくりアビセルを注ぎ、室温（RT）で急速に撹拌し、撹拌棒で混合される。液が撹拌棒が均質化するためには粘度が高すぎることを証明した場合であっても均質化を確実にするために重い攪拌しながら&gt; 30分間フラスコシェーカーに切り替える。 注：ストック溶液は、低濃度で行うことができますが、ソリューションが分離してもよいし、均質化を確実にするためにリミックスする必要があります。アビセルの作業溶液は、0.6から3パーセントまでの範囲を使用することができる。 </li><li>均質化した後、室温で密封し、溶液とストアオートクレーブ。 </li><li>アガロースおよびカルボキシメチルセルロース（CMC）オーバーレイは、のdH 2％CMC 0.6％アガロースのOストック溶液を調製。溶液中にもたらすための撹拌棒およびオートクレーブやマイクロ波で混ぜる。 </li></ol></li></ol> 2.希釈液と感染症<ol><li>当日は、めっき後に、視覚的にアッセイを開始する前に、細胞のコンフルエンシーおよび生存性をご確認ください。標準の細胞形態aを確保するND〜90％のコンフルエントな単層が存在する。 </li><li>感染サンプルの倍段階希釈を行います。希釈剤（ 表2）のようなウイルス増殖のための細胞増殖培地を使用してください。問題のウイルスの予想力価に基づいて、必要な希釈液の数を変更し、常に独立してプラーク同定における細胞生存及び援助を確保するために、感染していない対照サンプルを使用しています。 </li><li>連続希釈から、1時間（ 表1）に45分間、細胞を感染させる。単分子層（ 表4）を有するウイルスの接触を最大にするために、できるだけ少量を維持しながら、セルをカバーするために接種物の十分な量を使用する。穏やかに均一な被覆を確実にし、乾燥から細胞の単層を防止するために、プレートを20分毎に揺する。 </li><li> 2倍のプラークメディアの1ミックスimmobiliz：感染後、1を使用してウェル（ 表2）で接種に直接メディアを固定する適切な容量をオーバーレイ選択肢（CMC、アガロースまたはアビセル）のオーバーレイをる。穏やかに混合すること揺する。 <ol><li> 0.6から1.2パーセントアビセルオーバーレイ媒体のワーキング溶液を得るために、2.4％のRTストックアビセル - 温め2Xプラークメディアおよび1.2で1：液体オーバーレイの場合は、1を混ぜる。 </li><li> 0.3の最終アガロース/オーバーレイ濃度を求める温度を平衡化し、30分間56℃の水浴中で加温し、2回プラーク培地の1：1混合物及び加熱された0.6％アガロースのストック溶液、場所：アガロースオーバーレイは、1を使用％。 </li><li> CMCについては、2％の原液を調製し、アガロースオーバーレイについて記載したように扱う。 </li><li>単層にオーバーレイを適用する場合、必ずしも単層の損傷を防止するために56℃の水に熱いアガロースまたはCMCを平衡化する。ソリューションは暖かいが、細胞死と減少したウイルス力価を防ぐために、触って熱くないことを確認してください。ほとんどのアガロースオーバーレイは、42℃未満に固化し始める迅速に作業および/または処理中に凝固を防ぐための小さなバッチを準備します。 </li></ol></li><li>オーバーレイを添加した後、明らかに可算である明瞭なプラークを生成するために、プレートをインキュベート。プラーク形成は、 表1を分析されているウイルスに応じて2-14日かかることができます。 注：液体オーバーレイプレートをインキュベーター内に配置されると、それらを移動しないでください。インキュベーション期間中、液体オーバーレイの移動は、塗抹斑を生じる。アガロース及びCMCオーバーレイは半固体であり、移動またはプラークの発達を監視するために光学顕微鏡下で定期的にチェックすることができる。 </li></ol> 3.固定し、染色細胞<ol><li> 、細胞を固定アビセルオーバーレイを捨てるか、吸引、および一晩（6ウェルプレートのウェルあたり&lt;1 ml）で30分間、10％ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定する。 <ol><li>アガロースまたはCMCの場合は、直接、1時間から一晩のためにオーバーレイにホルムアルデヒド溶液を加える。 注：サンプルを固定液中に長時間保持することができるが、それが何提供これは単分子層を歪めることができますように蒸発して乾燥しない。 </li></ol></li><li>染色および固定後、ホルムアルデヒドを破棄し、へらで流水または手動のいずれかで、アガロースおよびCMCのための半固体プラグを取り外しする前に。染色前に残留オーバーレイ/固定液を除去するために水でアビセルプラークをすすぐ。 </li><li>染色のために、〜15分間、クリスタルバイオレット溶液の最小量で細胞を覆う。ロックプレートを必要に応じて、さらにカバレッジを確保する。 </li><li>静かに水とクリスタルバイオレット染色を洗い流してください。一度、固定染色し、将来の分析のため無期限、店舗斑を乾燥させた。 </li></ol> 4.ウイルス力価の決定<ol><li>同じ希釈のいずれかの技術的反復の平均を取って、各ウェルのプラークを数える。 100プラークより少ないより5以上を持つ大規模なプレートフォーマットのため、割引井戸。プラークサイズおよび形態をメモしておいてください。ネガティブコントロールは、均一な単層を有するべきであり、基準対照として使用することができる。 </li><li>希釈及び総希釈係数の逆数のためにプラークの平均数を取ることによって、株式サンプルのウイルス力価を決定します。 </li></ol><img alt="式（1）" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" />注：例として、1×10 -7希釈[31（平均）/ 10 -7（希釈）が0.4ミリリットル（接種材料）をX]の反復実験のために数え30および32プラークが7.75×10 8 PFUの力価をもたらすであろう/ mlである。

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D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. 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The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

条件が著しく変化することができますように成功したプラークアッセイのための最も重要な要因は、問題の特定のウイルス培養のためのプロトコルの最適化にある。考慮すべき重要な点は次のとおりです、問題のウイルスによる細胞の互換性、適切なウイルス増殖条件、十分な希釈範囲を明確にプラークを区別するために、問題となっている細胞やウイルスに対する正しいオーバーレイの選択と染色をホストします。 VEEVとRVFVの両方が同一の宿主細胞型の多くを利用して非常に類似の条件下で成長するが、プラークの形態および成長動態の差が大きく変化する。従来、出血熱ウイルス及びアルファウイルスの伝播および指標細胞株として使用されてきたプラークアッセイのためのVero細胞を使用する場合、VEEVは、典型的には、RVFVよりも高い力価まで成長し、増加した複製動態を示し、48 hpiの4において大きな一様なプラークを開発10から12まで 。 VEEVとは対照的に、RVFV 72 HPIを必要とし、典型的にはサイズが非常に小さく、可変であるプラークを示す。 RVFV及びVEEVに対向して、インフルエンザウイルスは、高度に特異的な細胞をホストし、組織培養を介して伝播することは困難である。インフルエンザウイルスは、ウイルスの侵入及び融合は、通常、宿主細胞のα-シアル酸表面受容体との結合を介して標的細胞への侵入を媒介するウイルス糖タンパク質hamagglutinin（HA）と細胞表面受容体の結合によって開始される。 HAは、すべてのインフルエンザウイルスの膜エンベロープ内に存在し、特定の宿主細胞プロテアーゼによるサブユニットHA1及びHA2への切断を必要とする三量体糖タンパク質である。さらに問題を複雑にしているのは、これらの切断部位は、多くの場合、ウイルス株13の間で変化することができる。 HAを切断できるプロテアーゼの発現が、特定の組織に限定されるように、アルをプロテアーゼeは、多くの場合、選択された宿主細胞13に、ウイルス融合および侵入を容易にするために、細胞培養培地に加えた。ウイルスHA 14,15のタンパク質分解活性化を介して（任意トリプシン不活性化血清の非存在下で）マルチサイクルの複製を促進する：TPCKトリプシンをMDCKおよびVero細胞の両方で細胞培養に使用される一般的に使用されるプロテアーゼの一例である。 この研究等に示されるように、ウイルスのライフサイクルの違いは、ウイルスの異なるクラスおよび種間で有意な差異を、オーバーレイの選択、プレートフォーマット、および収集時間に影響を与えることができる。我々の研究では、アガロースオーバーレイは、ウイルスおよび細胞型の広い範囲の中でその有用性を強化し、CMCまたはRVFVおよびインフルエンザBウイルスの両方のための液体オーバーレイのいずれかよりも高い力価で、より明確なプラークを示した。大幅に固体プラグと簡素化染色を除去する際に支援アガロースの低い最終濃度を用いて。 CMCは、全体のPを実証したインフルエンザBウイルスのために非常に小さく、不明瞭なプラークをテストし、作成されたすべての3つのウイルスのためのオーバーレイとしてoorest効能。全体的なCMCは、少なくとも所望の特性を実証したが、それは力価の最小限の減少に伴ってプラークサイズを減らすために行ったように見える、急速に成長し、非常に毒性の強いウイルスでのその使用は、有利なことを証明できた。液体オーバーレイは、使いやすさを増加させ、製造するのが極めて簡単だったという点で、最も汎用性であることが証明され、そして選択されたウイルスのすべてにわたってアガロースと同等であった。より高いスループット、96ウェルプレート形式で、アプリケーションおよび除去は、従来のオーバーレイとしてによる凝固に阻害し、正確で一貫した結果が得られていなかった。プレートは以前に特徴付け複製動態を有するウイルスには、この適応を制限する、コレクションのポイントまで移動することができないような液体オーバーレイを使用した対価は不透明着色およびプラーク形成をモニターすることができないことにある。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;プラークアッセイ条件のマイナー修正が大幅に結果を変更することができ、そして、新しいシステムや技術の評価と性能が常に保証されています。最適化され、標準化されたプラークアッセイプロトコルは、すべての状況が存在しない一方で、ユーザの変更のための十分な背景を提供しながら、我々の報告は、従来と同様にプラークアッセイのための新規な液体オーバーレイで汎用性と使いやすさを実証する。

実行可​​能なウイルスサンプルの正確な分離および定量は、一貫してウイルス学における進行中の研究の目標であった。これは、定量的かつ定性的に動物ウイルス力価を計算するための手段は、第1 1,2を開発したことを1952年にプラークアッセイの出現までではなかった。この技術は、まず、以前に植物生物学1,2の株式バクテリオファージの力価を計算するために使用されたファージアッセイから適合および改変した。ウイルスの定量化のための別の手段は、例えば、イムノアッセイ、蛍光および透過型電子顕微鏡、調整可能な抵抗パルス検出（TRPS）として開発され、適応されているので、一方で、フローサイトメトリー、組換えレポーターシステム、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）これらの方法は、複製コンピテントウイルス粒子1,3を同定および定量することができない。技術および技法の進歩は、景観を洗練して変更していきながら、 plaquEアッセイは、感染溶菌ビリオン1,4のためのウイルスの濃度を決定する際に金本位制を表現し続けています。 プラークアッセイの間、宿主細胞のコンフルエントな単層を連続5-100ビリオンの間、典型的には、カウント可能な範囲まで希釈された未知の濃度の溶解性ウイルスに感染している。感染した単層は、その後無差別にウイルス増殖中に液体媒体の機械的または対流の流れのいずれかを介して広がるウイルス感染を防止するために、固定化重層培地で覆われている。アガロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（CMC）などの固体または半固体オーバーレイは、伝統的に使用されてきたが、液体オーバーレイは、アビセル5~7新規な液体オーバーレイの発展にますます魅力的な代替となっている。オーバーレイすることができるように、従来のオーバーレイに対する液利用プラークアッセイは、APPLいくつかの利点を有する室温でIED、およびアプリケーションと除去が非常に容易である。液体オーバーレイが温暖化を必要としないように、繊細で熱に不安定なウイルスもプラークに簡単に証明することがあります。 固定化オーバーレイ、個々のプラーク、または細胞死のゾーンの最初の感染やアプリケーションの後、ウイル​​ス感染および複製が周囲の単層に拘束されるように開発するために開始されます。感染した細胞はさらに、ますますはっきりと離散斑で、その結果、感染を伝播する、複製溶菌感染サイクルを継続していきます。使用されるウイルスの増殖動態および宿主細胞に応じて、目に見えるプラー​​クは通常2-14日以内に形成される。細胞の単層を、容易に肉眼でプラークを同定するために、標準的な明視野顕微鏡を用いて計数すること、またはより典型的には、ニュートラルレッドまたは暴力的な結晶によって固定され、対比できる。利用可能なプラークカウンターステイン多種多様な各オファリング番目があるEIR特定の長所と短所。クリスタルバイオレットは、典型的には、混合形態が存在する場合に、非常に小さいプラークの同定を可能にする迅速かつ明確な対比染色を提供し、収集の時点で、オーバーレイの固定/除去後に添加される。ニュートラルレッドは、未知のウイルスまたは複製動態を操作するときに特に有用であるプラーク形成を発症するライブ監視を可能にする、早期適用オーバーレイと常に接触す​​るという利点を有する。我々は、しかし、染色は一般的にニュートラルレッドを使用する場合と区別できないことを見出した。黄色の染料汚れが細胞濃い青とウイルスプラークとしてオーバーレイを除去せずにカウントすることができる生きているように、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）は、いくつかの利点を提供ニュートラルレッドで。 MTTによって与えられる生細胞と死細胞との間の高いコントラストも早い時点感染後の小さなプラークの検出を可能にする、ストレージは依然としてオーバーレイ8の除去を必要とするだろうが。クリスタルバイオレットは、単に水とアルコールの溶液中で行われ、混合プラーク形態のための高感度を提供することができるようなプロトコルは、我々は、ウェルのいくつかのファミリーを利用していることが実証のために、我々は、好適な単純化対比染色としてそれを選択したウイルスを特徴とする。 感染した細胞の単層を固定し、染色した後、プラークをミリリットル当たりのプラーク形成単位（pfu）の点でウイルスストック試料を滴定するためにカウントされる。ログ降下が基準として用い、陰性対照と、カウント5-100プラーク間で連続希釈して、プレートのサイズに応じて、間に留意すべきである。統計的にサンプルは、比較サンプルが3を複製する際にカウントごとに100のプラークを10％によって異なります。ウイルス力価を決定するために、プラークアッセイを使用することの利点は、wが感染性ウイルス粒子の実際の数を定量する能力であるサンプルをithin。複数のビリオンは、潜在的に単一の細胞に感染することができるように、ビリオンに対するユニットの用語は、プラーク滴定1,2の間に使用される。 プラーク形態は、異なる成長条件下およびウイルス種間で劇的に変化することができる。彼らは問題のウイルスの増殖と病原性因子に関​​する貴重な情報を提供することができますように、プラークサイズ、透明度、枠線の定義、および配布はすべて、注意すべきである。 基本的なプラークアッセイの原理は、適応され、フォーカス形成アッセイ（FFAは）の使用などの異なる多くの方法で修飾することができる。 FFAは、プラーク形成を検出するために細胞溶解および対比染色に頼るのではなく、直接的にタグ付けされた抗体を介して細胞内のウイルスタンパク質を検出するための技術を免疫染色を使用しない。感度を増加させ、感染後のインキュベーション時間を減少させ、そして最も重要な非溶解性ウイルスを定量する能力は、すべて異なっている利点のFFAを採用。広く使用されている一方で、伝統的なプラークアッセイに対するFFAの中で重要な制限要因は、適切な抗体の必要性と実際の感染ビリオン4対ウイルスタンパク質サブユニットのための唯一のプローブ能力にある。 本研究の目的のために、我々は古典的なプラークアッセイに議論を限定し、新規の液体の微結晶性セルロースオーバーレイと共に、伝統的な固体および半固体オーバーレイ（アガロースおよびCMC）の使用を記載している。

<table><tbody><tr><td>6-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>12-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml deep well plate</td><td>USA Scientific</td><td>C15046314</td><td>For serial dilutions</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112 013 101</td><td>Cell Media/Diluent</td></tr><tr><td>2x EMEM for plaques</td><td>Quality Biologicals</td><td>115 073 101</td><td>Warm to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>MEM 100x&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Heat inactivate before use at 62 &amp;#176;C for 30 min</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denatured Reagent Grade</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Shake vigorously when reconsitiuting&amp;nbsp; for &gt;30 min to homogenize</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

プラークアッセイは、細胞培養における離散プラーク（感染単位と携帯デッドゾーン）の計数を通じて感染ビリオンおよび抗ウイルス物質の直接的な定量化のための最も正確な方法の一つ残っている。ここでは、基本的なプラークアッセイを実行する方法を実証し、そして異なるオーバーレイや技術がプラーク形成および生産にどのような影響を与えるか。典型的には、例えば、アガロース、またはカルボキシメチルセルロースなどの固体または半固体オーバーレイ基板は、液体増殖培地を通して無差別感染の予防、ウイルスの拡散を制限するために使用されている。固定化されたオーバーレイは、離散可算病巣とその後のプラーク形成の形成を可能にする、すぐに周囲の単層にセルラー感染を制限する。従来のオーバーレイを使用することに固有の困難を克服するために、微結晶セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを用いた新規な液体オーバーレイはますます標準で代替として使用されているプラークアッセイ。液体オーバーレイプラークアッセイは、容易に伝統的な技術に従って、標準的な6または12ウェルプレートフォーマットのどちらかで行われ、特別な機器を必要とすることはできません。 、その液体状態およびアプリケーションおよび除去のその後の容易さ、ミクロプレートフォーマットは、代替的に大規模なウイルスの滴定に、迅速、正確かつ高スループットの代替として利用することができる。非加熱粘性液体ポリマーの使用は、作業を合理化する機会を提供する試薬、インキュベータースペース、無試薬加熱やガラス製品などの伝統的な、または高封じ込めラボで使用される操作上の安全性が必要とされる増加を節約します。液体オーバーレイは、特定の熱不安定ウイルスの伝統的なオーバーレイよりも高感度を証明することができる。

正確にウイルス力価を評価するためのプラークアッセイの能力は、多くの因子に依存する：細胞およびウイルスの生存に適切な宿主細胞の選択、適切な培地および増殖条件、固定化されたウイルスの伝播および別個のための十分な時間を可能にするウイルスの潜伏期間を正確に決定するそして可算プラーク形成。 サンプルタイプが異なる横切っオーバーレイ選択、インキュベーション期間、およびプラーク形態：この研究では、3つの代表的なファミリーからのウイルスは、違いを示すために選択した。ベネズエラウマ脳炎（VEEV）は馬の種およびヒトにおける重大な疾患を引き起こし、トガウイルスファミリーを表しことができ、（+）のssRNAウイルスのモデルとして選ばれました。インフルエンザB台湾株、セグメント化された（ - ）主に人間に感染するのssRNAウイルスは、オルトミクソウイルス科を表します。リフトバレー熱ウイルス（RVFV）、（ - ）主に節足動物に感染するのssRNA節足動物生まれウイルス、反芻動物と人間は、ブニヤウイルス科の代表として選ばれました。 RVFV（ 図1）のために、力価は、72時間後の感染のために並んでインキュベートしたCMC、アガロース、またはアビセルオーバーレイを利用して12ウェルプレートフォーマットにおけるRVFVの組換え生弱毒MP12株のストック溶液から決定した（HPI）。 10 -4から10 -7までの範囲の希釈物CMC及びアガロースオーバーレイを使用して、パネルA.プラークで見られる示す代表的なプレートを、明確に定義された円形の境界線と、小さな明確かつ明瞭なプラークを示した。液体オーバーレイプラークはもう少し豊富アガロースおよびCMCプラークに比べて大きかった、あまり明確な境界線を提供する。ウイルス力価は比較的実行オーバーレイの全てをパネルBに比較した。 reproducを決定するために、より大きなサンプルサイズと共にMP12のためのオーバーレイの中で明確に視覚的な比較を得るためにIBILITYは、6ウェルプレートも、三重（ 図2）でトライアルが行われました。 6ウェルプレート形式で、CMCオーバーレイの使用は、互いに大きさが同程度であったアガロースまたは液体のいずれかのオーバーレイよりも小さいプラークを示した。ウイルス力価は、3つのすべてのオーバーレイ（パネルD）との間で類似していたが、アガロースおよび液体オーバーレイに形成されたプラークは、それらのサイズの増加にカウントするように容易に証明した。 著しく変化した（ 図3A）が異なるオーバーレイの中RVFV、VEEV力価およびプラーク形態とは対照的である。プラークサイズおよび感度（パネルB）を犠牲にして、12ウェルプレートフォーマットを使用した場合CMCオーバーレイに形成されたプラークを明確かつ明瞭な形態を示した。 CMCとは対照的に、アガロースおよび液体オーバーレイの使用は、より低いウイルス阻害及びVEEV複製に対する感受性の増加を示し、有意に大きいプラークをもたらした。もっぱらapに、CMCに対するアガロースを比較した場合これは、以前に確認されたフアレスらによって公表APER。4。アガロースおよび液体オーバーレイがCMCよりも大きいプラークを生成しながら、プラークが不十分境界線を定義し、液体オーバーレイが最大の国境拡散を提供するとともに、12ウェルフォーマットでカウントすることは困難でしたていた。プラークを6ウェルプレート（ 図4）にトライアルが行われた場合には、より大きな6ウェルフォーマットの面でCMCオーバーレイに優れた証明アガロースで、12ウェルフォーマットで区別することが困難であった明白大きなプラークと液体オーバーレイの問題をネゲート敏感にプラーク定義と（ 図4D）。 プラーク形成時RVFVまたはVEEVと比較して、インフルエンザは、外部プロテアーゼの要件として、いくつかのユニークな課題を提供します。アガロースのブランドが異なると同じくらいマイナーな修正がなけれ持っているときに有意の変化が注目されているように、異なるオーバーレイ選択にインフルエンザウイルスの感度もよく、過去に報告されているenが9を使用していました。 興味深いことにインフルエンザB台湾株について、オーバーレイとして、CMCの使用はカウントが困難であったと（ 図5A）、確実に得点することが困難であることがわかっ著しく小さいプラークをもたらした。アガロースオーバーレイの使用は最善のプラーク（パネルC）を提供し、そして（おそらく増加により、単層の生存率への）暗い背景汚れが生じ、液体オーバーレイ（パネルBの使用を直接比較して鮮明でシャープなプラークを示した）。 例えば、アガロースおよびCMCなどの固体及び半固体オーバーレイオーバー液体ポリマーの明確な利点は、除去とアプリケーションの容易さにある。半固体オーバーレイは、加熱を必要とし、取り扱いおよび削除するときに凝固が問題に証明することができます。これらの利点を活用し、RVFVのためのハイスループット様式でアビセルを利用する実用性を決定するために、96ウェルプレートフォーマットは、様々なオーバーレイconcentratiでトライアルが行われたアドオン（ 図6）。 RVFV MP-12の場合、希釈は、アビセルの両方0.6と1.2％の最終濃度で4回行った。レプリケート間または濃度の間に明らかな違いは高い再現性を実証し、指摘しないとオーバーレイ適用および除去は、単純な証明した。得点すると、プラークがRVFVのための高スループットな方法で液体オーバーレイを利用の実現可能性を実証し、肉眼ではっきりと可算だった。 <img alt="図1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> 図1：RVFVプラークオーバーレイ比較は12ウェルプレートを利用 Verosを12ウェルプレート中に2.5×10 5細胞で播種し、MP12の同じ段階希釈した試料を用いて出発200μlで感染させた。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％のCMC（最終Cの1.5ミリリットルオーバーレイoncentrations）、パネルBで計数し、力価測定したパネルA.プラークに示されているように、直接オーバーレイを比較するために適用した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> 図2：6ウェルプレートを利用しRVFVプラークオーバーレイ比較は Verosは6ウェルプレート中に5×10 5細胞で播種し、MP12の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して400μlの感染させた。パネルACについて記載したようにパネルAに示されているように、0.3％アガロース3mlのオーバーレイ、0.6％アビセル、または1％CMCは、直接オーバーレイを比較するために適用された、BおよびC.個別の実験はして、同じように実施したプラークを計数し、パネルD（N = 3）で力価測定。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> 図3：&lt;12ウェルプレートを用いて強い&gt; VEEVプラークオーバーレイ比較。Verosは、12ウェルプレート中で2.5×10 5細胞で播種し、VEEV TC-83ワクチン株の同じ段階希釈し、出発試料を用いて200μlの感染させた。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％CMC 1.5mlのオーバーレイ、パネルA.プラークに示されているように、直接オーバーレイを比較するために適用されたパネルBにカウントし、力価測定した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> 図4：V EEVプラークオーバーレイ比較は6ウェルプレートを利用 Verosは6ウェルプレート中に5×10 5細胞で播種し、VEEV TC-83の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して400μlの感染させた。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％CMC、3mlのオーバーレイが示されているように、直接オーバーレイを比較するために適用されたプラークは、パネルDにおいて計数し、力価測定して、C（N = 3） - パネルAで、BおよびC.個別の実験は、パネルAについて記載した同一のように行った。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> 図5：インフルエンザプラークオーバーレイ比較 MDCK細胞を6ウェルプレートに5×10 5細胞で播種し、インフルエンザB台湾の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して接種物を400μlに感染させた。 FBSは、ウイルス融合に必要とされる特定のプロテアーゼの阻害を介してインフルエンザの伝播を阻害することができるようになし、ウシ胎児血清（FBS）は、増殖培地またはオーバーレイに使用しなかった。 TPCKトリプシンは、宿主細胞とウイルスの融合および侵入を容易にするために、適用前にオーバーレイのすべてに添加した。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％CMC 3mlのオーバーレイを直接比較するために適用されたC、パネルDで計数し、力価測定プラークと（N = 3） - パネルAに記載のようにパネルA、BおよびC.独立した実験で実証されるようにオーバーレイが同一に実施した。平均値は、CMCプラークのために採取されたが、彼らは、拡散境界線と非常に小さいプラークサイズを実証したように、確実にカウントするために困難であることが判明。 <img alt="図6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> 図6：。ハイスループットプラークオーバーレイ Verosの96ウェルプレートは、ウェルあたり3×10 4細胞で播種、四重に、1時間RVFV MP12の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して接種物50μlの感染させた。オーバーレイについては、アビセル、0.6および1.2％の最終濃度は、ハイスループット様式、パネルAおよびB内の液体オーバーレイを利用することの実現可能性および再現性を決定するために、トライアルが行われた。。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td>インフルエンザB </td></tr><tr><td>細胞型</td><td>ベロ</td><td>ベロ</td><td> MDCK </td></tr><tr><td>感染期間</td><td> 1時間</td><td> 1時間</td><td> 45分</td></tr><tr><td>インキュベーション時間</td><td> 3日間</td><td> 2日</td><td> 3日間</td></tr></tbody></table> 表1：プラークアッセイ接種条件および細胞型 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td>インフルエンザB </td></tr><tr><td>細胞型</td><td>ベロ</td><td>ベロ</td><td> MDCK </td></tr><tr><td>成長型</td><td> DMEM中1 </td><td> DMEM中1 </td><td> DMEM中2 </td></tr><tr><td>プラークメディア</td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1.ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％L-グルタミン、1％Penicllin /ストレプトマイシンを補充した。 2.ダルベッコ改変イーグル培地、1％L-グルタミン、1％Penicllin /ストレプトマイシン、0.2％ウシ血清アルブミン、0.025％HEPES、DEAEデキストラン50ugの/ mlを補充した。 5％FBS（25ml）に溶解し、1％の最小必須アミノ酸（5ml）中、1％ピルビン酸ナトリウム（5ml）を、1％のL-グルタミン（5 ml）を補充した2×A.最小必須培地（500ml）に、 2％ペニシリン/ストレプトマイシン（10ml）で。 0.2％ウシ血清アルブミンを補充した2×B.最小必須培地（500ml）を、1％の最小必須アミノ酸（5ml）に、50ugの/ mlの0.025％HEPES、DEAEデキストラン、トリプシンTPCK * *準備の直前には、25あたり1μlを添加するあなたはプラークアガロースと混合するために使用する分量にTPCKトリプシンの2μg/ mlのストック溶液。 表2：プラークおよびウイルス/細胞増殖Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td>インフルエンザB </td></tr><tr><td>細胞型</td><td>ベロ</td><td>ベロ</td><td> MDCK </td></tr><tr><td>感染期間</td><td> 1時間</td><td> 1時間</td><td> 45分</td></tr><tr><td>インキュベーション時間</td><td> 3日間</td><td> 2日</td><td> 3日間</td></tr></tbody></table>限り無菌性が維持されるように作ったとき、オーバーレイソリューションは期限切れになりません。 表3：オーバーレイ証券 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6ウェル</td><td> 12ウェル</td><td> 96ウェル</td></tr><tr><td>細胞の＃/ウェル</td><td> 5×10 5 </td><td> 2.5×10 5 </td><td> 3×10 4 </td></tr><tr><td>接種の容量（μL） </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td>オーバーレイの容量（ml） </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> 表4：プレートフォーマット

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

プラークアッセイを通じてウイルス濃度の測定：伝統と新しいオーバーレイシステムの使用

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

111.6K ビュー.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

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Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

マウスノロウイルスのプラークアッセイ

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

免疫・感染学

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

無菌実験技術：めっき法

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

生物学

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

世代、増幅、および組換え呼吸器合胞体ウイルスの滴定

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

単純ヘルペスウイルスのプラーキング

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

ウイルス増殖と細胞ベースの比色定量

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

プラークアッセイ:プラーク形成単位(PFU)としてウイルス定数を決定する方法

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

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Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

Source: Yadavalli, T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62195">Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

プラークアッセイによる治験薬の抗ウイルス効果の判断

1. Virus infection quantification
NOTE: Virus titers from porcine corneas should be evaluated every day to analyze the effect of drug treatment.

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特殊なアッセイ

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

Source: Tai, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53124">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a viral attachment assay for screening antiviral compounds. Using genetically modified hepatitis C virus and luciferase, it assesses inhibitory effects on viral attachment, as indicated by lower light intensity in co-treated wells compared to wells treated with the virus alone.

抗ウイルス化合物のスクリーニングのためのウイルス付着アッセイ

NOTE: Ensure that all procedures involving cell culture and virus infection are conducted in certified biosafety hoods that are appropriate for the ...