We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. إعداد الخلايا والكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم قبل الفحص، لوحة الخلايا المضيفة المناسبة للفيروس في السؤال (الجدول 1 و 2) بنسبة 90 - 100٪ confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول التثبيت الفورمالين 10٪ في DH 2 O. في المثال، مزيج 5.56 مل من 36٪ مع الأسهم الفورمالديهايد 14.44 مل المقطر H 2 O (DH 2 O). ملاحظة: استخدام ممارسات التعامل الآمن المناسبة والتهوية عند استخدام الفورمالدهايد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكريستال البنفسجي وصمة عار: 1٪ كريستال فيوليت (CV) في 20٪ من الإيثانول ودرهم 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام وحة 2X (نوع من الخلايا تعتمد على تركيز 2X؛ انظر الجدول 2). تصفية باستخدام فلتر 0.2 ميكرون إن وجدت الكواشف ليست عقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تراكب شل حركة (الجدول 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتراكب السائلة، وجعل العقيمة حل 2.4٪ من Avicel في DH 2 O. لمنع تراكمها، إضافة إلى مسحوق قارورة تحتوي على الماء والعشرينفي الاختلاط بسرعة مع شريط ضجة، صب في Avicel ببطء ويقلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة (RT). عندما يثبت الحل لزج جدا بالنسبة بقضيب إلى التجانس، والتحول إلى شاكر قارورة ل&gt; 30 دقيقة مع الإثارة الثقيل لضمان حتى التجانس. ويمكن إجراء الحلول المالية بتركيزات أقل، ولكن الحلول يمكن أن تنفصل، وسوف تحتاج إلى ريمكس لضمان التجانس: ملاحظة. حلول العمل من Avicel يمكن استخدامها تتراوح 0،6-3٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجانس، الأوتوكلاف الحل وتخزين مختومة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للالاغاروز وكاربوكسيميثيل السليلوز (CMC) تراكب، وإعداد محلول المخزون في DH 2 O 2٪ CMC أو 0.6٪ الاغاروز. خلط مع بقضيب والأوتوكلاف أو الميكروويف لجلب إلى حل. </li></ol></li></ol> 2. التخفيفات والعدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يوم من الطلاء، والتحقق بصريا confluency وقابلية الخلايا قبل بدء الفحص. ضمان قياسي الخلوي التشكل والثانية و~ 90٪ متموجة أحادي الطبقة موجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء التخفيف التسلسلي عشرة أضعاف من العينات المعدية. استخدام وسائط النمو الخلوي لانتشار فيروسي مثل مخفف (الجدول 2). تختلف عدد التخفيفات المطلوبة على أساس عيار المتوقع للفيروس المذكور، ودائما استخدام العينة الضابطة غير المصابة بشكل مستقل لضمان استمرارية الخلوية والمساعدة في تحديد هوية اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من التخفيفات التسلسلية، تصيب الخلايا لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة (الجدول 1). استخدام كمية كافية من اللقاح لتغطية الخلايا، مع الحفاظ على وحدة التخزين عند أدنى مستوى ممكن لتحقيق أقصى قدر من الاتصال الفيروسي مع أحادي الطبقة (الجدول 4). لوحات الروك بلطف كل 20 دقيقة حتى لضمان التغطية ومنع أحادي الطبقة الخلوية من التجفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإصابة، تراكب حجم مناسب من شل حركة المتوسطة مباشرة إلى اللقاح في البئر (الجدول 2) باستخدام 1: 1 مزيج من وسائل الاعلام وحة 2X وimmobilizتراكب الاختيار جي (CMC، الاغاروز أو Avicel). صخرة بلطف لمزج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتراكب السائلة، خلط 1: 1 مع درجة حرارة سائل الإعلام وحة 2X و1،2-2،4٪ الأسهم RT Avicel للحصول على حل العاملة من 0.6-1.2٪ Avicel تراكب المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتراكب الاغاروز، واستخدام 1: 1 خليط من وسائل الاعلام وحة 2X تحسنت وحل الأسهم ساخنة من 0.6٪ الاغاروز، مكان في 56 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة لكي تتوازن درجة الحرارة الحصول النهائي تركيز الاغاروز / تراكب 0.3 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لCMC، إعداد محلول المخزون 2٪ وعلاج كما هو موضح في تراكب الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند تطبيق تراكب لأحادي الطبقة، تتوازن دائما الاغاروز ساخنة أو CMC في 56 ° C المياه لمنع الأضرار التي لحقت أحادي الطبقة. ضمان الحل هو دافئ، ولكن ليس الساخن لمسة لمنع موت الخلايا وتقليل التتر الفيروسية. وسوف تبدأ معظم تراكب الاغاروز لترسيخ دون 42 درجة مئوية، ويعمل بسرعة و / أو إعداد دفعات صغيرة لمنع تصلب أثناء التعامل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إضافة تراكب، واحتضان لوحات لانتاج اللوحات المتميزة التي هي بوضوح معدودة. تشكيل لوحة يمكن أن يستغرق 2-14 أيام تبعا للفيروس التي يجري تحليلها، الجدول 1. ملاحظة: عندما يتم وضع لوحات مضافين السائلة في الحاضنة، لا تتحرك لهم. وحركة تراكب السائلة خلال فترة الحضانة يؤدي إلى ويحات طخت. الاغاروز وتراكب CMC هي نصف صلبة ويمكن نقلها أو فحص دوري تحت المجهر الضوئي لمراقبة وضع اللوحة. </li></ol> 3. إصلاح الخلايا وتلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإصلاح الخلايا، صب قبالة أو نضح تراكب Avicel، وإصلاح الخلايا باستخدام محلول الفورمالديهايد بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة ليلة وضحاها (&lt;1 مل لكل بئر لمدة 6 لوحة جيدا). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالاغاروز أو CMC، إضافة محلول الفورمالديهايد مباشرة إلى تراكب لمدة 1 ساعة ليلة وضحاها. ملاحظة: يمكن أن تظل عينات لفترات طويلة من الزمن في تثبيتي، بشرط أن تفعللا تتبخر وتجف وهذا يمكن أن تشوه أحادي الطبقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تلطيخ وبعد التثبيت، تجاهل الفورمالديهايد وإزالة شمعات نصف صلبة للالاغاروز وCMC مع أي مياه جارية أو يدويا مع ملعقة. شطف ويحات Avicel بالماء لإزالة بقايا تراكب / تثبيتي قبل تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتلطيخ، وتغطي الخلايا مع الحد الأدنى من الكريستال البنفسجي حل ل~ 15 دقيقة. لوحات صخرية إذا لزم الأمر لضمان حتى التغطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بلطف وصمة عار الكريستال البنفسجي بالماء. مرة واحدة ثابتة، والملون، وتجفيفها وتخزينها لويحات إلى أجل غير مسمى لتحليل المستقبل. </li></ol> 4. تحديد التتر الفيروسية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد لويحات في كل بئر، مع متوسط ​​مكررات أي تقنية من نفس التخفيف. لتنسيقات لوحة كبيرة والآبار خصم مع أقل من 5 أو أكثر من 100 لوحات. يحيط علما حجم اللوحة والتشكل. يجب أن يكون الشاهد السلبي أحادي الطبقة موحدة ويمكن استخدامه كجهاز تحكم المرجعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عيار الفيروسية من العينة الأسهم عن طريق أخذ متوسط ​​عدد لويحات لتخفيف ومعكوس عامل التخفيف الكلي. </li></ol><img alt="المعادلة 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> ملاحظة: وعلى سبيل المثال، 30 و 32 لويحات أحصت لمكررات من 1 × 10 -7 التخفيف [31 (المتوسط) / 10 -7 (التخفيف) × 0.4 مل (اللقاح)] أن تسفر عن عيار 7.75 × 10 8 PFU / مل.

<ol>
	<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li><li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses.">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li><li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses.">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li><li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays.">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , (2011).</li><li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technically+simple+&#8216;non-lethal&#8217;+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays.">A technically simple &#8216;non-lethal&#8217; vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells.">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li><li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata,+Japan,+in+2004+and+2005.">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li><li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication.">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li><li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production.">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>B&#246;ttcher-Friebertsh&#228;user, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

العامل الأكثر أهمية لفحص اللوحة الناجح يكمن في تعظيم الاستفادة من بروتوكول للثقافة فيروسية معينة في السؤال عن الظروف يمكن أن تختلف بشكل كبير. النقاط الرئيسية لتأخذ في الاعتبار هي: استضافة التوافق الخلوي مع الفيروس في السؤال، وظروف النمو المناسبة الفيروسية، نطاقات تخفيف كافية من أجل التفريق بوضوح لويحات، واختيار تراكب الصحيحة وتلطيخ للخلايا وفيروس المعنية. بينما VEEV وRVFV كلا تنمو في ظل ظروف مشابهة جدا استخدام العديد من نفس أنواع الخلايا المضيفة، والاختلافات في البلاك التشكل والنمو حركية تختلف بشكل كبير. عند استخدام خلايا فيرو لفحوصات لوحة، والتي جرت العادة على استخدامها كخط خلية نشر ومؤشر للحمى النزفية الفيروسات وalphaviruses، VEEV ينمو عادة إلى التتر أعلى من RVFV ويوضح زيادة حركية تكرار وتطوير لويحات كبيرة موحدة في 48 HPI 4، 10-12. وعلى النقيض من VEEV، يتطلب RVFV 72 HPI ويبين اللوحات التي عادة ما تكون أصغر بكثير في الحجم ومتغير. في المعارضة لRVFV وVEEV، فيروس الانفلونزا هو غاية الخلية المضيفة محددة، ويمكن أن يكون من الصعب نشر من خلال زراعة الأنسجة. لفيروس الإنفلونزا، وبدأ دخول الفيروس والانصهار عادة عن طريق ربط مستقبلات سطح الخلية التي تحتوي على بروتين سكري hamagglutinin الفيروسية (HA)، التي تتوسط الدخول إلى الخلية المستهدفة من خلال الربط مع α اللعابي مستقبلات حمض سطح الخلية المضيفة. ها هو بروتين سكري مثلوثي التي هي موجودة في الغشاء المغلف للجميع فيروسات الأنفلونزا ويتطلب الانقسام في HA1 مفارز وHA2 من قبل البروتيني الخلية المضيفة محددة. لمزيد من تعقيد المسألة، يمكن لهذه المواقع انشقاق في كثير من الأحيان تختلف بين سلالات فيروسية 13. كتعبير عن البروتياز القادرة على الشق HA يقتصر على أنسجة معينة، البروتياز عه غالبا ما تضاف إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية من أجل تسهيل اندماج فيروسي ودخول الخلية المضيفة اختيار 13. TPCK-التربسين هو مثال واحد من البروتيني المستخدمة عادة يستخدم في زراعة الخلايا مع كل MDCK وخلايا فيرو: تسهيل النسخ المتعددة دورة (في غياب أي التربسين تعطيل المصل) من خلال تنشيط بروتين من فيروس HA 14،15. كما هو موضح في هذه الدراسة وغيرها، يمكن أن الاختلافات في دورات الحياة الفيروسية تؤثر اختيارات تراكب، صيغ لوحة، وأوقات جمع، مع الفروق الكبيرة بين الطبقات المختلفة وأنواع من الفيروسات. في دراستنا، أظهرت تراكب الاغاروز ويحات أكثر وضوحا في التتر أعلى من أي CMC أو تراكب السائلة لكلا RVFV وفيروس الأنفلونزا B، يعزز فائدتها من بين مجموعة واسعة من الفيروسات وأنواع الخلايا. باستخدام تركيز النهائي انخفاض الاغاروز ساعد الى حد كبير في إزالة شمعات الصلبة وتلطيخ مبسط. أظهرت CMC عموما عoorest فعالية كإضافة لجميع الفيروسات الثلاثة اختبارها وإنتاجها لويحات صغيرة جدا وغير واضحة لفيروس الأنفلونزا (ب). على الرغم من أن مجمل CMC أثبت أقل الخصائص المرغوبة، واستخدامه في النمو السريع للغاية وفيروسات خبيثة قد تثبت فائدة، كما فعلت يبدو لتقليل حجم الترسبات مع وجود انخفاض في الحد الأدنى من عيار. أثبت تراكب السائل أن تكون أكثر تنوعا من حيث أنها كانت بسيطة للغاية لإعداد، وزيادة سهولة الاستخدام، وكان تعادل الاغاروز عبر كافة الفيروسات المحدد. في شكل لوحة إنتاجية أعلى 96 بئرا، وتطبيق وإزالتها لم يكن مستعمل بسبب التصلب كما هو الحال مع تراكب التقليدية، وتقدم نتائج دقيقة ومتسقة. وهناك اعتبار عند استخدام تراكب السائلة يكمن في التلوين مبهمة وعدم القدرة على مراقبة تشكيل لوحة لا يمكن أن يتم نقل الصفائح حتى نقطة جمع، مما يحد هذا التكيف للفيروسات مع حركية تكرار تتميز سابقا. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; تعديلات طفيفة في ظروف فحص اللوحة يمكن أن يغير بشكل كبير على النتائج، وهناك ما يبرر دائما تقييم وأداء أي نظام جديد أو تقنية. في حين لا وجود بروتوكول فحص اللوحة الأمثل وموحد لكل حالة، تقريرنا يظهر براعة وسهولة الاستخدام في التقليدية، فضلا عن تراكب سائل جديدة لفحوصات لوحة، في الوقت الذي توفر خلفية كافية لمزيد من التعديلات المستخدم.

وقد تم عزل دقيقة والكمي للعينات فيروسية قابلة للحياة على الدوام هدفا البحوث الجارية في علم الفيروسات. لم يكن حتى مجيء فحص اللوحة في عام 1952 أن وسيلة للكميا ونوعيا حساب التتر الفيروسية الحيوانية وقد تم تطوير أول 1،2. وقد تم تكييف هذه التقنية لأول مرة وتعديلها من المقايسات فج، والتي سبق استخدامها لحساب التتر من البكتيريا الأسهم في بيولوجيا النبات 1،2. في حين أن وسائل بديلة للالكمي الفيروسي ومنذ ذلك الحين تم تطويرها وتكييفها، مثل المناعية، ومضان المجهر الإلكتروني انتقال، الانضباطي استشعار مقاوم النبض (الحزب الراديكالي عبر الوطني)، التدفق الخلوي، وأنظمة مراسل المؤتلف، والعكس الكمي سلسلة البوليميراز رد فعل النسخ (QRT-PCR) ، تفشل هذه الأساليب لتحديد وquantitate تكرار virons المختصة 1،3. بينما تستمر التقدم في التكنولوجيات والتقنيات لتحسين وتغيير المناظر الطبيعية؛ plaquتستمر المقايسات البريد لتمثيل معيار الذهب في تحديد تركيزات الفيروسية المعدية للvirons التحللي 1،4. خلال فحص اللوحة، مصاب أحادي الطبقة متموجة من الخلايا المضيفة مع فيروس التحللي من تركيز معروف الذي تم تخفيفه بشكل متسلسل لمجموعة معدود، وعادة ما بين 5-100 virions. ثم يتم تغطية الطبقات الوحيدة المصابة مع وسيلة تراكب مستوقف لمنع العدوى من الانتشار الفيروسي بشكل عشوائي إما من خلال تدفق الميكانيكية أو التضاريسية للوسط السائل خلال انتشار الفيروس. في حين تراكب صلبة أو نصف صلبة مثل الاغاروز، السليلوز الميثيل أو كاربوكسيميثيل السليلوز (CMC) وقد جرت العادة على استخدامها، أصبحت تراكب السائل بديلا جذابا بشكل متزايد مع تطور تراكب سائل جديدة مثل Avicel 5- 7. المقايسات البلاك باستخدام السائل مقابل تراكب التقليدية تتمتع بالعديد من المزايا مثل تراكب يمكن أن يكون تطبيق ورقةالعبوات الناسفة في درجة حرارة الغرفة، وتطبيق وإزالة أسهل بكثير. كما تراكب السائلة لا تحتاج الاحترار، قد الفيروسات عطوب الحرارة حساسة ويثبت أيضا أسهل لوحة. بعد الإصابة الأولية وتطبيق تراكب مستوقف، لويحات الفردية، أو مناطق من موت الخلايا، سوف تبدأ في تطوير مقيدة عدوى فيروسية كما والتكرار إلى أحادي الطبقة المحيطة بها. سوف تستمر الخلايا المصابة دورة النسخ المتماثل تحلل العدوى، مما يضخم العدوى، مما أدى لويحات متزايد متميزة ومنفصلة. اعتمادا على حركية النمو والخلايا الفيروسية المضيف المستخدمة، وتشكل لوحة مرئية عادة في غضون 2-14 أيام. يمكن بعد ذلك عد الطبقات الوحيدة الخلوية مع المجهر حقل مشرق القياسية، أو أكثر عادة ثابتة و counterstained بواسطة محايدة أحمر أو الكريستال العنيف من أجل تحديد بسهولة لويحات بالعين المجردة. هناك طائفة واسعة من البقع مكافحة البلاك المتاحة، كل تقدم والعشرينمجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو مزايا وعيوب محددة. وعادة ما يضاف الكريستال البنفسجي عند نقطة جمع وبعد تثبيت / إزالة تراكب، وتوفير وصمة عار المضادة السريعة والمتميزة التي تسمح بتحديد لويحات صغيرة جدا عندما التشكل المختلط الحالي. محايد الأحمر في الاستفادة من التطبيق المبكر واتصال دائم مع تراكب، والسماح للرصد المباشر لوضع تشكيل اللوحة، والتي هي مفيدة بشكل خاص عند التعامل مع الفيروس أو النسخ غير معروفة حركية. ومع ذلك فقد وجدنا أن تلطيخ عادة لا متميز كما عند استخدام أحمر محايد. 3- (4،5-dimethylthiazol-2-يل) نتروبلو بروميد -2،5-ثنائي الفينيل (الإنتقالي العسكري) ويقدم العديد من المزايا، مثل البقع الصفراء الصبغة الملونة خلايا يمكن الاعتماد ويحات زرقاء داكنة والفيروسية دون إزالة التراكب مثلما يعيش مع أحمر محايد. التباين الكبير بين الخلايا الحية والميتة التي يوفرها الإنتقالي العسكري أيضا يسمح للكشف عن لويحات صغيرة في وقت سابق إصابة آخر نقطة، على الرغم من أن التخزين لا تزال تتطلب إزالة تراكب 8. كما وضوح الشمس فوق البنفسجية يمكن أن يتم ببساطة في محلول من الماء والكحول، ويوفر درجة عالية من الحساسية لوحة التشكل مختلطة، اخترنا أنها مضادة المفضلة ومبسطة وصمة عار لبروتوكول تظاهر لأننا باستخدام عدة عائلات جيدا ومن أهم خصائص فيروسات. بعد تحديد وتلطيخ أحادي الطبقة الخلوية المصابة، يتم عدها لويحات من أجل عيار العينات الفيروسية الأسهم من حيث تشكيل وحدات لوحة (PFU) في الملليمتر الواحد. وتجدر الإشارة إلى انخفاض سجل بين التخفيفات التسلسلية و، اعتمادا على حجم لوحة، بين 5-100 لويحات عدها، مع سيطرة سلبية استخدامها كمرجع. وتختلف عينات إحصائية بنسبة 10٪ لكل 100 ويحات تحسب عند مقارنة عينة يعيد 3. ميزة استخدام المقايسات لوحة لتحديد التتر الفيروسية تكمن في قدرتها ل quantitate العدد الفعلي من الجسيمات الفيروسية المعدية ثithin العينة. كما virions متعددة يحتمل أن تصيب خلية واحدة، يتم استخدام المصطلحات الوحدات مقابل virons خلال المعايرة البلاك 1،2. مورفولوجيا الترسبات يمكن أن تختلف بشكل كبير في ظل اختلاف ظروف النمو وبين الأنواع الفيروسية. وتجدر الإشارة إلى حجم كل لوحة، الوضوح، تعريف الحدود، والتوزيع لأنها يمكن أن توفر معلومات قيمة عن النمو وعوامل الفوعة للفيروس في السؤال. ويمكن أيضا المبادئ الأساسية فحص اللوحة تكييفها وتعديلها في عدد من الطرق المختلفة، مثل استخدام التركيز تشكيل المقايسات (FFAs). FFAs لا تعتمد على تحلل الخلايا وcounterstaining للكشف عن تشكيل لوحة، وإنما توظف تقنيات للكشف عن البروتينات الفيروسية داخل الخلايا مباشرة من خلال الأجسام المضادة المناعية ذات الكلمات الدلالية. زيادة الحساسية، وانخفضت مرة الحضانة بعد الإصابة، والأهم من ذلك القدرة ل quantitate الفيروسات غير التحللي كلها متميزةمزايا عندما توظف FFAs. في حين تستخدم على نطاق واسع، فإن العوامل التي تحد حاسمة في FFAs مقابل فحص اللوحة التقليدية تكمن في الحاجة إلى الأجسام المضادة المناسبة والقدرة على تحقيق الوحيد للمفارز البروتين الفيروسية المعدية الفعلية مقابل virons 4. لغرض هذه الدراسة، فإننا سوف تحد من مناقشتنا لفحوصات وحة الكلاسيكية ووصف استخدام أغطية صلبة ونصف صلبة التقليدية (الاغاروز وCMC)، جنبا إلى جنب مع رواية الجريزوفولفين السائل تراكب السليلوز.

<table><tbody><tr><td>6-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>12-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96-well CellStar plate for tissue culture</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml deep well plate</td><td>USA Scientific</td><td>C15046314</td><td>For serial dilutions</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112 013 101</td><td>Cell Media/Diluent</td></tr><tr><td>2x EMEM for plaques</td><td>Quality Biologicals</td><td>115 073 101</td><td>Warm to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>MEM 100x&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>Heat inactivate before use at 62 &amp;#176;C for 30 min</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denatured Reagent Grade</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BioPolymer USA</td><td>RC-591 NF</td><td>Shake vigorously when reconsitiuting&amp;nbsp; for &gt;30 min to homogenize</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

تبقى المقايسات البلاك إحدى الطرق الأكثر دقة لتقدير المباشر لvirons المعدية والمواد المضادة للفيروسات من خلال عد لويحات منفصلة (الوحدات المعدية والمناطق الميتة الخلوية) في زراعة الخلايا. نحن هنا لشرح كيفية إجراء فحص اللوحة الأساسية، وكيفية تراكب وأساليب متباينة يمكن أن تؤثر على تكوين البلاك والإنتاج. عادة ركائز صلبة أو نصف صلبة تراكب، مثل الاغاروز أو كاربوكسيميثيل السليلوز، وقد استخدمت لتقييد انتشار الفيروس ومنع العدوى من خلال العشوائي وسط النمو السائل. تراكب يجمد تقيد العدوى الخلوي لأحادي الطبقة المحيطة بها فورا، والسماح للتشكيل بؤر معدود منفصل وتشكيل لوحة لاحق. للتغلب على الصعوبات الكامنة في استخدام تراكب التقليدية، تراكب السائل رواية باستخدام السليلوز الجريزوفولفين والسليلوز carboxymethyl الصوديوم قد استخدمت على نحو متزايد كبديل في مستوىفحص اللوحة. السائلة المقايسات لوحة تراكب يمكن أن يؤديها بسهولة في أي معيار 6 أو 12 صيغ لوحة كذلك في الأساليب التقليدية، ويتطلب أي معدات خاصة. نظرا إلى حالته السائلة وسهولة اللاحقة من تطبيق وإزالتها، يمكن بدلا من ذلك أن تستخدم صيغ لوحة ثقافة صغرى كبديل الإنتاجية سريع ودقيق ورفيع إلى المعايرة الفيروسية نطاق أوسع. استخدام السائل اللزج ساخنة البوليمر عدم توفر الفرصة لتبسيط العمل، وتحافظ على الكواشف، الفضاء الحاضنة، وزيادة السلامة التشغيلية عند استخدامها في مختبرات الاحتواء التقليدية أو عالية كما لا التدفئة كاشف أو الأواني الزجاجية مطلوبة. تراكب السائلة قد تكون أيضا أكثر حساسية من تراكب التقليدية للحرارة بعض الفيروسات عطوب.

قدرة المقايسات البلاك إجراء تقييم دقيق التتر الفيروسية تعتمد على العديد من العوامل: اختيار الخلية المضيفة مناسبة، وسائل الإعلام المناسبة وظروف النمو للبقاء الخلوية والفيروسية، انتشار فيروسي يجمد، وتحديد دقيق للفترة حضانة الفيروس لإتاحة الوقت الكافي للمتميزين وتشكيل لوحة معدود. لهذه الدراسة، تم اختيار ثلاث عائلات من الفيروسات التمثيلية لإظهار الاختلافات في: اختيار تراكب، وفترات الحضانة، والتشكل عبر البلاك اختلاف أنواع العينة. وقد تم اختيار الفنزويلي التهاب الدماغ الخيلي (VEEV) كنموذج الفيروسي (+) ssRNA، الذي يمكن أن يسبب مرض كبير في أنواع الخيول والبشر ويمثل عائلة الفيروسات الطخائية. الإنفلونزا ب تايوان سلالة، وهي مجزأة (-) فيروس ssRNA إصابة البشر في المقام الأول، يمثل عائلة فيروسات مخاطية قويمة. فيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV)، وهي (-) المفصلية ssRNA ولد فيروس يصيب في المقام الأول المفصليات،الحيوانات المجترة والبشر اختير، بصفته ممثلا لعائلة الفيروسات البنياوية. لRVFV (الشكل 1)، تم تحديد التتر من محلول المخزون من سلالة الحي الموهن MP12 المؤتلف من RVFV في شكل 12 لوحة جيدا باستخدام CMC، الاغاروز، أو تراكب Avicel التي حضنت جنبا إلى جنب للعدوى بعد 72 ساعة (HPI). وهناك لوحة تمثيلية تظهر التخفيفات تتراوح بين 10 إلى 10 -4 -7 يمكن رؤيتها في لوحة A. اللوحات باستخدام CMC وأظهر تراكب الاغاروز ويحات صغيرة، واضحة، ومميزة مع الحدود دائرية واضحة المعالم. كانت لويحات مع تراكب السائل قليلا أكثر وفرة وأكبر بالمقارنة مع الاغاروز وويحات CMC، وفرت الحدود أقل متميز. وتمت مقارنة التتر الفيروسية في لوحة ب مع كل من تراكب أداء نسبيا. من أجل الحصول على المقارنة البصرية أكثر وضوحا بين تراكب لMP12 جنبا إلى جنب مع أكبر حجم العينة لتحديد reproducibility، تم محاكمتهم لوحة 6 جيدا أيضا في ثلاث نسخ (الشكل 2). في شكل لوحة 6 جيدا، وأظهر استخدام تراكب CMC ويحات أصغر من أي تراكب الاغاروز أو السائلة، والتي كانت مماثلة في الحجم لبعضها البعض. في حين أن التتر الفيروسية مماثلة بين جميع تراكب ثلاثة (لوحة D)، لويحات تشكلت في تراكب الاغاروز والسائلة أثبتت أسهل على الاعتماد بسبب زيادة حجمها. في تناقض مع RVFV، التتر VEEV ومورفولوجيا الترسبات بين تراكب مختلفة تفاوتت بشكل ملحوظ (الشكل 3A). وأظهرت اللوحات التي تشكلت في تراكب CMC مورفولوجيا واضح ومتميز عند استخدام شكل لوحة الآبار 12، على حساب حجم اللوحة وحساسية (لوحة باء). وعلى النقيض من CMC، أدى استخدام الاغاروز والسائلة تراكب في لويحات أكبر بكثير، مشيرا إلى انخفاض تثبيط الفيروس وزيادة الحساسية للVEEV النسخ المتماثل. وقد تأكد هذا في السابق عند مقارنة فقط الاغاروز مقابل CMC في APأبر نشرتها خواريز وآخرون. 4. بينما أنتجت الاغاروز والسائلة تراكب ويحات أكبر من CMC، كان لويحات تعريف سيئة الحدود وكان من الصعب الاعتماد في شكل جيد 12، مع تراكب السائلة توفير أكبر انتشار الحدود. عندما تم محاكمتهم لويحات في 6 لوحات جيدا (الشكل 4)، نفي أكبر شكل جيد 6 القضية لويحات كبيرة بشكل علني التي كان من الصعب التفريق في شكل 12 أيضا، مع الاغاروز وتراكب السائلة تثبت متفوقة على تراكب CMC من حيث تعريف البلاك وبحساسية (الشكل 4D). بالمقارنة مع RVFV أو VEEV، يوفر أنفلونزا عدة تحديات فريدة من نوعها عندما plaquing، مثل شرط وجود الأنزيم البروتيني الخارجي. حساسية فيروس الأنفلونزا لاختلاف الاختيارات تراكب كما تم توثيقه جيدا في الماضي وقد لوحظت تغييرات كبيرة عندما تعديلات طفيفة مثل الماركات المختلفة من الاغاروز لها أن تكونأون تستخدم 9. ومن المثير للاهتمام للسلالة الأنفلونزا ب تايوان، أدى استخدام CMC كما تراكب في لويحات صغيرة بشكل ملحوظ التي كان من الصعب الاعتماد وثبت صعوبة ليسجل موثوق (الشكل 5A). وفر استخدام تراكب الاغاروز أفضل لويحات (لوحة C)، ونتج عن ذلك وصمة عار قتامة الخلفية (بسبب الأرجح إلى زيادة قابلية أحادي الطبقة)، وأظهرت اللوحات أكثر وضوحا وأكثر وضوحا في مقارنة مباشرة لاستخدام تراكب السائل (لوحة ب ). وهناك ميزة واضحة من البوليمرات السائلة على مدى تراكب صلبة ونصف صلبة، مثل الاغاروز وCMC، يكمن في سهولة إزالة والتطبيق. تراكب شبه الصلبة تتطلب التدفئة، والتصلب يمكن أن يثبت عند التعامل مع إشكالية وإزالة. من أجل الاستفادة من هذه المزايا وتحديد العملية لاستخدام Avicel بطريقة عالية الإنتاجية للRVFV، تم محاكمتهم شكل لوحة الآبار 96 في متفاوتة concentrati تراكبإضافات (الشكل 6). لRVFV MP-12، وأجريت التخفيفات في quadruplicate في كلا 0.6 و 1.2٪ تركيزات النهائية Avicel. ثبت تطبيق تراكب وإزالة بسيط، مع عدم وجود اختلافات واضحة بين مكررات أو بين تجمعات لوحظ، مما يدل على درجة عالية من التكاثر. عندما التهديف، كانت لوحات متميزة والمعدودة للعين المجردة، مما يدل على جدوى استخدام تراكب السائل بطريقة إنتاجية عالية للRVFV. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> الرقم 1: RVFV وحة مقارنات تراكب استخدام 12 لوحات جيدة تم مطلي Veros عند 2.5 × 10 5 خلايا في 12 لوحات جيدة والمصابين 200 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من MP12. بعد الإصابة 1.5 مل تراكب من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC (ج النهائيةoncentrations)، تم تطبيقها من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضح في لوحة A. اللوحات احصي وtitered في لوحة ب. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> الشكل 2: RVFV وحة مقارنات تراكب باستخدام 6 لوحات جيدا تم مطلي Veros في 5 × 10 5 خلايا في 6 لوحات جيدا ومصابة 400 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من MP12. تراكب ثلاثة مل من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC، طبقت من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضح في لوحة A، أجريت B، و C. تجارب فصل مماثل كما هو موضح لوحات AC، مع ويحات أحصت وtitered في لوحة D (N = 3). <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> الرقم 3: &lt;قوية&gt; VEEV وحة مقارنات تراكب استخدام 12 لوحات جيدة. تم مطلي Veros عند 2.5 × 10 5 خلايا في 12 لوحات جيدة والمصابين 200 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من سلالة اللقاح VEEV TC-83. بعد الإصابة 1.5 مل تراكب من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC، طبقت من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضح في لوحة A. اللوحات احصي وtitered في لوحة ب. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> الرقم 4: V EEV مقارنات تراكب اللوحة باستخدام 6 لوحات جيدا تم مطلي Veros في 5 × 10 5 خلايا في 6 لوحات جيدا ومصابة 400 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من VEEV TC-83. بعد الإصابة، 3 مل تراكب من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو CMC 1٪، طبقت من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضحفي لوحات A، أجريت B و C. تجارب فصل مماثل كما هو موضح لوحات A - C، مع وعدها لويحات titered في لوحة D (N = 3). <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> الرقم 5: الأنفلونزا وحة مقارنات تراكب كانت مطلية خلايا MDCK في 5 × 10 5 خلايا في 6 لوحات جيدا ومصابة 400 ميكرولتر من اللقاح باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من الأنفلونزا ب تايوان. تم استخدام أي مصل بقري جنيني (FBS) في وسائل الإعلام أو تراكب النمو، كما FBS يمكن أن تمنع انتشار الأنفلونزا من خلال تثبيط بعض البروتياز التي مطلوبة من أجل الانصهار الفيروسي. تمت إضافة TPCK-التربسين لجميع تراكب قبل التطبيق من أجل تسهيل اندماج فيروسي والدخول مع الخلايا المضيفة. بعد الإصابة، تم تطبيق تراكب 3 مل من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC من أجل مقارنة مباشرةنفذت تراكب كما هو موضح في لوحة A، B و C. تجارب فصل مماثل كما هو موضح في لوحات A - C، مع وعدها لويحات titered في لوحة D (N = 3). بينما اتخذ في المتوسط ​​لويحات CMC ثبت من الصعب الاعتماد بشكل موثوق لأنها أثبتت الحدود منتشر والأحجام وحة صغيرة جدا. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> الرقم 6: تراكب اللوحة عالية الإنتاجية و96 لوحة جيدا من Veros مطلي في 3 × 10 4 خلايا لكل بئر، كانت مصابة 50 ميكرولتر من اللقاح باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من RVFV MP12 لمدة 1 ساعة، في quadruplicate. لتراكب، تم محاكمتهم 0.6 و 1.2٪ تركيزات النهائية Avicel من أجل تحديد الجدوى واستنساخ باستخدام تراكب السائلة بطريقة عالية الإنتاجية، لوحات A و B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> الإنفلونزا ب </td></tr><tr><td> نوع من الخلايا </td><td> فيرو </td><td> فيرو </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> فترة العدوى </td><td> 1 ساعة </td><td> 1 ساعة </td><td> 45 دقيقة </td></tr><tr><td> فترة حضانة </td><td> 3 أيام </td><td> 2 أيام </td><td> 3 أيام </td></tr></tbody></table> الجدول 1: البلاك الفحص التلقيح شروط والخلية أنواع <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> الإنفلونزا ب </td></tr><tr><td> نوع من الخلايا </td><td> فيرو </td><td> فيرو </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> نوع النمو</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> اللوحة الإعلام </td><td> 2xEMEM و </td><td> 2xEMEM و </td><td> 2xEMEM ب </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ Penicllin / الستربتوميسين. 2. Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة تستكمل مع 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ Penicllin / الستربتوميسين، 0.2٪ الأبقار مصل الزلال، 0.025٪ HEPES، DEAE-دكستران 50ug / مل. A. 2X الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية (500 مل) تستكمل مع 5٪ FBS (25 مل)، 1٪ الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية (5 مل)، و 1٪ البيروفات الصوديوم (5 مل)، 1٪ L-الجلوتامين (5 مل)، 2٪ القلم / بكتيريا (10 مل). B. 2X الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية (500 مل) تستكمل مع 0.2٪ الأبقار مصل الزلال، 1٪ الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية (5 مل)، 50ug / مل، 0.025٪ HEPES، DEAE-ديكستران، التربسين-TPCK * * فقط قبل التحضير، إضافة 1 ميكرولتر لكل 25مل من 2 ميكروغرام / مل من الأسهم TPCK-التربسين إلى قسامة سوف تستخدم لخلط مع الاغاروز لويحات. الجدول 2: اللوحة والفيروسية / الخليوي الأوساط النمو <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> الإنفلونزا ب </td></tr><tr><td> نوع من الخلايا </td><td> فيرو </td><td> فيرو </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> فترة العدوى </td><td> 1 ساعة </td><td> 1 ساعة </td><td> 45 دقيقة </td></tr><tr><td> فترة حضانة </td><td> 3 أيام </td><td> 2 أيام </td><td> 3 أيام </td></tr></tbody></table> سوف حلول تراكب لا تنتهي عندما قام طالما يتم الحفاظ على العقم. الجدول 3: تراكب المالية <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 6 جيدا </td><td> 12 جيدا </td><td> 96 جيدا </td></tr><tr><td> # الخلايا / جيد </td><td> 5 × 10 5 </td><td> 2.5 × 10 5 </td><td> 3 × 10 4 </td></tr><tr><td> حجم innoculum (ميكرولتر) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> حجم تراكب (مل) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> الجدول 4: تنسيقات بلايت

Watch this Scientific Journal Video about Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems at JoVE.com

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

تحديد تركيز الفيروسي من خلال البلاك فحوصات: نظم تراكب عن طريق التقليدية والرواية

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

111.5K Views.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Video: Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

الفحص وحة لنوروفيروس الفئران

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

الاستفادة المثلى من الكمية الصغيرة تحييد الفحص

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

مختبر تقنيات العقيم: طرق تصفيح

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biology

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

جيل، والتضخيم، ومعايرة المؤتلف من فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can be difficult to perform, requiring focus on its specifications and refinement. It is an incredibly challenging method for new students to master, mainly because it requires meticulous attention to the most minute details. This demonstration of plaquing herpes simplex viruses should help those who have struggled with visualizing the method, especially its nuances, over the years. While this manuscript is based on the same principles of standard plaquing methodology, it differs in that it contains a detailed description of (1) how best to handle host cells to avoid disruption during the process, (2) a more useful viscous medium than agarose to limit the diffusion of virions, and (3) a simple fixation and staining procedure that produces reliably reproducible results. Furthermore, the accompanying video helps demonstrate the finer distinctions in the process, which are frequently missed when instructing others on conducting plaque assays.

Plaquing is a routine method used to quantify live viruses in a population. Though plaquing is frequently taught in various microbiology curricula with bacteria and bacteriophages, plaquing of mammalian viruses is more complex and time-consuming. This protocol describes the procedures that function reliably for regular work with herpes simplex viruses.

Plaqueing من فيروسات الهربس البسيط

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

انتشار الفيروس والقياس اللوني القائم على الخلايا

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Microbiology

Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

Source: Yadavalli, T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62195">Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

تحديد الفعالية المضادة للفيروسات للأدوية التجريبية من خلال فحص البلاك

1. Virus infection quantification
NOTE: Virus titers from porcine corneas should be evaluated every day to analyze the effect of drug treatment.

	To ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

Source: Tai, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53124">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a viral attachment assay for screening antiviral compounds. Using genetically modified hepatitis C virus and luciferase, it assesses inhibitory effects on viral attachment, as indicated by lower light intensity in co-treated wells compared to wells treated with the virus alone.

مقايسة التعلق الفيروسي لفحص المركبات المضادة للفيروسات

NOTE: Ensure that all procedures involving cell culture and virus infection are conducted in certified biosafety hoods that are appropriate for the ...