Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Sueco de Investigación (90293501, A0290401, A0290402), del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea en virtud de acuerdo de subvención n ° 602699 (DIREKT), la Fundación NovoNordisk, la Fundación Gurli y Edward Brunnberg, Tallo Terapia, Vleugel Fundación y Fundación Åke Wiberg.

NOTA: Se extrajo sangre de individuos sanos por venopunción sistema abierto en señal de aprobación ante la Junta de Revisión Ética en Uppsala (Permit No. 2008/264). 1. Las células Siembra <ol><li> Células de cultivo primarias humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) a 37 ° C en 5% de CO 2 en matraces T75 recubiertos con gelatina al 1% en PBS pH 7,4. </li><li> Retire el medio de cultivo de un frasco T75 que contiene HUVEC (u otro tipo de células endoteliales humanas primarias) y lavar las células con EDTA 2,1 mM en PBS pH 7,4. Separar las células mediante la adición de 1 ml 0,25% de tripsina-EDTA y se incubó durante 2 - 3 minutos en 37 ° C. </li><li> Recoger las células por lavado el matraz con 9 ml 10% de FBS en PBS pH 7,4 y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrifugar las células a 735 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular cuidadosamente en medio de crecimiento celular endotelial microvascular (CE GMMV) y contar las células en una cámara de Bürker. Semillas 21.000 cells / cm 2 en las diapositivas de cultivo de células de 1 pocillo e incubar a 37 ° C. El HUVEC se confluente después de 1 - 2 días de cultivo. Monitorear la morfología celular y la confluencia diariamente bajo un microscopio de luz. </li></ol> 2. Preparación de sangre entera <ol><li> Preparar todas las superficies artificiales que estarán en contacto con la sangre con una doble capa de heparina inmovilizada (CHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Materiales recubiertos CHS protegido del polvo se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta 6 meses sin pérdida de la función. </li><li> Utilice venopunción sistema abierto para extraer la sangre de un donante sano en breve (&lt;30 min) antes de comenzar el experimento endotelial cámara de sangre. Pareja de una aguja hipodérmica (18 G x 50 mm) a CHS tubo de silicona recubierto (diámetro interno: 2 mm) antes de recoger cuidadosamente la sangre en un tubo de 50 ml recubiertos CHS. Suplemento de sangre con heparina no fraccionada para llegar a una concentración final de 0,75 UI / ml. Mezclar suavemente la sangre por inverting el tubo de 2 - 3 veces. </li></ol> Modelo 3. Sangre Cámara endotelial <ol><li> Fabrique cámaras de sangre (Figura 1A; vista superior) en acrílico polimetilmetacrilato (PMMA) que consta de dos cilindros (altura 8 mm y el radio de 9 mm) que se pegan a una diapositiva de PMMA (25 x 75 mm). Coloque los bordes de los cilindros hacia arriba con juntas tóricas de goma para sellar la cámara de sangre contra los portaobjetos de vidrio con las células endoteliales en cultivo (Figura 1B). Girar las cámaras de sangre conectados a la diapositiva cultivo con células endoteliales a partir de entonces en una posición vertical (Figura 1C). </li><li> Utilice una punta de pipeta CHS recubierto de transferir 1,5 ml de sangre en cada CHS recubiertos cámara teniendo cuidado de no activar la sangre. </li><li> Transferir 1 ml de sangre en tubos de microcentrífuga que contiene 30 l 0,34 MK 3 EDTA para llegar a una concentración final de 10 mM K 3 EDTA para la determinación de las concentraciones de proteína de plasma inicial utilizandoun ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Mezclar con cuidado la sangre y mantener los tubos en hielo. </li><li> Retire las paredes de plástico del cultivo celular portaobjetos de vidrio de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuidadosamente lavar las células en PBS pH 7,4. Asegúrese de eliminar posteriormente tanto líquido como sea posible de las diapositivas. No dejes que las células se sequen. </li><li> Posicionar el cursor en la parte superior de las cámaras de sangre, con células que se enfrenta la sangre. Fije la corredera mediante la colocación de una abrazadera alrededor de la cámara de células endoteliales de sangre. Utilice un portaobjetos de plástico para soporte adicional para evitar la rotura de la lámina de vidrio de cultivo celular al colocar la abrazadera. </li><li> Fijar la cámara de células endoteliales de la sangre en una rueda giratoria (40 cm de diámetro) en lugar de un baño de agua a 37 ° C. Girar cada cámara en la rueda en 0,5 xg durante 30 min. </li><li> Después de la incubación, desmantelar la cámara de células endoteliales en la sangre. Lavar los portaobjetos de cultivo de células en PBS pH 7,4 y fijar las células en hielo frío 1% de paraformaldehído (PFA) fo 10 min. Transferir 1 ml de sangre de cada cámara a tubos de microcentrífuga que contiene 30 l 0,34 MK 3 EDTA para llegar a una concentración final de 10 mM K 3 EDTA y mezclar suavemente los tubos. Mantener los tubos en hielo. </li><li> Centrifugar los tubos a 4.560 xg durante 10 minutos en 4 ° C. Transferir el plasma de la sangre a los nuevos tubos de microcentrífuga y tienda en -70 ° C hasta su posterior análisis. </li></ol> 4. Análisis de sangre endotelial Interacciones <ol><li> Lleve a cabo la tinción de inmunofluorescencia con el ratón anti-CD16 humano seguido de cabra secundario anti-ratón Alexa 488 y phalloidin-TexasRed. Realizar cada etapa de tinción durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar los portaobjetos en PBS pH 7,4 entre cada paso. Contratinción los núcleos con DAPI durante 10 min a temperatura ambiente. Analizar los componentes sanguíneos unidos a las células endoteliales por microscopía de fluorescencia en combinación con análisis de imagen usando el software de análisis de imagen adecuado tal como CellProfiler. </li><li> Quantify las reacciones en el compartimento de la sangre con trombina-antitrombina (TAT) ELISA según las instrucciones del fabricante de las muestras de plasma. </li><li> Usar herramientas estadísticas adecuadas, por ejemplo., Una prueba t no pareada, para analizar los datos. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Múltiples interacciones entre la sangre y la pared del vaso se mantienen normalmente en un estado de reposo debido a la naturaleza no adhesiva y anti-trombótica del endotelio. 7 Durante condiciones patológicas que implican inflamación, el endotelio se activa con un aumento resultante en la expresión del receptor de adhesión y 8 una capacidad reducida para inhibir la hemostasia. 9 La activación de los sistemas de cascada en la sangre a su vez amplifica la trombogenicidad del endotelio causando más la trombosis y el reclutamiento de leucocitos. 10 Para obtener una mejor comprensión de este delicado interacciones entre las células endoteliales y la sangre entera, tenemos desarrollado un nuevo método in vitro donde las células endoteliales cultivadas se colocan en contacto con la sangre entera. Para nuestro conocimiento, nuestra configuración es el primero en mostrar las células endoteliales incubadas con sangre humana entera con ninguna o muy poca anticoagulante durante períodos de tiempo más largos. nt &quot;&gt; La sensibilidad de este sistema se activa por punción venosa sistema abierto en combinación con una capa protectora de heparina inmovilizada en todas las superficies puestas en contacto con la sangre. El uso de un sistema abierto durante la obtención de la sangre reduce la activación de los sistemas de cascada durante la punción venosa mientras que permite el uso de una cantidad autodeterminada de anticoagulante. tubos de sangre evacuados disponibles en el mercado pueden, sin embargo, ser utilizados en función de los criterios de valoración previstos del estudio. La concentración final de anticoagulante añadido a los tubos del sistema cerrado más disponibles en el mercado pueden inhibir sensible , y de otra manera difícil de estudiar, las interacciones en la configuración. 6 una superficie protectora heparina elimina la activación adicional de sangre a través de la superficie de contacto por cualquier superficies que no sean las células endoteliales. 5 De hecho, la incubación de la sangre entera suplementado con una pequeña cantidad de heparina no fraccionada en cámara sin la protección de CHS resultó en la formación de coágulos. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; La burbuja de aire dentro de la cámara permite que la mezcla de la sangre durante la incubación con las células endoteliales. Con el fin de evaluar el efecto del tamaño de la burbuja de aire, se utilizaron dos volúmenes de sangre diferentes. En este modelo, que mide los niveles de TAT similares independientemente del tamaño de las burbujas de aire en las cámaras incubadas con HUVEC. TAT fue, sin embargo, aumentó con un tamaño de burbuja de aire más pequeño en las cámaras totalmente CHS tratada. Esto, de acuerdo con las propiedades descritas anteriormente de células endoteliales 11, indica un efecto regulador sobre el aumento de la activación de la coagulación proporcionado por las células endoteliales que se carece en la cámara de CHS inerte. La burbuja de aire en el sistema crea un flujo después de la rotación de la cámara. El tamaño de la burbuja afectará a las fuerzas dentro de este sistema de rotación. Esto se muestra por nuestros resultados en la Figura 2D fuera una burbuja más pequeño crea valores TAT más altos representan una disminución de la fuerza de la sangre es decir, el movimiento de la sangredentro de la cámara es menor y por lo tanto la activación del sistema de cascada se produce en un grado superior. Cabe mencionar que en este sistema que estamos creando un flujo giratorio que será diferente en la velocidad a través de la cámara con la velocidad más alta a lo largo de las paredes y la más baja en el centro. Esto no es, obviamente, un ambiente óptimo en lo que respecta al flujo y esfuerzo de corte para las células endoteliales, pero todavía tenemos un sistema que produce resultados estables y repetibles. Condiciones óptimas incluirían circulación de flujo laminar en ausencia de turbulencia. Esto es, sin embargo, no es posible en el modelo representado aquí y a nuestro conocimiento un sistema de este tipo no está disponible hasta la fecha. Aunque, hay varios sistemas de microfluidos comercialmente disponibles que no son posibles para combinar con sangre entera sin o con bajos niveles de anticoagulante añadido al sistema de ese modo dejar de permitir la evaluación sensible adecuada de las interacciones entre todos los componentes presentes en la sangre y las células endoteliales. Además, hubo un aumento de 2 veces en el reclutamiento de células de la sangre hacia TNF activa HUVEC en combinación con una formación de TAT duplicado independientemente del volumen de sangre. Esto verifica la estabilidad del sistema de modelo y también muestra la posibilidad de utilizar un endotelio activado en combinación con la sangre entera. Future en, la cámara de células endoteliales de sangre se puede utilizar para investigar el reclutamiento de células de la sangre hacia las células endoteliales activadas por una variedad de marcadores expresados ​​en las células en diversas condiciones y etapas de activación. Además, el modelo se puede usar en combinación con agentes farmacológicos con el fin de evaluar los efectos sobre las condiciones inflamatorias. En resumen, mostramos el gran beneficio de la combinación de un modelo de cámara con las células sanguíneas y vasculares humanas para crear un humano completo sistema in vitro para llevar a cabo investigaciones relevantes de la enfermedad vascular.

Métodos para el análisis de las interacciones de la sangre vascular en la enfermedad cardiovascular generalmente implican experimentos de investigación animal. Resultados creados en modelos animales experimentales de investigación pueden, sin embargo, tienen poca o ninguna incidencia en las enfermedades humanas. 1,2 Como tal, hay una necesidad de una buena y fiable en modelos in vitro para investigar las interacciones celulares entre el compartimiento de la sangre y las células endoteliales vasculares en un sistema similar a la humana. Por ello, hemos establecido un modelo de cámara de las células endoteliales en la sangre. Esto se basa en un modelo descrito previamente utilizado para investigar las interacciones entre los biomateriales y sangre humana entera. 3 Contrariamente a otras configuraciones in vitro, donde por lo general un número limitado de componentes purificados, es decir, trombocitos, leucocitos o células endoteliales están disponibles, el actual modelo incorpora todos los componentes presentes en un vaso sanguíneo. La configuración del endotelio arterial cmodelo de cámara de ell está diseñado para permitir el uso de la sangre humana recién extraída con poco o ningún anticoagulante añadido. La sangre almacenada durante períodos de tiempo más largos adquirir los llamados lesiones de almacenamiento donde ruptura de los eritrocitos puede interferir con delicadas interacciones entre la sangre y las células endoteliales. 4 Para evitar la formación de coágulos durante la manipulación de sangre entera ex vivo o bien requiere altas dosis de anticoagulante o que todo el material en contacto con la sangre tiene que ser no activante. Como superficies no activadoras son raros en el entorno de laboratorio, materiales, alternativamente, pueden estar equipados con una capa protectora de heparina inmovilizada. Una capa protectora de heparina inmovilizada (denominado en lo sucesivo como superficie de heparina Corline (CHS)) que se puede aplicar a la mayoría de los materiales de la creación de una superficie donde puede producirse contacto con la sangre sin causar una activación de la cascada de la coagulación. 5 Por lo tanto, mediante el suministro de las cámaras con CHS, el ce endotelial arterialll modelo de cámara permite el uso de concentraciones muy bajas de anticoagulante en la sangre. Evitar la adición de altas concentraciones de anticoagulante en el modelo de cámara endotelial sangre hace que sea posible estudiar interacciones sensibles dentro de un vaso sanguíneo que de otro modo podrían ser enmascarado. 6 El modelo de cámara de las células endoteliales de la sangre se compone de dos cámaras formadas uniendo cilindros de plástico (altura: 8 mm; radio: 9 mm) a un portaobjetos de plástico. Los bordes hacia arriba en los cilindros están equipadas con ranuras que están equipados con juntas tóricas de caucho utilizadas para el sellado de las cámaras contra el portaobjetos de cultivo celular. Las cámaras están sólo parcialmente llenos de sangre como el aire que queda en la cámara mantiene la sangre en movimiento cuando las cámaras se hacen girar posteriormente en una posición vertical (Figura 1). Con el fin de evaluar la funcionalidad del modelo, hemos realizado experimentos con ya sea un CHS recubierto completamentecámara o de vena umbilical humana células endoteliales (HUVEC). Dos volúmenes de sangre separadas se analizaron y la formación de trombina antitrombina (TAT) complejos (un marcador indirecto de la coagulación) se midió con ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). A continuación, se evaluó el efecto de los volúmenes de sangre y factor de necrosis tumoral (TNF) estimulado las células endoteliales en el reclutamiento de leucocitos por análisis de imagen. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Figura 1. Configuración del modelo de cámara de las células endoteliales en la sangre. (A) Vista superior dibujo esquemático de la cámara de sangre realizado en PMMA. (B) las células endoteliales humanas primarias son cultivadas en portaobjetos de cámara 1 pocillos. Sangre completa humana fresca se añade a dos cámaras en un portaobjetos de microscopio. Las cámaras y todo el material utilizado para la manipulación de la sangre se tratan con un recubrimiento de protección HS. Después de la eliminación de las paredes de la cell cultura de diapositivas, las células se colocan frente a la sangre y el sistema se sujeta cerrada. cámaras celulares (C) El endotelial sangre se incuban a continuación en virtud de la rotación en 37 ° C. Después, las reacciones en el compartimento de la sangre pueden ser analizadas por ELISA y las células endoteliales pueden ser analizados por microscopía.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:272px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-12200</td>
			<td style="width:272px;">Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-22120</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G-2500</td>
			<td style="width:272px;">Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TAT ELISA</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Lab.</td>
			<td style="width:119px;">TAT-EIA-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse anti-human CD16</td>
			<td style="width:91px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;">F7011</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Phalloidin-Texas Red</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>Dilution 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-6758</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Tecnologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 well cell culture slides</td>
			<td style="width:91px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">354101</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Blood Chambers</td>
			<td style="width:91px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Clamps</td>
			<td style="width:91px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">2052204</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Corline Heparin Surface (CHS)</td>
			<td style="width:91px;">Corline Systems AB</td>
			<td style="width:119px;">945-00</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:91px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-1850R</td>
			<td style="width:272px;">Size: 18 G x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Unfractionated Heparin (UFH)</td>
			<td style="width:91px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;">585679</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">K3EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">1709958</td>
			<td style="width:272px;">Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">PFA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:91px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:272px;">Available for free at www.cellprofiler.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

La mayoría de todas las enfermedades conocidas se acompañan de trastornos del sistema cardiovascular. Los estudios sobre la complejidad de las vías que interactúan activados durante patologías cardiovasculares son, sin embargo, limitadas por la falta de métodos robustos y fisiológicamente relevantes. Con el fin de modelar eventos vasculares patológicas hemos desarrollado un ensayo in vitro para el estudio de la interacción entre el endotelio y la sangre entera. El ensayo consiste en células endoteliales humanas primarias, que se colocan en contacto con sangre humana entera. El método utiliza la sangre nativa con muy poco o ningún anticoagulante, que permite el estudio de las interacciones entre los delicados componentes moleculares y celulares presentes en un vaso sanguíneo. Hemos investigado la funcionalidad del ensayo mediante la comparación de activación de la coagulación por diferentes volúmenes de sangre incubadas con o sin células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Mientras que un volumen de sangre mayor contribuyó aun aumento en la formación de complejos de antitrombina trombina (TAT), la presencia de HUVEC dio como resultado reducción de la activación de la coagulación. Además, se aplicó análisis de imagen de unión de leucocitos a HUVEC estimuladas con factor de necrosis tumoral (TNF) y se encontró la presencia de células CD16 + a ser significativamente mayor en las células estimuladas TNF en comparación con células no estimuladas después de contacto con la sangre. En conclusión, el ensayo se puede aplicar para estudiar patologías vasculares, donde se perturban las interacciones entre el endotelio y el compartimiento de sangre.

La necesidad de la CHS Recubrimiento Para medir reacciones en sangre entera específicas para los provocados por las células endoteliales, todos los materiales utilizados para la cámara de células endoteliales de sangre deben estar provistas de un revestimiento CHS antes de su uso. Figura 2A (izquierda) muestra una cámara sin recubrimiento después de 30 min de contacto de la sangre con un coágulo claramente visible presente. El tratamiento de la cámara con CHS (Figura 2A, derecha) en el otro lado protege la sangre de activación incontrolada, asegurándose de que los resultados son debido a las interacciones de células endoteliales de sangre. El efecto del volumen de sangre en la Cámara La activación de la coagulación es más probable en sangre estancada medida que se incrementa la probabilidad de interacción entre los factores de coagulación activados. En el modelo de cámara de células endoteliales de sangre, la sangre se mantiene en movimiento debido a la circulación de una burbuja de aire dentro de la cámara. En Order para determinar el efecto de los cambios en el volumen de sangre, y por lo tanto también el tamaño de burbuja de aire, una cámara de CHS recubierto se conecta a un portaobjetos de vidrio recubierto de CHS que fue probado con 1,5 ml o 1,75 ml de sangre entera para 30 min. El volumen de sangre sin ningún movimiento por la burbuja de aire es 2,5 veces más grandes cuando se añade 1,75 ml de sangre a la cámara en comparación a cuando se utiliza 1,5 ml de sangre (Figura 2B). Los TAT-valores medidos sugirieron aumentaron TAT-formación con un mayor volumen de sangre (Figura 2D). Cuando HUVEC (Figura 2C) se incubaron con 1,5 o 1,75 ml de sangre entera, no se observó ninguna diferencia entre los dos grupos, lo que sugiere que las células endoteliales pueden modular la activación de la coagulación (Figura 2D). El efecto de TNF en el reclutamiento de células de la sangre y la activación de la coagulación Con el fin de estudiar el efecto de TNF en el reclutamiento de leucocitos, HUVEC fueron treated con 20 ng / ml TNF 4 h antes de contacto con la sangre. Se continuó durante 30 min después de lo cual los portaobjetos de cultivo fueron teñidos para CD16 (Figura 2F), la imagen y el número de células CD16 + se cuantificó - contacto de la sangre - ya sea con 1,5 ml o 1,75 ml de sangre. El reclutamiento de células CD16 + se incrementó significativamente con el tratamiento con TNF (Figura 2E) 100-256 CD16 + células / mm 2 (p &lt;0,0001) con 1,5 ml de sangre y 172 a 378 (P &lt;0,0001) con 1,75 ml de sangre. La formación de complejos TAT se midió en las muestras de plasma correspondientes de la sangre incubadas con células ya sea TNF tratado o no tratado (Figura 2G). Células TNF estimulada indujeron una duplicación aproximada de complejos TAT ​​en comparación con las células no tratadas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> HigoUre 2: Funcionalidad del modelo de cámara de células endoteliales de sangre. (A) Cámaras con o sin CHS se incubaron con sangre completa. Sin CHS, se formó un coágulo después de 30 minutos. Medición de la trombina antitrombina (TAT-) complejos, un marcador indirecto de la coagulación en la sangre, incubadas sin CHS era&gt; 6.000 mg / ml. (B) El volumen de sangre no siguió moviéndose por la burbuja de aire que gira variará con diferentes volúmenes de sangre. Con la adición de 1,5 ml de sangre, este volumen será 0,3 ml, mientras que se incrementará a 0,74 ml con la adición de 1,75 ml. (C) HUVEC con imagen formada con microscopía de contraste de fase muestran la morfología típica de células endoteliales de una monocapa confluente antes de contacto con la sangre. (D) los valores de TAT para cámaras completamente CHS recubiertos muestran una ligera diferencia cuando se añaden diferentes volúmenes de sangre. La adición de 1,5 ml de sangre resultó en 35 ± 11 g / ml (n = 7) en comparación con 1,75 ml, lo que resultó en el 8577; 70 mg / ml TAT (n = 8). Esta diferencia ya no está presente cuando HUVEC se incuban con los mismos volúmenes de sangre; 66 ± 55 mg / ml de 1,5 ml (n = 5) y 66 ± 29 mg / ml de 1,75 ml (n = 7). (E) Cuantificación del número de células CD16 + presentes en ambos no estimulada o TNF estimulada después de HUVECs contacto con la sangre. El número de células CD16 + se incrementa significativamente con TNFa estimula las células incubadas ya sea con 1,5 ml (basal: 100 ± 40 células / mm; TNFa: 256 ± 121 células / mm) o 1,75 ml (basal: 172 ± 67 células / mm; TNFa: 378 ± 185 células / mm) de sangre completa (F) Imágenes representativas de no estimulada y TNFa estimulado HUVEC teñidas para phalloidin (rojo), CD16 (verde) y DAPI (azul).. Barra de escala = 250 m (G) La formación de complejos TAT se duplicó aproximadamente por TNFa células estimuladas en comparación con las células no tratadas se incubaron con sangre (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 veces más TAT, n = 3; 1.75 ml: 1,7 ± 1,0 veces más TAT, n = 4). Todos los valores se presentan como media ± desviación estándar; los valores de p se calcularon mediante pruebas t no apareados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Una Novela<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para el estudio de las interacciones entre Whole Sangre humana y del endotelio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K vistas.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...