Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología. Por ejemplo, determinar cómo se alteran las proporciones de subconjuntos de monocitos, o la expresión de diferentes marcadores, en los estados de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica, es que las células están cerca de su estado nativo, y que se utilizan instrucciones claras y justificación, para proporcionar un método de medición estandarizado.
Generalmente, los individuos nuevos en este método pueden tener problemas, porque muchos papeles no dan instrucciones claras sobre cómo se realizó el gating de las células. Comience este protocolo con la recolección de muestras de sangre y la determinación del recuento de glóbulos blancos, como se detalla en el protocolo de texto. Diluir la sangre con solución salina tamponada con fosfato, para ajustar la concentración a aproximadamente 5 millones de glóbulos blancos por mililitro.
Preparar suficiente mezcla maestra para el número de tubos mediante la combinación de sangre, anti CD14-V450, anti CD16-APC y anti HLA-DR-PerCP. Vórtice y pipeta 51,9 microlitros de mezcla en cada tubo. Agregue anticuerpos marcadores M1 y M2 etiquetados por PE, así como marcadores para células T, células B, neutrófilos y células asesinas naturales a sus tubos correspondientes.
Vórtice e incubar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Ahora, agregue 250 microlitros de la lysis combinada de glóbulos rojos y la solución de fijación de glóbulos blancos, e inmediatamente vórtice la mezcla, suavemente. Incubar la mezcla de vórtices durante 10 minutos en la oscuridad, a cuatro grados centígrados.
Después de 10 minutos, agregue 250 microlitros de PBS y gire hacia abajo las células a 260 g, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y resuspendir las células en 300 microlitros de 1%formaldehído. Almacene las células en cuatro grados centígrados, protegidos de la luz hasta que se realice el análisis.
La citometría de flujo debe realizarse dentro de las 48 horas posteriores a la preparación de la muestra. Para comenzar, compruebe el registro del citometro de flujo para asegurarse de que el personal de la instalación ha realizado comprobaciones de control de calidad. Para configurar el experimento de citometría de flujo, haga clic en un nuevo experimento, seguido de una nueva muestra y un tubo nuevo, para añadir tubos.
Seleccione trazados bivariados, haciendo clic en el icono y utilice los menús desplegables para seleccionar los parámetros de acceso. Asegurar la inclusión de una gráfica CD16/CD14 y una gráfica que muestra un detector junto con el tiempo, para supervisar la adquisición. Inserte el tubo y haga clic, adquiera.
Compruebe la configuración de voltaje del instrumento, asegurándose de que las señales del detector no estén fuera de escala. Observe las células que caen en la compuerta de monocitos de la gráfica CD14/CD16. Establezca el umbral de grabación en 5.000 eventos para la puerta de monocitos clásicos y haga clic en grabar.
Continúe registrando los datos de los tubos restantes. Una vez registrados los datos de todos los tubos, exporte los datos de flujo como archivos fcs para su análisis. Para realizar la gating de monocitos, abra archivos en el software de análisis, haga doble clic en el nombre del tubo y seleccione parámetros en los menús desplegables para visualizar las celdas en un gráfico de dispersión hacia delante frente frente a la altura de dispersión hacia delante.
Cree una puerta de exclusión de doblete, haciendo clic en el icono de la herramienta de puerta poligonal y encerrando las celdas. Seleccione las celdas cerradas haciendo doble clic en la región cerrada. En el nuevo cuadro de visualización, ajuste los parámetros del menú desplegable para mostrar las celdas en un área de dispersión hacia delante frente a la gráfica de área de dispersión lateral.
Haga clic en el icono de la puerta rectangular, y seleccione generosamente la población de monocitos, en función de las propiedades de dispersión hacia adelante y lateral, para excluir la mayoría de los linfocitos, células asesinas naturales y granulocitos. Seleccione las celdas cerradas y vuelva a mostrarlas en un trazado CD14/CD16, seleccionando los parámetros mediante los menús desplegables. Haga clic en la puerta poligonal para seleccionar monocitos en función de su característica, forma l invertida.
Si la población no clásica no es distinta de las células a su izquierda, entonces la contaminación es probable y debe ser investigada. Seleccione las celdas cerradas y muestre los monocitos en un trazado CD/16 HLA-DR, utilizando los menús desplegables para seleccionar parámetros. Haga clic en la puerta poligonal para seleccionar las celdas positivas HLA-DR y excluir las células asesinas naturales restantes y neutrófilos.
Seleccione las celdas cerradas y muestre las celdas positivas HLA-DR en un trazado CD14/HLA-DR utilizando menús desplegables para seleccionar parámetros. Haga clic en la puerta poligonal y dibuje una puerta para excluir las celdas B bajas HLA-DR altas/CD14 bajas. Seleccione las celdas cerradas y utilice los menús desplegables para mostrarlas en un trazado CD16/CD14.
En opciones de trazado, seleccione trazado de cebra, que permitirá dibujar puertas de subconjunto de monocitos, para determinar las proporciones de subconjuntos. Ahora, haga clic en el icono de puerta rectangular y seleccione los monocitos clásicos dibujando una puerta rectangular aproximada alrededor de la población de monocitos clásicos altos/CD16 CD14. En la pantalla, seleccione, muestre las medianas para mostrar la intensidad de fluorescencia media para los monocitos clásicos.
Ajuste la puerta de modo que la población tenga una distribución igual de la mediana a la izquierda y a la derecha, y esté abarcando todas las celdas a la izquierda. Seleccione la población intermedia dibujando una puerta rectangular que abarque las celdas a la derecha de la puerta clásica. Ajuste la parte inferior de la puerta para excluir las celdas no clásicas, alineando la puerta con la parte inferior de los círculos concéntricos, que están completamente dentro de la puerta de monocitos clásica.
A puerta del subconjunto no clásico, dibujando un cuadro rectangular desde el borde inferior del subconjunto intermedio, seleccionando todas las celdas hasta la parte inferior de la población. En pantalla, seleccione Mostrar frecuencias de compuerta para determinar el porcentaje de cada subconjunto de monocitos. Por último, seleccione celdas de cada subconjunto de monocitos.
Modifique los parámetros desplegables para crear un histograma para cada subconjunto de monocitos, mostrando cada marcador. A continuación, calcule el grado de expresión, utilizando la mediana o la media geométrica, como se describe en el protocolo de texto. Las poblaciones de monocitos cerrados con éxito se muestran aquí.
Y las proporciones están en línea con las de la literatura. Las proporciones de esta muestra se calcularon como 88,1% clásica, 4,33%intermedios y 7,49% no clásicas. Al evaluar la posición relativa de otras poblaciones, está claro que las células T y neutrófilos mostrados aquí en azul, siguen muy fuera del monocitos, forma l invertida, en una gráfica CD16/CD14.
Sin embargo, tanto las células asesinas naturales como las poblaciones de células B, que se muestran aquí en azul, se solapaban con la población monocitos no clásica. Los mapas de calor que confirman que se han eliminado los tipos de células contaminantes se muestran aquí. Las células asesinas naturales han sido cerradas por el paso HLA-DR CD16, mientras que las células B han sido cerradas por el paso HLA-DR CD/14.
La expresión de los marcadores M1 y M2 en azul, en relación con sus controles de isotipo en rojo, se muestra aquí. CD120b un marcador M1, muestra un desplazamiento claro por encima de su control de isotipo, para todos los subconjuntos de monocitos. Este es también el caso de CD93 un marcador M2, con la expresión más alta en clásico, moderada en los intermedios y baja en no clásica.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que las celdas contaminantes están cerradas, ya que de lo contrario pueden contribuir a la expresión cuantificada. Después de este procedimiento, se pueden examinar otros marcadores. Para responder preguntas adicionales, como cómo cambia la expresión de marcadores de monocitos en la enfermedad.
No olvide que trabajar con sangre humana y formaldehído puede ser peligroso, por lo que siempre se deben tomar precauciones como, equipo de protección personal y el uso de una capucha de riesgo biológico, siempre deben tomarse al realizar este procedimiento.
