Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud de los números de adjudicación: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) y P30EY014104. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. El apoyo adicional fue proporcionada por el Fondo de Massachusetts Leonístico de Investigación (KMC) y un Premio Especial Académico de Investigación para la Prevención de la Ceguera (a KMC).

Todos los experimentos con animales se manejan de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y las directrices y normas establecidas por el Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comité de Cuidado de Animales. El día antes del experimento: 1. Preparación de la Tubería de la cámara de flujo <ol><li> Para preparar el lado yugular, conecte 1 cm tubo de polietileno PE10 a un tubo de silicio 6 cm, seguido de tubo de polietileno de 5 cm. Por el lado de la carótida, preparar de manera similar a la parte yugular con la adición de un tubo en T en el tubo de silicona 6 cm aproximadamente 1,5 cm de distancia del tubo de polietileno de 1 cm (Figura 1A, B). Con el fin de insertar el tubo en T, ampliar el tubo de silicona mediante el uso de unas pinzas finas si es necesario. </li><li> Conecte un extremo de 10 cm de tubo de silicona para el transductor de presión a continuación, inserte el extremo T del s carótidaide T-tubo en el otro extremo. Asegúrese de que la conexión de los sitios estén apretadas y sin fugas. Aplicar una pequeña pieza rectangular de Parafilm sobre el lugar donde el tubo encaja, si es necesario, para evitar fugas (Figura 1C). </li></ol> 2. El recubrimiento de la Cámara <ol><li> Preparar la proteína de revestimiento de la superficie endotelial (por ejemplo, P selectina, molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), vascular proteína-1 de adhesión celular (VCAM-1)) en 0,1% de BSA. Como pauta, 1 g de proteína en 200 l de BSA es suficiente para recubrir 4-5 cámaras. Usando una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 25 G, en infusión cada cámara (0,04 x 0,4 x 50 mm) con la proteína de recubrimiento de la superficie endotelial. Guarde las cámaras recubiertas en un tubo de 15 ml a 4 ° C durante la noche. </li></ol> El día del experimento: 3. Preparación de la Cámara <ol><li> Retire las cámaras revestidas de 4 ° C y conectar la tubería yugular y carótida para cada lado. Sellar las connections estirando con cuidado una pequeña pieza rectangular de parafina sobre el lugar donde la tubería cumple con la cámara. Con una jeringa, llenar la cámara y el tubo con 0,1% de BSA (compruebe si hay fugas). Incubar durante 45 min. </li><li> Preparar una placa de Petri de 35 mm para mantener la cámara mediante la reducción de muescas en cada lado del plato. Estabilizar la cámara en las muescas; a continuación, utilizar una pequeña gota de silicona para fijar la cámara al plato en el sitio dentada. Asegúrese de que la cámara está nivelada mirando bajo el microscopio. Deje que la silicona se seque por lo menos 15 minutos. </li><li> Llene una jeringa de 60 ml de bloqueo con heparina y conectar con el transductor de presión. Conectar el transductor de presión a la tubería de la carótida en el siguiente orden: Transductor, tubo de silicona, y T-tubo. <ol><li> Utilice un PE50 1 cm entre el tubo de silicona conectado al transductor y el tubo en T para asegurar la conexión. Pase el tubo de silicona de la arteria carótida a través de la pinza de presión (Figura 1D). Ejecute 100USP heparina excelentes referenciasugh el tubo y la cámara hasta que no queden burbujas de aire. </li></ol></li></ol> 4. Configuración del Software <ol><li> Para preparar el software, encienda la computadora, un microscopio y un dispositivo de laboratorio abierto. Haga doble clic en la aplicación suite de Leica (LAS) (o equivalente) y preparar una carpeta para guardar el video: ver → → adquieren película → definir secuencia de clips (clips = 15, tiempo de grabación = 30 seg, y los intervalos = 15 seg) a continuación, haga clic en el signo &quot;+&quot; para confirmar. </li><li> Para registrar la presión del flujo de abrir el LabChart (o equivalente) de archivos y coordinar el nombre del archivo a la carpeta de grabación en el paso 4.1, arriba. </li></ol> 5. Procedimiento Quirúrgico <ol><li> Anestesiar un 8-10 semanas de edad de ratón usando una combinación de ketamina (60 mg / kg) y xilazina (6 mg / kg) inyectado por vía intraperitoneal (IP). Confirme que la sedación profunda se logra dentro de 5 a 10 minutos por la pérdida de reflejo de retirada pedal. Si es necesario, isofluranoemitido a través de la mascarilla se puede dar cuando sea necesario. </li><li> Mientras que bajo anestesia, coloque una almohadilla de calentamiento debajo de la jaula y se puso a 37 ° C para mantener la temperatura corporal. Una vez confirmada la anestesia adecuada, coloque el ratón en una posición ventral y el abrigo de los ojos con el ungüento de bacitracina para evitar la sequedad ocular. </li><li> A partir de entonces, afeitar el pelo en el sitio de la incisión con una cuchilla de afeitar y limpiar a fondo el sitio con alcohol. </li><li> Una vez totalmente anestesiado asegurar el animal con cinta manteniendo el ratón en una posición ventral. Exponer la zona del cuello con unas tijeras y extirpar la glándula tiroides para exponer la tráquea y los vasos (Figura 2). </li><li> Limpie la arteria carótida hasta que esté totalmente expuesta con cuidado de no dañar el nervio vago (Figura 2B). Dobla un pedazo de sutura y pasar la curva debajo de la arteria carótida luego se corta en la curva por lo que ahora hay 2 piezas de sutura debajo de la carótida. Loop cada sutura en nudos (no apriete elnudos). </li><li> Repetir el mismo procedimiento para exponer la vena yugular izquierda (Figura 2C), la preparación de las suturas de la misma manera (Figura 2D). </li><li> Conecte el tubo a la vasculatura del ratón. <ol><li> Heparinizar el ratón mediante la inyección de 1 ml de heparina IP. </li><li> Apretar la sutura superior en la arteria carótida. Coloque la abrazadera buque un precio tan bajo como puede ir en la arteria carótida (Figura 3A). El uso de fórceps para mantener la arteria por la sutura superior y hacer una pequeña incisión, de aproximadamente 1/8 de la circunferencia de la arteria, utilizando las microtijeras (Figura 3B). </li><li> Pase el tubo de la arteria carótida a través de la segunda nudo en la sutura superior y en la incisión realizada en la arteria. Tie fuera de la sutura inferior de modo que la arteria se sella alrededor de la tubería (se deben hacer varios nudos para asegurar un sello hermético; Figura 3C). </li><li> Repita el mismo procedimiento para insertar el tubo vena yugular (el vasopinza no es necesario para el lado yugular; Figura 3D). </li><li> Pruebe el flujo por la liberación de la abrazadera del buque. Si no hay fugas de mover el ratón para el microscopio y conectar la tubería de la carótida y la vena yugular a la tubería de cámara (ver video adjunto para la demostración de procedimiento quirúrgico). </li></ol></li></ol> 6. Grabación del balanceo de velocidad <ol><li> Abra la abrazadera de la carótida para llenar la cámara, haciendo un circuito con el sistema circulatorio del ratón. Dejar que la sangre circule durante 3-5 minutos para que se estabilicen las condiciones de flujo. Durante el período de espera de 3-5 min, ajuste la platina del microscopio de manera que la cámara está a nivel de un extremo a otro con el objetivo del microscopio y su borde es paralelo a la ventana de grabación de vídeo en la pantalla. </li><li> Llene la placa de Petri modificado que contiene la cámara de vidrio con agua y luego bajar el objetivo de inmersión en agua 10 veces en el plato de manera que las células que fluyen a través de la cámara son visibles.La intensidad de la luz puede tener que ser ajustada para una visualización adecuada de las células. En general una menor intensidad es mejor. </li><li> Ajustar la pinza del tubo de modo que el transductor lee una constante 30 mm Hg, correlacionando a una presión de flujo fisiológico medio, o como se desee. </li><li> Pulse &quot;Inicio&quot; para iniciar la grabación tanto el video como la presión con el primer lapso de tiempo cerca del final yugular y en movimiento contra el flujo hacia el final de la carótida hasta que se complete. NOTA: Varias condiciones de revestimiento utilizando diferentes moléculas de adhesión pueden ser estudiados en el mismo ratón mediante el uso de múltiples cámaras. Sólo una de las cámaras se graba en un momento. <ol><li> Cuando se termina la grabación, cerrar la válvula en el sitio de entrada, detener el flujo de sangre. Retire la cámara y adaptarse a una nueva cámara (recubierto con una molécula de adhesión diferente) al circuito usando pinzas finas en una mano y fórceps ranurados en la otra mano. Reanudar la grabación de la nueva cámara como se indica en los pasos06.01 a 06.04. </li></ol></li><li> La eutanasia de todos los ratones por asfixia con CO2 seguida de una dislocación de la médula espinal al final del experimento. El procedimiento se terminal, por lo tanto, los ratones se sacrificaron mediante una dislocación de la médula espinal al final del experimento. </li></ol> 7. Interpretación de los resultados <ol><li> Para analizar los datos registrados utilizan el plugin &quot;M TrackJ&quot; para el software ImageJ 23. </li><li> Convertir el archivo en escala de grises Seleccione Archivo → Importar → → AVI convertir a escala de grises. </li><li> Estandarizar los marcos Seleccione → Imagen → → propiedad por entrar en los intervalos de la trama (i) → global. Calcular los intervalos de la trama dividiendo la duración total de vídeo (normalmente 30 segundos) por el número de fotogramas en un vídeo (que se muestra en la esquina superior de la ventana de vídeo J Image). </li><li> Medir el flujo de cada leucocitos por Seleccione el plugin → M TrackJ → Añadir pistas → seleccione un leucocito→ Seguir con cada fotograma durante 15 - 20 segundos → Fusionar. </li><li> Repita el paso 7.4 para todos los leucocitos a la vista. </li><li> Determinar la velocidad media rodar de los leucocitos de Select medida → dos columnas aparecen → Copiar todo de la M TrakJ: Orugas en una hoja de cálculo. La columna titulada &quot;V significar&quot; es la de leucocitos de rodadura medido en píxeles / segundo. Convertir en m / seg dividiendo por 2/3. </li><li> Para analizar el punto culminante de datos de presión y exportación en una hoja de cálculo y realizar el siguiente cálculo:? P (mm Hg) y t (dinas / cm 2) para una comparación entre cada grupo experimental. Una vez calculado, copie los datos en el software de prisma para su representación gráfica. </li></ol>

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The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

El proceso de reclutamiento de leucocitos es un paso crucial en la respuesta inflamatoria; que implica la migración de los leucocitos desde el sistema circulatorio hacia los tejidos diana, donde son capaces de ejercer su función efectora. El reclutamiento de leucocitos es integral en una variedad de condiciones inflamatorias, tales como las placas ateroscleróticas, infarto de miocardio, isquemia / reperfusión, y la cirugía de trasplante 1, así como múltiples condiciones neuro-inflamatorias relacionadas con el SNC 10-12,20,24,25. Teniendo en cuenta la diversidad de las condiciones de la enfermedad que se extiende por el reclutamiento de leucocitos, la cámara de microflujo autoperfused proporciona una herramienta indispensable que permite al investigador la posibilidad de estudiar la dinámica de migración de leucocitos. Durante las últimas décadas, una variedad de ensayos in vitro se han desarrollado para estudiar la dinámica de la adhesión celular de leucocitos 26. Desafortunadamente, todos estos ensayos requieren la extracción delos leucocitos de la sangre, la introducción de activación mecánica. Para acercarnos al entorno in vivo, se hicieron adaptaciones para recoger muestras de sangre entera y controlar las condiciones de flujo hemodinámico 16,17. Este sentido, ampliar los avances previos en el campo mediante la vinculación de una cámara recubierta con el sistema circulatorio del ratón. Somos capaces de regular el flujo de la sangre a un rango fisiológico y estudiar la dinámica de leucocitos de rodadura. La cámara recubierta nos da la capacidad para estudiar las interacciones de leucocitos con las moléculas de adhesión específicas. Dado que el sistema está funcionando como una unidad operada por un ratón vivo, imita más de cerca el entorno natural, que nos permite estudiar las interacciones leucocito-endotelial en una variedad de modelos inmunológicos ratón. Además, este sistema nos permite tomar ventaja de los múltiples modelos de ratón genéticos disponibles. Mientras que el sistema no se replica completamente el entorno in vivo, proporciona una plataforma para estudiar específic elementos de los leucocitos en condiciones fisiológicas, una hazaña que no ha sido posible anteriormente. A pesar de que esto nos lleva un paso más cerca de un entorno más fisiológica existen limitaciones en el sistema. No replicar completamente la matriz 3D complejo de la vasculatura tan sólo somos capaces de evaluar ciertos elementos de las interacciones de leucocitos que están restringidas a la capa de la cámara. Además, el gran cuidado se debe tomar para garantizar un sistema cerrado a la circulación del ratón siguiendo todos los pasos mencionados en el protocolo. La introducción de burbujas de aire afectará en gran medida la precisión y la reproducibilidad de los experimentos. Mientras que se describe el uso de la cámara de Autoperfused Microflow para evaluar la dinámica de leucocitos de rodadura el procedimiento tiene el potencial para ser personalizados por los investigadores para estudiar una variedad de enfermedades. Por ejemplo, las células cancerosas metastatizan mediante la expresión de muchas de las integrinas comunes compartidos por los leucocitos. Studying sus dinámicas rodantes en un entorno que imita más de cerca un entorno in vivo podría ayudar en el conocimiento, y, posiblemente, la predicción, de la naturaleza invasiva de ciertas células cancerosas. Un posible enfoque podría ser combinar una técnica de etiquetado para las células cancerosas, tales como GFP 27, junto con el ensayo de cámara de flujo para rastrear la dinámica de rodadura de las células cancerosas que expresan GFP. Dada la flexibilidad del recubrimiento de la cámara con una variedad de sustancias y la conexión de múltiples cámaras para el mismo ratón será interesante ver cómo se modifica este procedimiento para su uso en otros laboratorios en combinación con ratones genéticamente modificados y modelos de enfermedad. La técnica descrita aquí sólo toca un potencial de aplicación mucho más amplio que sólo está limitado por la creatividad del investigador.

La inflamación es la respuesta universal del cuerpo a la lesión y es un paso crucial tanto en la función del sistema inmune innato y adaptativo. En respuesta a una lesión y / o estímulos inflamatorios, las células endoteliales upregulate moléculas de adhesión específicas; esto conduce a la extravasación de leucocitos a través del endotelio microvascular, principalmente en las vénulas capilares de correos. Este proceso se inicia con la inmovilización de los leucocitos de flujo libre en el torrente sanguíneo en el endotelio. Laminación estable y firme adhesión de los leucocitos, que a su vez conduce a la transmigración y la secreción de agentes citotóxicos, siguen este tethering 1,2. Las selectinas son conocidos para mediar en los primeros pasos de la cascada de 3-5; integrinas son responsables de las etapas posteriores de la adhesión firme y la transmigración 1,6-8. Un creciente cuerpo de evidencia sugiere leucocitos y moléculas de adhesión endoteliales tienen un papel vital en modelos animales de lesión por isquemia y reperfusión, Asma, psoriasis, esclerosis múltiple, y la degeneración macular relacionada con la edad 9-12. En estas condiciones, la respuesta inflamatoria está mal dirigido a atacar al propio cuerpo, lo que resulta en el desgaste del tejido sano. Agentes antiinflamatorios existentes (como los medicamentos no esteroides antiinflamatorios, corticosteroides u otros agentes quimioterapéuticos) conllevan el riesgo de efectos secundarios graves con el uso a largo plazo 13. Por lo tanto, es de gran interés contar con las herramientas adecuadas, con la capacidad de identificar moléculas específicas de la enfermedad, que en última instancia puede ser objetivo de tener el efecto antiinflamatorio deseada sin dejar de ser no tóxicos 14. Existente en métodos in vitro, como el ensayo de adhesión de leucocitos estática fueron utilizados ya en 1976 15. La cámara de flujo paralelo se utilizó por primera vez en vitro en 1987 para estudiar las interacciones leucocito-endotelio en condiciones de flujo. En estos experimentos, estimulado human leucocitos polimorfonucleares (PMN) a partir de sangre venosa fueron perfundidos sobre una monocapa de células humanas primarias endoteliales de vena umbilical (HUVEC). Para el control de las condiciones de flujo hemodinámico, la bomba de jeringa Harvard Apparatus 16 fue empleado. Alternativamente, para evitar el aislamiento leucocitos artificial, se utilizó sangre completa en combinación con la cámara de vidrio recubiertas con las moléculas de adhesión inmovilizados 17. Para evitar la estimulación de leucocitos y para estudiar mecánicamente su interacción con las moléculas de adhesión en condiciones fisiológicas aproximadas, un ex vivo autoperfused, extracorporal, circuito arteriovenoso se desarrolló 16. En este circuito, la sangre fluye entre la arteria carótida común derecha y la izquierda de la vena yugular externa de un ratón vivo bajo anestesia, lo que permite la interacción de los PBL nativas dentro de una cámara microflujo de vidrio recubiertas con las moléculas de adhesión individuales o co-inmovilizada. Una de las principales ventajas de este system es la capacidad de emplear ratones genéticamente modificados, en los que se manipulan las vías inflamatorias directa o indirectamente. Además, existe la posibilidad de determinar la contribución aislada de moléculas de adhesión de leucocitos a la inflamación, libre de activación externa, bajo condiciones de flujo. La aplicación de un regulador de flujo en el punto de entrada de la cámara de flujo ofrece una amplia gama de variaciones experimentales de las fuerzas de cizallamiento para imitar ya sea sistemas venosos 18-22 arterial o. Aquí se describe con gran detalle un protocolo relativo a la preparación y realización de la cámara de ensayo vivo autoperfused ex microflujo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Interacciones leucocito-endotelial son los primeros eventos y críticos en la inflamación aguda y crónica y pueden, cuando se desregula, mediar lesión tisular que conduce a daños patológicos permanente. Ensayos convencionales existentes permiten el análisis de moléculas de adhesión de leucocitos sólo después de la extracción de leucocitos de la sangre. Esto requiere la sangre que someterse a varios pasos antes de leucocitos de sangre periférica (PBL) pueden estar listos para el análisis, que a su vez puede estimular PBL que influyen en los resultados de la investigación. El ensayo de cámara de flujo micro autoperfused, sin embargo, permite a los científicos estudiar primeras leucocitos desregulación funcional utilizando el flujo sistémico de un ratón vivo mientras que teniendo la libertad de manipular una cámara recubierta. A través de un modelo de la enfermedad, la expresión funcional de las moléculas de adhesión de leucocitos puede ser evaluado y cuantificado en una cámara de micro-vidrio recubierto con moléculas de adhesión endotelial inmovilizados ex vivo. En este modelo, la sangre fluyeentre la arteria carótida común derecha e izquierda de la vena yugular externa de un ratón vivo bajo anestesia, lo que permite la interacción de los PBL nativos en la cámara. Análisis experimental en tiempo real se logra con la ayuda de un microscopio intravital, así como un dispositivo de presión Harvard Apparatus. La aplicación de un regulador de flujo en el punto de entrada de la cámara de vidrio permite condiciones de flujo fisiológicas comparables entre los experimentos. La velocidad de rodadura de leucocitos es el resultado principal y se mide utilizando los Institutos Nacionales de Salud software de acceso abierto ImageJ. En resumen, el ensayo de cámara de flujo micro autoperfused proporciona un entorno fisiológico óptimo para estudiar la interacción leucocitos endotelial y permite a los investigadores sacar conclusiones precisas al estudiar la inflamación.

<html> Durante cada grabación leucocitos sólo interactúan son evidentes en la cámara. Los resultados de un experimento representativo se pueden ver en la Figura 4. Las flechas blancas indican leucocitos individuales que fueron capturados por la molécula de adhesión de interés y están rodando a lo largo de la cámara, entre otros de flujo libre dentro del flujo sanguíneo. Un artefacto común fuera de la cámara se puede ver con las grandes esferas oscuras en todas las imágenes. Las esferas oscuras ayudan al lector apreciar el movimiento de leucocitos en relación a un punto fijo. Los leucocitos avance durante un período de 22 seg se puede ver en relación con las esferas. El gráfico en la misma figura muestra un gráfico final de los datos, donde Tx1 disminuye la velocidad de rotación (un giro a la izquierda) y Tx2 aumenta la velocidad (un giro a la derecha) en comparación con el control. 0 &quot;/&gt; Figura 1: Preparación de tubos para la cámara de flujo. (A) Herramientas necesarias para la tubería y conjunto de cámara (cámara de vidrio micro 0,4 x 0,04 x 50 mm, polietileno tubería PE10, PE60 tubería de polietileno, tubo de silicona 002, tubo y, t de tubo, 35 mm placa de Petri, pinzas finas, finas tijeras, soporte de tubo, pinza vascular, sutura de seda 7-0. (B) Preparación de la arteria carótida y la tubería de la vena yugular para la re-dirigir el flujo de la sangre del ratón a través de la cámara de recubrimiento. (C) Conexión de la tubería de arteria carótida para el transductor de presión. (D) Pase el tubo del transductor a través de la abrazadera para ajustar la velocidad del flujo sanguíneo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> Figura 2:. La exposición de la arteria carótida y la vena yugular (A) cortar cuidadosamente la zona del cuello para exponer la tráquea (B) Limpiar la arteria carótida derecha de modo que un trozo de sutura se puede pasar por debajo de la vasija (punteado amarillo. línea describe la arteria carótida). (C) Limpie la vena yugular izquierda para que un pedazo de sutura se puede pasar bajo el buque (línea amarilla punteada esboza la vena yugular). (D) Se encargará vagamente unida suturas en las zonas superior e inferior de la arteria carótida y la vena yugular (las flechas indican las regiones superior e inferior de los vasos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Figura 3: Conexión de la tubería a tque la arteria carótida y la vena yugular. (A) Apriete el nudo superior en la carótida y coloque la abrazadera debajo del nudo inferior. (B) Uso de las micro tijeras, hacer una pequeña incisión en la carótida, alrededor de 1/8 de la circunferencia (círculo amarillo de puntos indica la incisión). ( C) Inserte la tubería en la carótida y seguro con al menos dos suturas (línea punteada verde muestra el tubo y la línea de puntos de color amarillo de la arteria carótida). (D) Del mismo modo insertar la tubería en la yugular (línea punteada verde muestra la tubería y la amarillo línea de puntos la vena yugular). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Figura 4: evolución temporal Representante de leucocitos de rodadura a través del cham flujober (barra de escala = 100 micras) (puntas de flecha blancas señalan los leucocitos de rodadura). Gráfico muestra resultados representativos después de la exportación en un programa de gráficos (Tx1 y Tx2 son grupos de tratamiento experimental y CTR es el grupo de control). Tx1 representa un tratamiento en el cual los leucocitos ralentizar conduce a una disminución en los leucocitos velocidad y un desplazamiento a la izquierda de la gráfica en comparación con el grupo no tratado (CTR) de laminación, mientras que Tx2 conduce a un desplazamiento a la derecha refleja un aumento en los leucocitos velocidad de rodadura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

A continuación, presentamos un protocolo que permite al investigador evaluar la dinámica de reclutamiento de leucocitos ex vivo mediante la conexión de una cámara recubierta con moléculas de adhesión endoteliales derivado al sistema circulatorio de un ratón. Este método ofrece ventajas significativas ya que permite la evaluación de leucocitos en condiciones biológicas relativas.

La evaluación de las interacciones leucocito-endotelio en condiciones de flujo en un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ensayo Autoperfused Cámara Microflow

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

assessing-leukocyte-endothelial-interactions-under-flow-conditions-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

9.5K vistas.  Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary.  A continuación, presentamos un protocolo que permite al investigador evaluar la dinámica de reclutamiento de leucocitos ex vivo mediante la conexión de una cámara recubierta con moléculas de adhesión endoteliales derivado al sistema circulatorio de un ratón. Este método ofrece ventajas significativas ya que permite la evaluación de leucocitos en condiciones biológicas relativas. 

Video: Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Investigación

Bioingeniería

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo perfusión placentaria humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Un dispositivo de cámara de flujo tridimensional Novel para el Estudio de quimioquinas-dirigida extravasación de células circulantes en condiciones de flujo fisiológicas

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingeniería de tejidos por intrínseca Vascularización en una<em&gt; En Vivo</em&gt; Cámara Ingeniería de Tejidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Un método automatizado para realizar el ensayo de micronúcleos In Vitro mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

In Vitro 3D Cultivos Celulares Modelos Arteriales Para El Estudio De La Droga Vascular Dirigida Bajo Flujo

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Un sistema microfisiológico para estudiar la interacción leucocitario-endotelial durante la inflamación

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

Medición in vivo resuelta en el tiempo de la dinámica de neuropéptidos mediante inmunosonda capacitiva en corazón porcino

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by scoring MN in once-divided, cytokinesis-blocked binucleated cells or fully divided mononucleated cells. Historically, light microscopy has been the gold standard method to score the assay, but it is laborious and subjective. Flow cytometry has been used in recent years to score the assay, but is limited by the inability to visually confirm key aspects of cellular imagery. Imaging flow cytometry (IFC) combines high-throughput image capture and automated image analysis, and has been successfully applied to rapidly acquire imagery of and score all key events in the MN assay. Recently, it has been demonstrated that artificial intelligence (AI) methods based on convolutional neural networks can be used to score MN assay data acquired by IFC. This paper describes all steps to use AI software to create a deep learning model to score all key events and to apply this model to automatically score additional data. Results from the AI deep learning model compare well to manual microscopy, therefore enabling fully automated scoring of the MN assay by combining IFC and AI.

The micronucleus (MN) assay is a well-established test for quantifying DNA damage. However, scoring the assay using conventional techniques such as manual microscopy or feature-based image analysis is laborious and challenging. This paper describes the methodology to develop an artificial intelligence model to score the MN assay using imaging flow cytometry data.

Automatización del ensayo de micronúcleos mediante citometría de flujo de imágenes e inteligencia artificial

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...