Las interacciones entre leucocitos y células endoteliales juegan un papel importante en enfermedades inflamatorias como la sepsis. La desregulación de la inflamación a menudo causa alteración de la función de barrera del endotelio vascular y tráfico excesivo de leucocitos, lo que puede provocar daños en los órganos. El ensayo microfluídico biomimético, lo que llamamos bMFA, reproduce la topografía y las condiciones de flujo de las redes microvasculares in vivo y permite la evaluación en tiempo real del laminado, la adhesión firme, la propagación y la migración de neutrófilos al compartimiento tisular.
Una fortaleza del ensayo microfluídico biomimético es la capacidad de utilizar células humanas primarias y muestras de pacientes clínicamente relevantes para aumentar la traducción clínica y detectar rápidamente posibles terapias. Demostrando los procedimientos estará el Sr. Qingliang Yang, un asistente de investigación graduado de mi laboratorio. Comience a insertar el tubo de aproximadamente una pulgada de longitud dentro de los puertos utilizando fórceps finos, a excepción de un puerto de entrada.
Usando abrazaderas de mandíbula, sujete los dos puertos de salida y el compartimiento de tejido juntos. Diluya la solución madre de fibronectina a 100 microgramos por mililitro con PBS. Cargue una jeringa de un mililitro conectada a una aguja roma de calibre 24 con la solución de fibronectina diluida y conecte la jeringa a un tubo de cuatro pulgadas de largo.
Inserte el tubo en el puerto de entrada abierto, luego empuje el émbolo hasta que la fibronectina humana se libere de otro puerto de entrada y sujete. Repita el proceso para los puertos restantes hasta que todos los canales, el compartimento de tejido y el tubo se llenen con la solución de fibronectina humana. Retire la aguja, pero mantenga el tubo de cuatro pulgadas de largo insertado y sin enganchar.
Para realizar la desgasificación, conecte el tubo sin enganchar al cebador neumático conectado a un tanque de nitrógeno comprimido con una presión de cinco libras por pulgada cuadrada durante 15 minutos. Bajo el microscopio, verifique que no haya burbujas de aire atrapadas dentro del canal o compartimiento de tejido y vuelva a conectar el dispositivo si las burbujas de aire están presentes. Retire el dispositivo de la imprimación neumática e incube a 37 grados centígrados durante una hora.
Utilizando medios de cultivo de células endoteliales microvasculares de pulmón humano precalentados, enjuague todos los canales y el compartimiento de tejido. Después de cosechar las células endoteliales como se describe en el manuscrito de texto, peletizar las células por centrifugación durante cinco minutos a 150 veces G.In la bomba de jeringa programable, montar una jeringa de un mililitro y conectar el tubo a la aguja roma. Extraiga aproximadamente 20 microlitros de la suspensión celular en el tubo sin dejarla entrar en el barril de la jeringa.
Retire la abrazadera del puerto de salida del dispositivo. Conecte el tubo al puerto de entrada sin introducir ninguna burbuja de aire en el canal. Detenga la bomba con un caudal de cuatro a ocho microlitros por minuto y observe bajo el microscopio.
Detenga la bomba cuando los canales estén llenos de células. Sujete la salida y corte el tubo de entrada. Coloque el dispositivo en la incubadora durante cuatro horas al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados.
Después de cuatro horas de incubación, prepare otra jeringa y llénela con medios de cultivo celular frescos. Monte la jeringa en una bomba de jeringa y conéctela al puerto de entrada. Retire la abrazadera del puerto de salida.
Pase los medios frescos a través del dispositivo durante unos cinco minutos a cuatro a ocho microlitros por minuto para eliminar las células flotantes o no unidas. Prepare una jeringa llenándola con medios de cultivo celular frescos. Monte la jeringa en una bomba de jeringa y conéctela a un puerto de entrada mientras mantiene abierto el puerto de salida.
Coloque el dispositivo en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Programe la bomba de jeringa para el cultivo de células endoteliales bajo flujo como se describe en el manuscrito de texto. Con un microscopio, verifique el bMFA después de 48 horas de cultivo bajo flujo.
La microscopía confocal indicó que todas las superficies de los canales vasculares estaban cubiertas por células endoteliales, formando un lumen 3D completo en bMFA. Después de preparar tres dispositivos bMFA diferentes, cargue tres jeringas de un mililitro con medios de cultivo celular o TNF-alfa o TNF-alfa combinados con inhibidor delta de PKC respectivamente, donde se utiliza TNF-alfa y citoquina inflamatoria para estimular las células endoteliales y los neutrófilos. El inhibidor delta de PKC es un nuevo inhibidor antiinflamatorio.
Conecte las tres jeringas cargadas a tres dispositivos bMFA. Usando TNF-alfa tampón o TNF-alfa con inhibidor añadido, trate las células endoteliales microvasculares del pulmón humano durante cuatro horas a 0,1 microlitros por minuto. Después de aislar los neutrófilos humanos como se describe en el manuscrito de texto, resuspenda los neutrófilos en 999 microlitros de tampón HEPES y agregue un microlitro de solución madre de colorante CFDA SE 10 milimolar a la suspensión, lo que resulta en una solución de trabajo de 10 micromolares de CFDA SE e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Lave las células dos veces con el tampón HEPES centrifugando la solución durante cinco minutos a 315 veces G.Después de contar las células, resuspenda a 2 millones de neutrófilos por mililitro en medios de cultivo celular o TNF-alfa o TNF-alfa agregado con inhibidor delta de PKC e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Llene la jeringa con un micromolar de un quimiotrato, fMLP, preparado en medios de cultivo celular. Abra un puerto de entrada y un puerto de salida del bMFA.
Retire el tubo de puerto del compartimento de tejido e inserte el tubo fMLP. Inyectar aproximadamente 20 microlitros de fMLP en el compartimento tisular para todos los bMFA, dejando el tratado con medios de cultivo celular. Cortar el tubo y sujetarlo.
Rellene la jeringa con aproximadamente 200 microlitros de suspensión de neutrófilos y monte la jeringa en la bomba de la jeringa. Después de colocar el dispositivo en un escenario de microscopio invertido, ajuste el caudal a un microlitro por minuto y encienda la bomba. Espere hasta que una pequeña gota de la suspensión de neutrófilos salga del tubo e inserte el tubo en el puerto de entrada.
Los neutrófilos marcados fluorescentemente fluyen hacia los canales vasculares e interactúan con las células endoteliales y las condiciones de flujo fisiológicamente relevantes. Después de 10 minutos de comenzar el experimento, abra el software de análisis de imágenes, cambie la lente del objetivo a 10x y use el joystick del escenario para centrar el dispositivo debajo del microscopio. Para obtener el mapa de adhesión, vaya a Adquirir, haga clic en Escanear imagen grande.
Aparecerá una nueva ventana. Elija la lente de objetivo 10x y configure la opción de campo, por ejemplo, 5 por 3. Haga clic en Escanear, haga clic en Archivo y guarde el mapa de adhesión.
Para obtener el mapa de migración para el análisis de migración, centre el dispositivo bajo el microscopio utilizando el joystick de escenario. Haga clic en Ver, Controles de adquisición, Adquisición de ND. Aparecerá una nueva ventana.
Establezca la ruta de acceso para guardar el archivo y escriba el nombre del archivo. Marque la función Imagen grande, configure Área de escaneo, por ejemplo, 5 por 3. Compruebe la función Tiempo, establezca el Intervalo como cinco minutos y la Duración como 60 minutos.
Tome imágenes de lapso de tiempo del compartimiento de tejido, con una imagen tomada cada cinco minutos durante la siguiente hora. La simulación CFD muestra el patrón de flujo laminar en los canales vasculares, excepto en las áreas de bifurcación donde se altera el patrón de flujo. Después de realizar el ensayo biomimético de microfluidos, las imágenes de contraste de fase revelaron que las superficies de los canales vasculares estaban cubiertas con células endoteliales y alineadas en la dirección del flujo de cizallamiento después de 48 horas de cultivo.
Se realizó una imagen de fluorescencia mediante microscopía confocal, indicando que las células endoteliales forman una luz tridimensional completa en bMFA Se obtuvo un mapa de adhesión de neutrófilos, que reveló que existe una adhesión significativa de neutrófilos a las células endoteliales en bMFA. El mapa de migración de neutrófilos en bMFA reveló que tras la activación de TNF-alfa, se produce una migración considerable de neutrófilos dentro del compartimento tisular, mientras que no se observó tal migración sin la activación de TNF-alfa. Un mapa de adhesión que correlaciona la distribución espacial de los neutrófilos con la tasa de cizallamiento demostró que la adhesión de neutrófilos se produjo preferentemente en vasos con baja tasa de cizallamiento y regiones cercanas a la bifurcación.
Además, el tratamiento con TNF-alfa aumenta significativamente la adhesión, que se inhibió con el inhibidor delta de PKC. El análisis de imágenes de lapso de tiempo indicó que la activación del TNF de las células endoteliales aumenta la migración de neutrófilos en respuesta a fMLP, mientras que el tratamiento con el inhibidor delta de PKC redujo la migración en comparación con las células tratadas con TNF-alfa. Por lo tanto, bMFA se puede utilizar para probar la eficacia de una nueva terapéutica para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria.
El bMFA también se puede utilizar para estudiar la integridad del endotelio midiendo variables como la permeabilidad y la resistencia eléctrica transendotelial, lo que se llama TEER y la expresión de la molécula de adhesión durante la inflamación. El ensayo microfluídico biomimético puede imitar el microambiente de diferentes órganos y no se limita a tipos o especies de células individuales, y también puede modelar la comunicación célula/célula crítica para la función de los órganos y el modelado de diferentes enfermedades.
