We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

Los métodos presentados aquí proporcionan una herramienta para generar una evaluación exhaustiva de la dinámica viral y microbiana en los ecosistemas acuáticos. Están dirigidos a cuantificar la biomasa de los recursos orgánicos e inorgánicos disponibles para las comunidades microbianas y para caracterizar la composición de la comunidad microbiana y viral presente. Junto a la cuantificación de la abundancia viral y la abundancia de biomasa microbiana y, información de la secuencia genómica revela su estructura y función de la comunidad. Todos los métodos han sido desarrollados o modificados para permitir la aplicación de campo en lugares remotos. Sin embargo, la falta de ajustes de laboratorio controladas crea inherentemente alguna posibilidad de errores. Aquí hablamos de algunas advertencias asociadas a cada uno de los parámetros evaluados. Junto al potencial de contaminación durante la manipulación de muestras algunos de los parámetros también el potencial de rendimiento para el error en el proceso analítico. Carbono orgánico disuelto La contaminación de carbono puede ocurrir durante los procedimientos de muestreo (muestreo de aguas abajo, o en las proximidades de un barco o un buceador), durante la preparación de la muestra (contaminación del equipo o la manipulación inadvertida), e incluso durante el almacenamiento de la muestra (otras muestras en el congelador que contiene orgánica disolventes volátiles /). Para evitar las diversas fuentes de contaminación conducta tan pocos pasos de manipulación como sea posible, ya que cada muestra de reubicación plantea una fuente adicional de contaminación. La muestra no debe ponerse en contacto con cualquier elemento no ácido se lava o se quema. Por último, la designación de un congelador de almacenamiento exclusivamente para muestras que no contengan sustancias orgánicas volátiles se asegurará la integridad de las muestras durante períodos de almacenamiento más largos. Si las muestras no pueden mantenerse congeladas durante un periodo de tiempo prolongado acidificación de las muestras de DOC con HCl concentrado (como se describe 38-41) puede ser una alternativa aplicable. Para verificar los materiales de referencia DOC consenso exactitud de medición se deben utilizar regcialmente durante la medición DOC ejecuta. Especialmente de agua de mar profundo (&gt; 2.000 m) las referencias son valiosos para evaluar el rendimiento de la máquina analítica, ya que es muy estable en su contenido DOC 42. Materia orgánica particulada Además de evitar la contaminación de carbono orgánico, el muestreo POM requiere una atención especial para garantizar la exactitud del volumen filtrado. Si el volumen específico de 500 ml debería desviarse por cualquier razón potencial que este necesita ser observado para relacionar la cantidad de POM capturado en el filtro para el filtrado de los cuales se deriva. Los nutrientes inorgánicos Al igual que con el muestreo de carbono orgánico, se debe prestar atención a la posible contaminación de la muestra de nutrientes generada por diversas fuentes como barcos o descargas de aguas residuales 12. Los filtros utilizados para el muestreo de carbono orgánico con un valor nominal de tamaños de poro de 0,8 micras, no pueden excluir toda la biomasa microbiana y shpor lo tanto, ould ser cambiado a 0,2 micras filtros para esta etapa de filtración. Además, los límites de detección plantean un problema con muestras de nutrientes; especialmente en las aguas superficiales oligotróficas alrededor de muchos lugares de arrecifes de coral (por ejemplo, Cotner et al., 43). Los límites de detección son más o menos alrededor de 0,1, 0,2, y 0,1 mol / L para el amonio, nitrato y nitrito, y orto-fosfato, respectivamente (ver 36,12,37) Microscopía Además de las variaciones en la concentración de análisis de imágenes de microscopía de muestras a partir de diapositivas aún más los rendimientos potencial de errores. Por ejemplo, las imágenes pueden estar fuera de foco en algunas zonas del campo de visión, y en el enfoque en otros. Como un filtro de matriz de alúmina de alta pureza es un tipo de filtro muy rígido, cualquier residuo bajo el filtro puede hacer que todo el filtro para sentarse en un ángulo a la diapositiva. Como resultado, las imágenes pueden ser consistentemente fuera de foco en diversas partes del campo de visión para un filtro dado, reindependientemente de la alineación microscopio. Volver a montar los filtros, asegurando la parte inferior del filtro está limpio, puede mejorar esta si se observa. También, en algunos casos puede haber dos planos focales en los que los virus y los microbios se pueden encontrar. Este es el resultado de los objetos manchados se desprenda desde el filtro al montar, y que flotan hasta la parte inferior de la hoja de la cubierta que puede hacer que los recuentos de poco fiable. Por lo tanto siempre es recomendable para comprobar la calidad de las muestras durante el proceso. Citometría de Flujo Al igual que con las muestras de microscopía, puede ser de origen natural diferencias entre las muestras de citometría de flujo que requieren ajustes del proceso analítico. Por ejemplo, dependiendo de la sensibilidad del instrumento, débilmente las células fluorescentes Prochlorococcus pueden estar por debajo del nivel de ruido y no serán cuantificados. Beads sirven como un control interno de la muestra (por ejemplo, para confirmar que resp del instrumentoOnse a las señales fluorescentes es consistente día a día (y se mantiene estable durante el mismo plazo). Si se añade a la muestra a concentraciones conocidas, también pueden servir como un control interno para verificar el funcionamiento volumen de muestra. Sin embargo, se recomienda ejecutar siempre una parte alícuota de una muestra de agua de mar previamente congelado &quot;estándar&quot; que se descongeló y se tiñeron junto con las muestras de interés para proporcionar un control biológico adicional para el manejo de entre las corridas de placa de 96 pocillos de muestra. Dependiendo de la ubicación, las muestras de agua de mar puede parecer muy diferentes entre sí. Clasificación poblaciones &quot;representativas&quot; y luego ver bajo un microscopio de epifluorescencia (EM) puede ser una buena manera de verificar rápidamente las poblaciones de fitoplancton, ya sea como Synechococcus sp. O eucariotas fotosintéticos. Prochlorococcus células normalmente no son visibles bajo EM porque se desvanecen demasiado rápido. Además de clorofila a, Synechococcus sp. Contener también el phphycoeurythrin otopigment (PE), que emite luz en longitudes de onda más cortas (540 a 630 nm) que la clorofila A (660-700 nm). Cuando las células Synechococcus se excitan con luz azul / verde (470-490 nm), aparecerán de oro si se observa bajo un filtro de emisión que elimina todas las longitudes de onda de la luz por debajo de 510 nm. En comparación, la fracción eucariótica se verá de color rojo, cuando se excitan con la misma longitud de onda de la luz. La metagenómica viral Es importante señalar que el proceso de concentración y el almacenamiento VLP influye en la comunidad recuperado. Pérdida partícula viral puede ocurrir en cada paso en el proceso, y por lo tanto, la selección de los protocolos de purificación y enriquecimiento virales puede afectar en última instancia la composición taxonómica observada y la diversidad de los metagenomes virales resultantes 44,45,18. Concentración de las muestras se puede hacer usando TFF 19 o basada en productos químicos de floculación 20. En el enfoque de base química, positvamente cargada iones de hierro se unen las partículas virales, naturalmente, con carga negativa que forman (&gt; 8 micras) complejos de hierro viral grandes que floculan de la solución y pueden ser recuperados utilizando 8 micras filtros. Posteriormente, el hierro está quelado fuera de las partículas virales y re-disolvió utilizando magnesio, ácido ascórbico, y EDTA, dejando partículas virales concentradas para la extracción de ácido nucleico 20. Después de la comparación de estos dos métodos actuales, llegamos a la conclusión de que el método del cloruro de hierro es menos tiempo que la concentración viral TFF, pero puede producir algunas advertencias. Se encontró que la disociación y la disolución del hierro-viral requiere una dos veces solución de magnesio-ácido ascórbico-EDTA más concentrada que informaron 20 con el fin de proceder para la disolución antes de que se degrada el ácido ascórbico. Aparte de esta cuestión, el protocolo purifica partículas virales por tamaño-fraccionamiento solo, la eliminación de contaminantes microbianos utilizando 0,2 micras de filtración. Virus grandes no pasan por el filter (por ejemplo, Yang et al. 46) y que por lo tanto no ser detectado en el metagenoma, mientras que algunas bacterias hacen (McDole, datos no publicados). Esto da lugar a la contaminación bacteriana, mientras que discriminar a los grandes virus. Esta cuestión específica sin embargo, también es relevante para la eliminación de microbios en relación con la concentración de TFF. Como se ha demostrado el tratamiento cloroformo para eliminar virus-cloroformo sensible con las membranas lipídicas externas 47 algunos estudios sugieren que 0,22 micras de filtración puede ser utilizado para eliminar la mayoría de las bacterias. También hay que señalar que el método presentado se dirige principalmente a bacteriófago, el más abundante portador de material genético en ambientes marinos. Debido a fagos se piensa generalmente que no contienen lípidos comúnmente 48 que son más resistentes al tratamiento cloroformo. A nuestro entender un método &quot;catch-all&quot; no existe hasta la fecha. El método que aquí se presenta es una adaptación del ouexperiencia de campo r en los últimos 10 años en diversos ambientes marinos tropicales que abarcan a los sistemas árticos. Microbiana metagenómica La construcción de bibliotecas metagenomic para los microbios (es decir, bacterias y arqueas) es más sencillo que metagenomes virales, ya que es más fácil de generar las concentraciones mínimas de ADN necesarios para la preparación de la biblioteca. Linker amplificación escopeta bibliotecas (LASLs) amplificación 17,49,50 y todo el genoma basado en la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) son los dos métodos más comúnmente utilizados para generar suficiente ADN para la secuenciación. El uso de MDA para obtener concentraciones más altas de ADN en metagenomes microbianas veces es necesario. Sin embargo, esto puede causar artefactos en los datos de secuencia, como la sobreamplificación de minicircles de dinoflagelados. Métodos de MDA son conocidos para amplificar preferentemente ADN monocatenario y circular, resultando en resultados no cuantitativos 51,52. Los LASLs optimizados se acercan a 50 puede por lo tanto sirve como una alternativa mejor en la amplificación de tanto microbiana y el ADN viral metagenomic para la secuenciación. Es importante señalar que el enfoque LASLs tiene múltiples pasos, requiere un equipo sofisticado, y se limita a plantillas de ADN de doble cadena. Además, el kit de extracción de ADN de tejidos se ha demostrado para extraer el ADN de ambos filos negativa Gram positivas y Gram, pero no ha sido verificada a taxones microbianos efectivamente lisis recalcitrante o sus estructuras asociadas (por ejemplo, seguro de arqueas, endosporas, o esporas de hongos) . Por lo tanto, puede ser necesario un paso paliza de cuentas para obtener el ADN de ciertos microbios. Estas evaluaciones completas se traducirá en una mejor comprensión del funcionamiento del ecosistema microbiano y viral. Aunque pocos estudios han llevado a cabo el esfuerzo de evaluar todos los parámetros propuestos, muchos han estado investigando los seleccionados. Nelson et al. 53 sugiere una conexión between hábitats de arrecifes específica y agotamientos en ambas concentraciones de DOC y bacterioplancton relativos a las aguas en alta mar. Estos cambios de concentración fueron acompañados por distintas diferenciaciones de bacterioplancton. Dinsdale et al. 5 mostró que el aumento de impacto antropogénico fue acompañado por 10x mayor abundancia de células microbianas y partículas similares a virus. Las comunidades microbianas en las aguas marinas que rodean las islas habitadas también tenían fracciones más grandes de heterótrofos y potenciales patógenos 5. Finalmente McDole et al. 4 mostró, mediante la introducción de la puntuación microbialization, que las actividades humanas están cambiando energía a los microbios, a expensas de los macrobios. Estos estudios, se centraron en los parámetros microbiológicos y químicos del agua específicos, proporcionan nuevos conocimientos sobre la estructura bioquímica de los ecosistemas marinos. La combinación de datos tradicionales de los esfuerzos de monitoreo de ecosistemas - como valores de temperatura y pH, la biomasa de peces y diversidad, la cubierta bentónica, o la exposición al impacto humano - con la química del agua y evaluaciones microbianas, probablemente como resultado de los esfuerzos de monitoreo ambiental más sensibles, que pueden llevar a los esfuerzos de conservación más específicamente dirigidos.

Los ecosistemas marinos son sometidos a una amplia gama de perturbaciones que resultan en cambios con respecto a la disponibilidad de nutrientes a la biomasa de los depredadores. Durante la última década, varios estudios han demostrado la importancia de las comunidades microbianas en los ecosistemas marinos 1.4. Es evidente que los cambios en la comunidad bacteriana y viral están estrechamente asociados con la degradación general de los entornos marinos 5. Estos cambios pueden ser facilitadas por la geoquímica de alteración en la columna de agua, tales como la disponibilidad de oxígeno o 6,7 remineralización de carbono. Como resultado de la interdependencia entre el macroorganismos, la química del agua y ciclos de retroalimentación de actividad microbiana puede acelerar la tasa de degradación de los ecosistemas 8. En los años 1970 y 80 se hicieron múltiples intentos de desentrañar los ciclos biogeoquímicos en los ecosistemas marinos 9.11. Uno de los principales retos para estos primeros estudios fue la faltade enfoques estandarizados para medir los parámetros biogeoquímicos evaluados. Aunque hubo protocolos disponibles, principalmente en los nutrientes del agua de mar 12,13, la evaluación de la dinámica del carbono y la estructura de la comunidad microbiana fueron limitados por las herramientas y métodos disponibles. Con la comparación de métodos JGOFS EQPac, Sharp et al. 14 sugirió por primera vez un protocolo fiable y estandarizado para las evaluaciones de concentración (DOC) de carbono orgánico disuelto. A principios de la década de 2000 los retos analíticos para determinar los recursos disponibles para la comunidad microbiana se habían resuelto de este modo en gran medida y enfoques para caracterizar las comunidades microbianas en ambientes de cultivo controladas se había establecido (ver DeLong 15). Los métodos de secuenciación tradicionales de la época se basaban en gran medida en cultivos clonales cultivadas. La secuenciación de genes ambiental adelantado de muestras naturales reveló, sin embargo, que la mayoría de la biodiversidad microbiana se había perdido por cultivmétodos basados ​​en la ación 16. En 2002, Breitbart et al. 17 utiliza la secuenciación escopeta para la primera vez para describir la comunidad viral en muestras de agua de mar ambientales se establece un método para secuenciar el genoma completo de comunidades virales uncultured marinos. Dentro de las evaluaciones microbianas existentes, los virus siguen siendo particularmente bajo estudiada, ya que la mayoría son difíciles de cultivar y que carecen de un marcador universalmente conservada como el 16S ARN ribosomal (rRNA) genes normalmente utilizados para la evaluación de la diversidad y el perfil de la comunidad. El enfoque de secuenciación metagenómica ofrece una alternativa a los métodos de cultivo y dependiente de genes orientados para el análisis de comunidades virales complejos. Mientras que los primeros metagenomes virales generados a partir de agua de mar se secuenciaron usando secuenciación de Sanger 17, el desarrollo de tecnologías de secuenciación de próxima generación y mejora de las técnicas moleculares ha llevado a un rápido aumento en los estudios de metagenómica 18 </sarriba&gt;. El flujo de trabajo de laboratorio actual de la metagenómica virales implica la separación, enriquecimiento, y / o la concentración de partículas virales, seguido de ácido nucleico (ADN o ARN) extracción, la preparación de la biblioteca, y la secuenciación 19-21. Para avanzar en el conocimiento existente sobre viral, microbiano y el funcionamiento bioquímico en los ecosistemas acuáticos, la comparación de conjuntos de datos en los diferentes sistemas en todo el mundo es esencial. Sin embargo, los protocolos establecidos en gran parte han sido desarrollados para entornos cercanos a la costa con instalaciones de laboratorio de fácil acceso. Por lo tanto, la falta de métodos de campo estandarizados dificulta estas comparaciones entre ecosistemas. Aquí presentamos probado a fondo y bien estandarizado adaptaciones de estado de los protocolos de investigación técnica para su uso en lugares remotos de campo. Estos métodos han sido probados con éxito en múltiples estudios sobre el transcurso de la última década 5,22 y se utilizan en la actualidad por diversos laboratorios marinos, así como en el de NOAAEvaluación y Programa de Monitoreo de Arrecifes (RAMP) en todo el Océano Pacífico 4. Los protocolos de muestreo incluyen parámetros de química de agua (concentraciones de carbono inorgánicos y orgánicos, concentración de nutrientes inorgánicos), la abundancia viral y microbiana (recuentos bacterianos directos, recuentos directos virales, y citometría de flujo para evaluar autotroph vs proporciones heterótrofos), y estructura de la comunidad microbiana y viral y potencial metabólico a través de análisis de metagenómica (para una visión general véase la figura 1). Los resultados obtenidos a partir de los métodos descritos aquí son necesarios con el fin de dilucidar los parámetros de fondo biogeoquímicos clave necesarios para caracterizar exhaustivamente los ecosistemas acuáticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1307">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:325px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration setup&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 &#8211; 36 % Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A508-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">High-density polyethylene (HDPE) container</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Combustion oven (550&#176; C)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml HDPE vials&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02-896-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">25 mm GF/F filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-874-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>XX62-000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, non-powdered gloves</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">19-170-010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bilge pump&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Thirsty Mate 124PF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 l collapsible low-density polyethylene carboy&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Reliance Fold A Carrier II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>CFP-2-E-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum-cured silicon tubing for TFF</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>96440-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hose clamps</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>P-68007-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-77410-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8.0 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVHV010RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-125-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml plastic scintillation bottle&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>03-341-72C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clean bucket (10 - 20 L)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 % glutaraldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m&#160; high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DAPI solution 25 &#181;g ml-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular grade water</td>
			<td>sigma aldrich</td>
			<td>W-4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>BP351-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP399-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>G31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slide</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate task wipe&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide Station with vacuum pump</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">DNA extraction kit</td>
			<td style="width:217px;">Macherey-Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td>Nucleospin tissue kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Proteinase K (20 mg ml-1)</td>
			<td style="width:217px;">Lifetechnologies</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-proof 100% Ethanol</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45503-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cesium chloride (CsCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>bp1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m alumina matrix disposable syringe filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>O992613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra - swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:149px;">333790</td>
			<td>SW41 Ti Rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DNase I (100 u &#181;l-1)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycogen</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">G-1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 % Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:149px;">15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2473-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02674-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20 &#956;g ml-1 Proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">p3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">50ml Oak Ridge Tube&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">05-562-16B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

Aquí presentamos una serie de protocolos de investigación a fondo probados y bien estandarizados adaptados para su uso en ambientes marinos remotos. Los protocolos de muestreo incluyen la evaluación de los recursos a disposición de la comunidad microbiana (carbono orgánico disuelto, la materia orgánica particulada, nutrientes inorgánicos), y una descripción completa de las comunidades virales y bacterianas (a través de los recuentos microbianos y virales directos, la enumeración de los microbios autofluorescentes, y construcción de metagenomes virales y microbianas). Utilizamos una combinación de métodos, que representan un campo disperso de las disciplinas científicas que comprenden protocolos ya establecidos y algunas de las técnicas más recientes desarrollados. Técnicas de secuenciación metagenómica Especialmente utilizados para la caracterización viral y bacteriana de la comunidad, se han establecido sólo en los últimos años, y por lo tanto están todavía sometidos a la mejora continua. Esto ha conducido a una variedad de procedimientos de muestreo y procesamiento de las muestras Currentemente en uso. El conjunto de métodos que aquí se presenta ofrece un enfoque hasta la fecha para recoger y procesar muestras ambientales. Parámetros tratados con estos protocolos producen el mínimo de información esencial para caracterizar y comprender los mecanismos subyacentes de la dinámica de la comunidad virales y microbianas. Da fácil de seguir las directrices para llevar a cabo estudios amplios y discute los pasos críticos y advertencias potenciales pertinentes para cada técnica.

Microscopía Muestras Microscopía pueden y deben analizarse de inmediato para asegurarse de que son de la calidad deseada. Para medir la abundancia y la distribución de tamaños de la comunidad bacteriana, diapositivas DAPI serán examinadas por microscopía de epifluorescencia (excitación / emisión: 358/461 nm, ver McDole et al 2012). (Figura 6A). Condes y dimensiones celulares pueden ser recolectados a través de software de imagen (por ejemplo, ImagePro o ImageJ). A partir de los volúmenes de medidas de longitud y ancho de la celda (V) son derivados al hacer la suposición de que todas las células tienen la forma de cilindros con tapas hemisféricas utilizando la siguiente ecuación: V = π / 4 × w 2 (L - w / 3) donde L es la longitud y W es la anchura de cada 23,4 celular. Biomasa microbiana puede entonces estimarse utilizando relaciones dependientes del tamaño previamente establecidos for comunidades microbianas marinas 24. Generalmente las bacterias marinas varían en longitud desde 0,1 hasta 4 m, pero van hasta ~ 8 m en algunos lugares. Mientras que los filtros (0,2 M) teñidas con DAPI sólo mostrarán las bacterias, los filtros utilizados para la tinción SYBR Gold (0,02 micras) contienen bacterias y virus. La medición de la abundancia de los virus sigue el mismo protocolo que para los microbios, sin embargo una excitación de 325-375 nm se utilizará y el máximo de emisión es a 537 nm (Figura 6B). Con el fin de generar datos cuantitativos puede necesitar ser ajustado dependiendo de la abundancia viral en la muestra original del volumen de muestreo. El volumen correcto de filtro es mejor determinado empíricamente para una masa de agua determinada. Ejemplos de micrografías que contienen muestras con concentraciones variables virales se ilustran en la Figura 7. Los resultados de estudios anteriores sugieren que el virus de Microbioratios (VMR) generalmente van de 1 a 50 en los sistemas acuáticos 25-29, y entre 3 y 20, con una media de aproximadamente 6 en los sistemas de arrecifes de coral (Knowles datos no publicados). Citometría de Flujo Además de los recuentos directos y la estimación del tamaño de la comunidad microbiana, las evaluaciones de la relación de autótrofa a los microbios heterotróficos a través de citometría de flujo más pueden ser extraídos de las muestras recogidas (citometría de flujo ejemplar de salida dado en la Figura 8). Para determinar el número total de células de bacterias, las muestras se tiñeron con SYBR Green I y un tubo fotomultiplicador con un filtro de paso de banda 530/30 se utiliza para la detección. Un canal para la clorofila (de nuevo a los espejos LP espalda que resultan en un rango de 675 a 735 nm) y (filtro de paso de banda 585/42) ficoeritrina se utiliza para contar la abundancia de autótrofos en muestras no teñidas. Para determinar la abundancia de microbios heterotróficos, los recuentos de autótrofos de la noparte manchada continuación, se resta de la cuenta SYBR-manchado total (McDole et al. presentado). La metagenómica viral Metagenómica viral utiliza un enfoque molecular cultura independiente a la ecología viral, utilizando la información total de la secuencia genómica para determinar la estructura y la función de la comunidad. La metagenómica ha ido avanzando nuestra comprensión de la complejidad y diversidad de las comunidades virales a nivel local 17 a escala mundial 30. El reciente desarrollo de una amplia gama de herramientas bioinformáticas para el análisis de los datos de metagenómica viral ha disminuido los cuellos de botella de cómputo, lo que permite una visión más completa de la de la virosphere través de la lente de la metagenómica. Los métodos aquí presentados ponen de relieve el aislamiento y enriquecimiento de las partículas virales del agua de mar usando una combinación de pre-filtración con un gran tamaño de poro de malla de nylon para eliminar los desechos y el material celular, concentración demuestras con TFF (Figura 3) y una subsiguiente 0,45 micras de filtración para eliminar las células más grandes. Este método produce más o menos una muestra concentrada 100x (Figuras 5B-5E), que nos permite realizar procesos posteriores en volúmenes más pequeños. Con el fin de evitar el crecimiento de las células microbianas restantes en el lisado viral y por lo tanto cambios en la abundancia viral de la muestra durante el tiempo de tránsito de largo entre la estación de campo y de laboratorio, cloroformo menudo se añade a una concentración final de 2% para el almacenamiento. Tras el aislamiento y la purificación de las VLP, la microscopía de epifluorescencia con colorantes ácidos nucleicos tales como SYBR Gold se utilizan para verificar la presencia y la pureza de las partículas virales (Figuras 5B-5E). A continuación, presentamos dos metagenomes virales de los arrecifes de coral Isla Sur de la Línea, en concreto, el Starbuck (STAR7) y Millennium (CAR9; anteriormente conocida como Caroline) islas. Un volumen total de 120 L samagua PLE se recogió de cada sitio, a una profundidad de 10 metros y procesada como se describe en la sección 3.7 y 5.2. Las VLPs purificadas a partir de la centrifugación en gradiente de cloruro de cesio eran 3,3 x 10 8 partículas / ml para CAR9 (Figura 5D) y 2,9 x 10 9 partículas por ml para STAR7 como verificada de acuerdo con el método descrito en el párrafo 4 (Figura 5B). La cantidad total de ADN aislado de estas muestras fueron alrededor de 400 ng basa en la medición Nanodrop. ADN fue amplificado utilizando Phi29 polimerasa y se secuenció por la instalación Ambiental Genómica en 2011. Las características de la secuencia de datos se presentan en la Tabla 1. Sobre la base de similitud búsquedas utilizando las bases de datos existentes, la mayoría (&gt; 70%) de las secuencias terminó a menudo hasta , es decir, de origen desconocido no caracterizados y funciones. Del mismo modo, los dos viromes presentados aquí presentan más de 97% de secuencias desconocidas. Como resultado, no la base de datosSe utilizó el análisis dependiente para el análisis y abrió un nuevo brazo de oportunidades de investigación sobre la &quot;materia oscura&quot; en la metagenómica virales (Seguritan et al. en prensa). Microbiana metagenómica El análisis de metagenomes microbianos permite la caracterización de la comunidad microbiana presente y la descripción funcional de estas comunidades. Los ejemplos incluyen las estimaciones de la presencia de agentes patógenos y la virulencia 5,22 o comparaciones entre los cambios en la estructura de la comunidad macrobial o nutrientes disponibles y abundancia de las especies y sus vías metabólicas predominantes (Figura 9; Kelly et al 2014).. Química del Agua Parámetros químicos del agua generalmente toman extensa procesamiento analítico para generar los datos deseados; las muestras para el análisis de COD se medirán por medio de alta temperatura 31,3 oxidación catalítica2, la materia orgánica particulada (POM) a través de la espectrometría de masas de relación isotópica acoplado a un analizador elemental 33-35, y los nutrientes inorgánicos por inyección de flujo Análisis 36,12,37. Después de la finalización con éxito de todos los análisis, la información como se muestra en la Tabla 1 estará disponible para complementar la caracterización de la microbiana y comunidades virales. Esta información puede ser complementado con proporciones de isótopos estables de las muestras de carbono y nitrógeno orgánico (véase Haas et al. 35) y las proporciones entre autótrofos y heterótrofos (McDole et al., Presentado). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Descripción general de los métodos descritos en la sección de protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de este figu</a>re. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" /> Figura instalación de procesamiento de plataforma 2. Muestra. La configuración de la filtración introducido aquí (dibujo esquemático a la izquierda, la imagen real del panel derecho) no se requiere necesariamente para generar muestras pero acelerará el proceso de manera significativa. La configuración consiste en una placa posterior, en la que se montan las unidades de Hatay Niskin (1). En la salida hacia abajo, las unidades de Hatay Niskin están conectados con un tubo de silicona a los titulares de filtro en línea (2). Estos permiten el paso del agua a través del filtro de la muestra respectiva en los viales de muestreo HDPE (3) montado justo debajo. El proceso de filtración se acelera a través de aire a presión (4), que y regulada por un medidor de presión (5). Un dique de contención evita que se derrame el agua durante el cambio de los viales de polietileno de alta densidad o filtración POM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor,</a>haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig3highres.jpg" /> Agua de la muestra la figura 3. tangencial alineación filtro de flujo (modificado de Thurber et al. 19). Nylon con malla filtrada se bombea desde el depósito (1) a través de una bomba peristáltica (2) a un filtro de flujo tangencial (3). Los retornos de agua a la muestra el depósito (1) a lo largo de la línea de retorno (4), en ausencia de contrapresión. Cuando se aplica contrapresión a través de una abrazadera de la manguera (5) en la línea de retorno, el agua pasa a través del filtro y se desecha o se entrega al depósito de filtrado (6). El agua de la muestra se sustituye, ya que se concentra fuera de la línea de filtrado hasta que todo el agua de la muestra se concentra en las líneas de tubería. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" /> Figura 4. Microscopio configuración filtración de diapositivas.Para distribuir uniformemente DAPI y SYBR Gold muestras teñidas en el filtro de matriz de alúmina respectiva (1), los filtros necesitan ser colocados en entre la torre de filtro (2) y el vástago del colector de filtración y se fija con una abrazadera (4). Un vacío regulado de presión (5) acelerará el proceso de filtración (arriba dibujo esquemático, imagen real panel inferior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" /> Figura 5. La purificación y la concentración de partículas de fago. Un total de 1 ml de cada gradiente de densidad de cloruro de cesio se coloca sobre la parte superior de uno al otro antes de dirigir la muestra pretratada (A). Cada capa debe ser marcado fuera del tubo para facilitar la extracción después de la ultracentrifugación. Marcas de flechas rojas donde el tubo será perforado a exTracto la fracción VLP. (BE) Micrografías de concentrados virales: micrografías epifluorescencia de 0,45 micras filtrados-concentrados virales representativas de STAR7 (B) y CAR9 (D). Las partículas grandes, incluyendo células bacterianas eran visibles desde las 0,45 micras-filtrados de ambos STAR7 (B) y (D) CAR9 muestras, mientras que sólo VLPs (flechas blancas) permanecen después de ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio; Estrella 7 (C) y CAR9 (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" /> Figura 6. Ejemplo de DAPI y análisis micrografía SYBR Gold. Captura de pantalla del análisis de (A) y DAPI oro manchado ejemplo de la diapositiva (B) SYBR. (A) Longitud y anchura (m) de todos destacaron partículas(= Microbios) pueden ser evaluadas con la ayuda de un programa de formación de imágenes. Nota la agregación en el centro de la imagen. Estas agrupaciones deberán ser excluidos del análisis posterior. (B) Durante los virus y las bacterias de análisis deberá ser desechado por los umbrales de tamaño en VLP y rangos de tamaño celular (VLP rojo, verde celular). Tenga en cuenta que por lo general hay algunos VLP débiles Uncategorized por el programa de imagen respectiva. Estas VLP que aparecen como puntos blancos débiles deben ser contados y se añaden a los conteos virales automatizados manualmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" /> Figura 7. Las concentraciones de SYBR Gold manchado muestras. Micrografías de un filtro de 0,02 matriz de alúmina que contiene diversas cantidades de muestras de virus SYBR manchado. El panel A muestra afILTER que contiene una cantidad adecuada de agua de mar filtrada, mientras que las concentraciones en el filtro que se muestran en B son demasiado altos y en C demasiado bajo para los recuentos fiables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" width="600" /> Figura 8. Resultados de citometría de flujo de salida de análisis de una muestra de agua de arrecife. Panel (A) muestra de agua de grado molecular sólo con microesferas de color amarillo-verde fluorescente (0,75 M), que se utilizan para verificar fondo mínimo con los ajustes del instrumento. Panel (B) representa la salida de la carrera muestra de agua de arrecife con valores idénticos y el diseño como en A. Tenga en cuenta que las cuentas aún se pueden ver en el mismo lugar, junto con varias poblaciones de autótrofos. (C) </strong&gt; La misma muestra que en (B), que se utiliza para realizar copias de puerta el citómetro de flujo, apuntando a eventos positivos SYBR (autótrofos + recuento de heterótrofos) y el fondo de la minimización. (D) La muestra representativa de agua arrecife manchado con SYBR Green I. Uso la compuerta establecida en (C), se generaron los recuentos totales de microbios y microorganismos heterótrofos y autótrofos divididas por autofluorescencia clorofila (ver McDole et al. 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" width="600" /> Figura 9. Ejemplo de datos metagenome microbianas. Patrones entre los datos de la secuencia metagenómica microbianas y las variables dependientes del sitio. Aquí, la abundancia relativa de Synechococcus </em&gt; spp. se correlacionó positivamente con el porcentaje de cobertura de coral, mientras que Pelagibacter spp. no fue (paneles de la izquierda). La vía metabólica para la transferencia por conjugación se correlacionó positivamente con las concentraciones de nitratos, mientras que la vía metabólica para la reparación del ADN fue consistente entre todos los metagenomes (paneles de la derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Estrella 7 </td><td> CAR9 </td></tr><tr><td> Número total de Lee </td><td> 939311 </td><td> 591600 </td></tr><tr><td> Número de preprocesado Lee </td><td> 579664 </td><td> 360246 </td></tr><tr><td> Secuencia de longitud media (pb) </td><td> 395 ± 131 </td><td> 451 ± 159 </td></tr><tr><td> Secuencias anotado (%) </td><td> 42,218 (7.3%) </td&gt; <td> 9.117 (2,5%) </td></tr><tr><td> Desconocido (%) </td><td> 537.446 (92,7%) </td><td> 351 129 (97,5%) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Características de los datos de dos viromes generados a partir de las Islas de la Línea Sur, Starbuck y del Milenio. El grado de anotación se basa en Blat utilizando el servidor de MG-RAST. <img alt="Tabla 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" width="700" /> Tabla 2. Los resultados representativos que muestran los datos de varios sitios durante una expedición. Los parámetros evaluados aquí incluyen mediciones de la química del agua combinados con abundancia microbiana y viral. La tabla contiene más nombres de los archivos que se refieren a los respectivos datos de metagenómica para cada lugar de muestreo. Concentraciones de carbono y nutrientes inorgánicos se dan en mmol / L. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" target="_blank">Por favor,</a>haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology at JoVE.com

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Desentrañar los jugadores invisibles en el Océano - Guía de Campo a la química del agua y Microbiología Marina

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

unraveling-unseen-players-ocean-field-guide-to-water-chemistry-marine

Research

JoVE Journal

Environment

25.3K vistas.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 

Video: Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

Un pez de amamantar Laboratorio Bioensayo para evaluar la actividad antidepredación de metabolitos secundarios de los tejidos de organismos marinos

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Investigación

Medio ambiente

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Limpia Muestreo y Análisis de río y estuarios, aguas de trazas metálicas Estudios

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, un método mejorado para InEx<em&gt; In Situ</em&gt; Medición de las partículas y compuestos disueltos procesada por Alimentadores Active Suspension

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

Protocolo para microplásticos muestreo en la superficie del mar y Análisis de las muestras

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Controlled-release of Chlorine Dioxide in a Perforated Packaging System to Extend the Storage Life and Improve the Safety of Grape Tomatoes

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties of the pouch were monitored in containers with or without fruit. The pouch was affixed to the inside of a perforated clamshell containing grape tomatoes, and the effect on microbial population, firmness, and weight loss was evaluated during a 14 day storage period at 20 &#176;C. Within 3 days, the ClO2 concentration in the clamshells reached 3.5 ppm and remained constant until day 10. Thereafter, it decreased to 2 ppm by day 14. The ClO2 pouch exhibited strong antimicrobial activity, reducing Escherichia coli populations by 3.08 log CFU/g and Alternaria alternata populations by 2.85 log CFU/g after 14 days of storage. The ClO2 treatment also reduced softening and weight loss and extended the overall shelf life of the tomatoes. Our results suggest that ClO2 treatment is useful for extending the shelf life and improving the microbial safety of tomatoes during storage without impairing their quality.

Here, we describe a protocol for the application of a novel, slow-release ClO2 product that reduces spoilage and extends the shelf life of fresh fruit. The slow-release ClO2 product was added to standard commercial grape tomato packaging and tested against Escherichia coli and Alternaria alternata.

La liberación controlada de dióxido de cloro en un sistema de envasado perforado para extender la vida de almacenamiento y mejorar la seguridad de los tomates de la uva

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Extracción de plaguicidas organoclorados de pellets de plástico y análisis de tipos de plástico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

El percebe Balanus improvisus como modelo Marina - cultivo y expresión del gen

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Construction of a Low-cost Mobile Incubator for Field and Laboratory Use

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water quality. However, commercially available incubators are often costly, difficult to transport, not flexible in terms of volume, and/or poorly adapted to local field conditions where access to electricity is unreliable. The purpose of this study was to develop an adaptable, low-cost and transportable incubator that can be constructed using readily available components. The electronic core of the incubator was first developed. These components were then tested under a range of ambient temperature conditions (3.5 &#176;C - 39 &#176;C) using three types of incubator shells (polystyrene foam box, hard cooler box, and cardboard box covered with a survival blanket). The electronic core showed comparable performance to a standard laboratory incubator in terms of the time required to reach the set temperature, inner temperature stability and spatial dispersion, power consumption, and microbial growth. The incubator set-ups were also effective at moderate and low ambient temperatures (between 3.5 &#176;C and 27 &#176;C), and at high temperatures (39 &#176;C) when the incubator set temperature was higher. This incubator prototype is low-cost (&lt; 300 USD) and adaptable to a variety of materials and volumes. Its demountable structure makes it easy to transport. It can be used in both established laboratories with grid power or in remote settings powered by solar energy or a car battery. It is particularly useful as an equipment option for field laboratories in areas with limited access to resources for water quality monitoring.

This paper describes a method for building an adaptable, low-cost and transportable incubator for microbial testing of drinking water. Our design is based on widely available materials and can operate under a range of field conditions, while still offering the advantages of higher-end laboratory-based models.

Construcción de una incubadora móvil de bajo costo para campo y laboratorio

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water ...