We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

Os métodos apresentados aqui vai fornecer uma ferramenta para gerar uma avaliação abrangente da dinâmica viral e microbianas em ecossistemas aquáticos. Eles são direcionados para quantificar o estoque de pé de recursos orgânicos e inorgânicos disponíveis para comunidades microbianas e caracterizar a composição da atual comunidade viral e microbiana. Ao lado de quantificação viral abundância ea abundância e biomassa microbiana, informações seqüência genômica revela sua estrutura e função da comunidade. Todos os métodos têm sido desenvolvidos ou modificados para permitir a aplicação de campo em locais remotos. No entanto, a falta de definições controladas de laboratório inerentemente cria algum potencial para erros. Aqui vamos discutir algumas ressalvas associadas a cada um dos parâmetros avaliados. Próximo ao potencial de contaminação durante a manipulação de amostra alguns dos parâmetros também produzir potencial de erro no processo analítico. Carbono Orgânico Dissolvido Carbono contaminação pode ocorrer durante os procedimentos de amostragem (amostragem a jusante, ou na vizinhança de um barco ou um mergulhador), durante a preparação da amostra (a contaminação do equipamento ou manipulação inadvertida), e, mesmo durante o armazenamento da amostra (no congelador outras amostras contendo orgânica Os solventes voláteis /). Para evitar as diversas fontes de contaminação conduta como alguns passos de manuseio quanto possível, uma vez que cada deslocalização amostra representa uma fonte adicional de contaminação. A amostra não deve entrar em contato com qualquer item não ácido lavado ou queimado. Finalmente, designa um congelador de armazenamento exclusivamente para amostras que não contenham substâncias orgânicas voláteis vai garantir a integridade das amostras durante os períodos de armazenagem mais longos. Se as amostras não pode ser mantido congelado durante um período prolongado de viagens de amostras DOC acidificação com HCl concentrado (como descrito 38-41) pode ser uma alternativa aplicável. Para verificar a precisão da medição materiais de referência consenso DOC deve ser usado regcularmente durante a medição DOC é executado. Especialmente água do mar profundo (&gt; 2000 m) referências são importantes na avaliação do desempenho da máquina analítica, pois é muito estável em seu conteúdo DOC 42. Matéria orgânica particulada Além de evitar a contaminação de carbono orgânico, a amostragem POM requer uma atenção especial para garantir a precisão do volume filtrado. Se o volume de 500 ml orientada deve desviar-se por qualquer motivo, este potencial deve ser anotado para relacionar a quantidade de POM capturado no filtro para o filtrado da qual foi derivada. Nutrientes inorgânicos Tal como acontece com a amostragem de carbono orgânico, deve ser dada atenção à possível contaminação da amostra de nutrientes gerados por várias fontes, como barcos ou descargas de águas residuais 12. Filtros usados ​​para a amostragem de carbono orgânico com um tamanho de poros nominais de 0,8 mm, não podem excluir toda a biomassa microbiana e shodia, por conseguinte, ser alterado para filtros de 0,2 um para este passo de filtração. Além disso, os limites de detecção constituem um problema com as amostras de nutrientes; especialmente na água de superfície oligotrófico em torno de muitos locais de recifes de coral (por exemplo, Cotner et al. 43). Os limites de detecção são mais ou menos em torno de 0,1, 0,2, e 0,1 mmol / L para o de amónio, nitrato e nitrito, e orto-fosfato, respectivamente (ver 36,12,37) Microscopia Ao lado de variações na concentração de análise de imagem a partir de amostras de lâminas de microscopia, permite maior potencial de erros. Por exemplo, as imagens podem ficar fora de foco em algumas áreas do campo de visão, e no foco em outros. Como um elevado grau de pureza do filtro matriz de alumina é um tipo de filtro muito rígida, quaisquer detritos sob o filtro pode fazer com que todo o filtro para se sentar em um ângulo para a corrediça. Como resultado, as imagens podem ser consistentemente fora de foco em várias partes do campo de visão para um dado filtro, reindependente- de alinhamento microscópio. Remontagem filtros, assegurando o lado de baixo do filtro está limpo, pode melhorar esta se for observada. Além disso, em alguns casos, pode haver dois planos focais em que os vírus e micróbios podem ser encontrados. Este é o resultado de se tornarem manchadas objectos separado do filtro quando da montagem, e que flutuam até à parte de baixo da lâmina de cobertura que pode tornar as contagens não confiável. Por isso recomenda-se sempre de verificar a qualidade das amostras durante o processo. Citometria de Fluxo Tal como acontece com as amostras de microscopia, pode haver diferenças entre amostras de citometria de fluxo, que exigem ajustamentos do processo analítico que ocorre naturalmente. Por exemplo, dependendo da sensibilidade do instrumento, fracamente as células fluorescentes Prochlorococcus pode ser inferior ao nível de ruído e não irá ser quantificada. Grânulos servir como uma amostra de controlo interno (por exemplo, para confirmar que resp do instrumentoonse de sinais fluorescentes é consistente do dia a dia (e permanece estável durante a própria corrida). Se adicionado à amostra em concentrações conhecidas, que também pode servir como um controlo interno para verificar o volume da amostra de execução. No entanto, recomenda-se rodar sempre uma alíquota de um &quot;padrão&quot; de amostra de água do mar previamente congelada que é descongelada e coradas juntamente com as amostras de interesse para proporcionar um controle biológico adicional para manipulação de amostra entre 96 poços é executado placa. Dependendo da localização, as amostras de água do mar pode parecer muito diferente uma da outra. Classificando populações &quot;representativas&quot; e, em seguida, visualização sob um microscópio de epifluorescência (EM) pode ser uma boa maneira de verificar rapidamente as populações de fitoplâncton como quer Synechococcus sp. Ou eucariotas fotossintéticos. Prochlorococcus células geralmente não são visíveis sob EM porque eles desaparecem muito rápido. Além de clorofila a, Synechococcus sp., Também contêm o phphycoeurythrin otopigment (PE), que emite luz em comprimentos de onda mais curtos (540-630 nm) do que a clorofila A (660-700 nm). Quando as células Synechococcus são excitados com luz azul / verde (470-490 nm), eles vão aparecer de ouro, se visto sob um filtro de emissão que remove todos os comprimentos de onda de luz abaixo de 510 nm. Por comparação, a fracção eucariótica vai ficar vermelha, quando excitado com o mesmo comprimento de onda da luz. Metagenomics virais É importante notar que o processo de armazenamento e concentração de VLP influencia a comunidade recuperado. Perda de partículas virais podem ocorrer em todos os passos do processo, e, assim, a selecção de protocolos de purificação e de enriquecimento virais podem em última análise afectar a composição taxonômica observada e diversidade dos metagenomes virais resultantes 44,45,18. A concentração das amostras pode ser feita utilizando TFF 19 ou 20 à base de floculação química. Na abordagem baseada em química, posittivamente carregado iões de ferro ligar as partículas virais naturalmente carregados negativamente que formam grandes (&gt; 8 mm) complexos de ferro-viral que floculam para fora da solução e pode ser recuperado utilizando filtros de 8 pm. Subsequentemente, o ferro é quelado fora das partículas virais e re-dissolvido através de magnésio, ácido ascórbico, e EDTA, deixando partículas virais concentrados para a extracção de ácido nucleico 20. Depois de comparar estes dois métodos atuais, concluímos que o método de cloreto de ferro é menos demorado do que a concentração viral TFF, mas pode render algumas ressalvas. Descobrimos que a dissociação e a dissolução do ferro-viral requer um duplo solução mais concentrada de magnésio-ácido ascórbico-EDTA 20 do que o relatado para a dissolução, a fim de proceder antes degrada os ácidos ascórbico. Além deste problema, o protocolo purifica partículas virais de fraccionamento por tamanho por si só, a remoção de contaminantes microbianos usando filtração de 0,2 um. Vírus grandes não passam através do filter (por exemplo, Yang et al. 46) e, portanto, não vai ser detectado, no metagenome, enquanto que algumas bactérias fazer (McDole, dados não publicados). Isso resulta em contaminação bacteriana ao discriminar contra vírus grandes. Esse problema específico no entanto, também é relevante para a remoção de micróbios em ligação com a concentração de TFF. Como o tratamento de clorofórmio foi mostrado para remover vírus sensível ao clorofórmio com membranas lipídicas externas 47 alguns estudos sugerem que 0,22 um de filtração pode ser utilizada para remover a maioria de bactérias. Também deve ser notado que o método apresentado tem como alvo principalmente bacteriófago, o transportador mais abundante de material genético em ambientes marinhos. Porque fagos são geralmente pensados ​​para não contêm comumente lipídios 48 eles são mais resistentes ao tratamento clorofórmio. Para o nosso conhecimento de um método &quot;catch-all&quot; não existe até o momento. O método aqui apresentado é uma adaptação da UOexperiência de campo r ao longo dos últimos 10 anos em vários ambientes marinhos medem tropical para sistemas árticas. Microbial Metagenomics A construção de bibliotecas metagenomic de micróbios (por exemplo, bactérias e archaea) é mais simples do que metagenomes virais, uma vez que é mais fácil de gerar as concentrações mínimas de ADN necessárias para a preparação da biblioteca. Amplificação espingarda bibliotecas Linker (LASLs) amplificação 17,49,50 e todo o genoma com base em múltiplos de amplificação de deslocamento (MDA) são os dois métodos mais comumente usados ​​para gerar DNA suficiente para o seqüenciamento. O uso de MDA para obter concentrações mais elevadas de ADN em metagenomes microbianas é por vezes necessário. Este, porém, pode causar artefatos nos dados de seqüência, como a overamplification de minicírculos de dinoflagelados. MDA são conhecidos métodos para amplificar preferencialmente ADN de cadeia simples e circular, resultando em resultados não-quantitativos 51,52. Os LASLs otimizados aproximar 50 pode, assim, serve como uma alternativa melhor na amplificação tanto microbiana e DNA viral metagenômica para o seqüenciamento. É importante notar que a abordagem LASLs tem múltiplos passos, requer equipamento sofisticado, e está limitado aos modelos de dsDNA. Além disso, o estojo de extracção de ADN de tecidos tem sido mostrado para extrair DNA de ambos filos negativo Gram positivas e Gram, mas não foi verificada a taxa microbiana lisar eficazmente recalcitrante ou suas estruturas associadas (por exemplo, certos archaea, endosporos, ou esporos de fungos) . Por conseguinte, pode ser necessário um passo de batimento talão para obter o DNA de certos micróbios. Estas avaliações abrangentes resultará em uma melhor compreensão do funcionamento dos ecossistemas viral e microbiana. Embora poucos estudos têm empreendido um esforço para avaliar todos os parâmetros propostos, muitos têm vindo a investigar os selecionados. Nelson et al. 53 sugeriram uma ligação entreen habitats de recife específico e esgotamento em ambas as concentrações de DOC e bacterioplâncton relativos às águas offshore. Essas mudanças de concentração foram acompanhadas por diferenciações distintos de bacterioplâncton. Dinsdale et al. 5 mostraram que o aumento impacto antropogénico foi acompanhada por 10x maior abundância de células microbianas e partículas semelhantes a vírus. Comunidades microbianas em águas marinhas vizinhas ilhas habitadas também teve frações maiores de heterotróficos e potenciais patógenos 5. Finalmente McDole et al. 4 mostraram, ao introduzir a pontuação microbialization, que as atividades humanas estão mudando energia para os micróbios, em detrimento dos macróbios. Estes estudos, com foco em parâmetros microbiológicos e químicos da água específicos, fornecer novos insights sobre a estrutura bioquímica dos ecossistemas marinhos. Combinando dados tradicionais de esforços de monitoramento de ecossistemas - como valores de temperatura e pH, biomassa de peixes e diversity, cobertura bentônica, ou exposição ao impacto humano - com a química da água e avaliações microbianas, provavelmente resultará em mais sensíveis esforços de monitoramento ambiental, o que pode levar a esforços de conservação, mais especificamente direcionados.

Os ecossistemas marinhos são submetidas a uma ampla gama de perturbações que resultam em alterações de disponibilidade de nutrientes para a biomassa de predadores. Durante a última década, vários estudos têm demonstrado a importância das comunidades microbianas em ecossistemas marinhos 1-4. É evidente que as alterações na comunidade bacteriana e viral estão intimamente associados com a degradação global dos ambientes marinhos 5. Estas alterações podem ser facilitada por geochemistry alterada na coluna de água, tais como a disponibilidade de oxigénio ou de carbono remineralização 6,7. Como resultado da interdependência entre o macroorganismos, química da água e loops de feedback atividade microbiana pode acelerar a taxa de degradação dos ecossistemas 8. Nos anos 1970 e 80, várias tentativas foram feitas para desvendar os ciclos biogeoquímicos em ecossistemas marinhos 11/09. Um dos principais desafios para estes estudos iniciais foi a faltade abordagens padronizadas para medir os parâmetros biogeoquímicos avaliados. Embora houvesse protocolos disponíveis, principalmente sobre os nutrientes da água do mar 12,13, a avaliação da dinâmica de carbono e estrutura da comunidade microbiana foram limitados pelas ferramentas e métodos disponíveis. Com o JGOFS EqPac comparação métodos, a Sharp et al., 14 sugeriram pela primeira vez um protocolo fiável e normalizado para as avaliações (DOC) de concentração de carbono orgânico dissolvido. Até o início da década de 2000 os desafios analíticos para determinar os recursos disponíveis para a comunidade microbiana tinha, assim, em grande parte resolvidos e abordagens para caracterizar comunidades microbianas em ambientes controlados cultura tinha sido estabelecida (ver DeLong 15). Os métodos de sequenciamento tradicionais na época em grande parte se baseou em culturas clonais cultivadas. Seqüenciamento do gene ambiental precoce de amostras naturais revelou, no entanto, que a maior parte da biodiversidade microbiana tinha sido perdida por cultivmétodos baseados em ation 16. Em 2002, Breitbart et al., 17 utilizadas shotgun de sequenciação pela primeira vez para descrever a comunidade viral em amostras de água do mar ambientais que estabelecem um método para sequenciar o genoma inteiro de comunidades virais marinhos não cultivadas. Dentro das avaliações microbianas existentes, os vírus ainda continua a ser particularmente estudado, como a maioria são difíceis de cultura e que falta um marcador universalmente conservado como o 16S RNA ribossomal (rRNA) genes normalmente utilizados para avaliar a diversidade de perfis e comunidades. A abordagem metagenômica sequenciamento fornece uma alternativa aos métodos dependentes de cultura e alvo de genes para analisar comunidades virais complexas. Enquanto os primeiros metagenomes virais geradas a partir de água do mar foram sequenciados utilizando sequenciamento Sanger 17, o desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento de última geração e técnicas moleculares melhoria levou a um rápido aumento em estudos metagenomic 18 </sacima&gt;. O fluxo de trabalho laboratorial corrente para metagenomics virais envolve a separação, o enriquecimento, e / ou a concentração de partículas virais, seguido de ácido nucleico (DNA ou RNA) extracção, a preparação da biblioteca, e sequenciação de 19-21. Para aprofundar o conhecimento existente sobre viral, bacteriana e funcionamento bioquímico em ecossistemas aquáticos, comparando conjuntos de dados em vários sistemas ao redor do mundo é essencial. No entanto, os protocolos estabelecidos têm sido largamente desenvolvido para ambientes costeiros com instalações laboratoriais acessíveis. Assim, a falta de métodos de campo padronizados dificulta as comparações entre estes ecossistemas. Aqui apresentamos exaustivamente testado e adaptações de estado dos protocolos de pesquisa de arte bem padronizado para uso em locais de campo remotas. Esses métodos foram provados com sucesso em vários estudos que medem a última década, 5,22 e são usadas atualmente por vários laboratórios marinhos, bem como sobre a NOAAAvaliação Reef e Programa de Monitoramento (RAMP) ao longo do Oceano Pacífico 4. Os protocolos de amostragem incluem parâmetros da água química (concentrações de carbono inorgânico e orgânico, concentração de nutrientes inorgânicos), abundância viral e microbiana (contagem bacteriana direta, contagem viral diretos, e citometria de fluxo para avaliar autotroph vs índices de Heterotroph) e estrutura da comunidade microbiana e viral e potencial metabólico através da análise metagenômica (para uma visão geral veja a Figura 1). Os resultados obtidos a partir dos métodos descritos aqui são necessárias a fim de elucidar principais parâmetros bioquímicos fundo necessários para caracterizar exaustivamente ecossistemas aquáticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1307">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:325px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration setup&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 &#8211; 36 % Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A508-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">High-density polyethylene (HDPE) container</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Combustion oven (550&#176; C)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml HDPE vials&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02-896-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">25 mm GF/F filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-874-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>XX62-000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, non-powdered gloves</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">19-170-010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bilge pump&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Thirsty Mate 124PF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 l collapsible low-density polyethylene carboy&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Reliance Fold A Carrier II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>CFP-2-E-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum-cured silicon tubing for TFF</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>96440-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hose clamps</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>P-68007-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-77410-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8.0 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVHV010RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-125-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml plastic scintillation bottle&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>03-341-72C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clean bucket (10 - 20 L)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 % glutaraldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m&#160; high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DAPI solution 25 &#181;g ml-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular grade water</td>
			<td>sigma aldrich</td>
			<td>W-4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>BP351-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP399-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>G31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slide</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate task wipe&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide Station with vacuum pump</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">DNA extraction kit</td>
			<td style="width:217px;">Macherey-Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td>Nucleospin tissue kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Proteinase K (20 mg ml-1)</td>
			<td style="width:217px;">Lifetechnologies</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-proof 100% Ethanol</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45503-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cesium chloride (CsCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>bp1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m alumina matrix disposable syringe filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>O992613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra - swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:149px;">333790</td>
			<td>SW41 Ti Rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DNase I (100 u &#181;l-1)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycogen</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">G-1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 % Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:149px;">15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2473-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02674-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20 &#956;g ml-1 Proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">p3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">50ml Oak Ridge Tube&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">05-562-16B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

Aqui apresentamos uma série de protocolos de pesquisa cuidadosamente testados e bem padronizados, adaptados para o uso em ambientes marinhos remotos. Os protocolos de amostragem incluem a avaliação dos recursos disponíveis para a comunidade microbiana (carbono orgânico dissolvido, matéria orgânica particulada, nutrientes inorgânicos), e uma descrição abrangente das comunidades virais e bacterianas (via contagem viral e microbianas diretos, enumeração de micróbios autofluorescentes, e construção de metagenomes virais e microbianos). Usamos uma combinação de métodos, que representam um campo disperso de disciplinas científicas que incluem protocolos já estabelecidos e algumas das técnicas mais recentes desenvolvidas. Técnicas de sequenciamento especialmente metagenomic utilizados para a caracterização da comunidade virais e bacterianas, só foram estabelecidas nos últimos anos, e são, portanto, ainda sujeita a constante melhoria. Isto levou a uma variedade de procedimentos de amostragem e processamento de amostras currently em uso. O conjunto de métodos apresentado aqui fornece uma abordagem até data para coletar e processar amostras ambientais. Parâmetros abordados com estes protocolos produzir o mínimo de informação essencial para caracterizar e compreender os mecanismos subjacentes da dinâmica da comunidade virais e microbianas. Dá fácil de seguir as orientações para a realização de pesquisas abrangentes e discute etapas críticas e possíveis ressalvas pertinentes a cada técnica.

Microscopia Amostras de microscopia pode e deve ser analisado imediatamente para garantir que eles tenham a qualidade desejada. Para medir a abundância ea distribuição de tamanho da comunidade bacteriana, lâminas DAPI será examinado por microscopia de epifluorescência (excitação / emissão: 358/461 nm, ver McDole et al 2012). (Figura 6A). Contagem de células e dimensões podem ser coletados por meio de software de imagem (por exemplo, ImagePro ou ImageJ). A partir de volumes de células medidas de comprimento e largura (V) são derivadas, fazendo a suposição de que todas as células têm a forma de cilindros com as tampas hemisféricas, utilizando a seguinte equação: V = π / 4 × 2 w (L - w / 3) onde L é o comprimento e w é a largura de cada célula 23,4. A biomassa microbiana pode ser estimada utilizando relações dependentes de tamanho previamente estabelecidos for comunidades microbianas marinhas 24. Geralmente bactérias marinhas variam em comprimento 0,1-4 mm, mas ir até ~ 8 mm em alguns locais. Enquanto os filtros (0,2 um) corados com DAPI só irá mostrar as bactérias, os filtros utilizados para a mancha SYBR Gold (0,02 mm) contêm bactérias e vírus. Medindo a abundância de vírus segue o mesmo protocolo como para micróbios, no entanto uma excitação de 325-375 nm vai ser utilizado e o máximo de emissão é de 537 nm (Figura 6B). A fim de gerar dados quantitativa do volume de amostragem pode necessitar de ser ajustado dependendo da abundância viral na amostra original. O volume correto para filtrar é melhor determinado empiricamente para uma dada massa de água. Exemplos de micrografias contendo amostras com diferentes concentrações de vírus encontram-se ilustrados na Figura 7. Os resultados de estudos anteriores sugerem que vírus para Microberatios (VMR) variam geralmente de 1 a 50 em sistemas aquáticos 25-29, e entre 3 e 20, com uma média de cerca de 6 em sistemas de recifes de coral (Knowles dados não publicados). Citometria de Fluxo Além das contagens directas e tamanho estimativa da comunidade microbiana, as avaliações da proporção de autotrófico para micróbios heterotróficas através de citometria de fluxo pode ainda ser extraídos a partir das amostras recolhidas (citometria de fluxo exemplar de saída dada na Figura 8). Para determinar o número de células totais das bactérias, as amostras foram coradas com SYBR Green I e um tubo fotomultiplicador com um filtro de passagem de banda 530/30 é usado para a detecção. Um canal de clorofila (LP volta para espelhos de volta, resultando numa gama de 675-735 nm) e (filtro de passagem de banda 585/42) ficoeriterina é usado para contar a abundância de autotróficos em amostras não coradas. Para determinar a abundância de micróbios heterotróficas, as contagens autotróficas da não-manchado porção são então subtraída a contagem total de SYBR-corados (McDole et al., submetido). Metagenomics virais Metagenômica Viral utiliza uma abordagem molecular independente de cultura com a ecologia viral, utilizando as informações total de seqüência genômica para determinar a estrutura e função da comunidade. Metagenômica vem avançando a nossa compreensão da complexidade e diversidade das comunidades virais a nível local 17 a 30 escalas globais. O recente desenvolvimento de uma ampla gama de ferramentas de bioinformática para análise de dados metagenomic virais diminuiu gargalos computacionais, permitindo uma visão mais abrangente da do virosphere através da lente da metagenômica. Os métodos apresentados aqui realçar o isolamento e enriquecimento de partículas virais a partir de água do mar utilizando uma combinação de pré-filtração com o grande tamanho dos poros da malha de nylon para remover os detritos e material celular, concentração deamostras com TFF (Figura 3) e uma subsequente filtração de 0,45 um para remover as células maiores. Este método produz cerca de um 100x amostra concentrada (Figuras 5B-5E), que nos permite realizar processos a jusante em volumes menores. A fim de evitar o crescimento de quaisquer células microbianas que permanecem no lisado viral e, por conseguinte, muda na abundância viral da amostra durante o longo tempo de trânsito entre a estação de campo e no laboratório, clorofórmio é frequentemente adicionado a uma concentração final de 2% para armazenamento. Após isolamento e purificação de partículas VLP, microscopia de epifluorescência com corantes ácidos nucleicos, tais como SYBR ouro são usados ​​para verificar a presença e pureza das partículas virais (Figuras 5B-5E). Aqui, apresentamos dois metagenomes virais do recife de coral do Sul Linha Island, especificamente, a Starbuck (STAR7) e Millennium (CAR9; anteriormente conhecido como Caroline) ilhas. Um volume total de 120 L sample água foi coletada de cada local, a uma profundidade de 10 metros e processados ​​como descrito na seção 3.7 e 5.2. As VLP purificadas a partir da centrifugação em gradiente de cloreto de césio foram 3,3 x 10 8 de partículas / ml para CAR9 (Figura 5D) e de 2,9 x 10 9 por ml para partículas STAR7 como foi verificado de acordo com o método descrito no ponto 4 (Figura 5B). A quantidade total de DNA isolado a partir destas amostras foram de cerca de 400 ng, com base na medição Nanodrop. O DNA foi amplificado utilizando polimerase phi29 e sequenciados pela facilidade Ambiental Genomics núcleo em 2011. As características da sequência de dados é apresentada na Tabela 1. Com base em pesquisas de similaridade utilizando bases de dados existentes, a maioria (&gt; 70%) das sequências frequentemente terminou descaracterizados, ou seja, origens e funções desconhecidas. Do mesmo modo, as duas viromes aqui apresentados apresentaram mais de 97% das sequências desconhecidas. Como resultado, não banco de dadosanálise dependente foi utilizado para análise e abriu um novo braço de oportunidade de pesquisa sobre a &quot;matéria escura&quot; em metagenômica virais (Seguritan et al. no prelo). Microbial Metagenomics A análise dos metagenomes microbianas permite a caracterização da comunidade microbiana presente ea descrição funcional destas comunidades. Exemplos incluem estimativas da presença de patógenos e virulência 5,22 ou comparações entre as mudanças na estrutura da comunidade microbiana ou nutrientes disponíveis e abundância de espécies e suas vias metabólicas predominantes (Figura 9; Kelly et al 2014).. Química da Água Parâmetros de química da água em geral, tem extensa processamento analítico para gerar os dados desejados; As amostras para análise do COD vai ser medido através de alta temperatura de oxidação catalítica 31,32, matéria orgânica particulada (POM), através de espectrometria de massa de razão isotópica acoplado a um analisador elementar 33-35 e nutrientes inorgânicos pela Flow Injection Analysis 36,12,37. Após a conclusão bem sucedida de todas as análises, informação como mostrado na Tabela 1 irá estar disponível para complementar a caracterização da comunidades microbianas e virais. Esta informação pode ser complementada com proporções de isótopos estáveis ​​de carbono e nitrogênio amostras orgânicas (Veja Haas et al. 35) e relações entre autótrofos e heterótrofos (McDole et al. Submetido). <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Visão geral dos métodos descritos na seção de protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figu</a>re. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" /> Figura 2. Exemplo de configuração do processamento de equipamento. A configuração de filtragem introduzido aqui (desenho esquemático esquerda, quadro painel direito real) não é necessariamente obrigatório para gerar amostras, mas vai acelerar o processo de forma significativa. A instalação é constituída por uma placa de apoio, em que as unidades de Hatay Niskin (1) estão montados. Na saída virada para baixo, as unidades de Hatay Niskin estão ligados com tubagem de silicone para os filtros de suportes (2) em-linha. Estes permitem a passagem de água amostrada através do respectivo filtro para os frascos de amostragem HDPE (3) montada logo abaixo. O processo de filtração é acelerada por meio de ar pressurizado (4), e que regulado por um indicador de pressão (5). Uma doca de expansão impede derramar água durante a troca dos frascos de PEAD ou filtração POM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor,</a>clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig3highres.jpg" /> Água amostra Figura 3. programação filtro de fluxo tangencial (modificado a partir do Thurber et al. 19). Filtrou-se com tela de nylon é bombeado a partir do reservatório (1) através de uma bomba peristáltica (2) a um filtro de fluxo tangencial (3). As amostras de água retorna para o reservatório (1) ao longo da linha de retorno (4), na ausência de pressão de retorno. Quando a pressão de retorno é aplicada através de uma braçadeira de mangueira (5) na linha de retorno, a água passa através do filtro e é descartado ou entregues ao reservatório filtrado (6). Amostra de água é substituído como está concentrada a linha filtrado até toda a água da amostra é concentrado nas linhas de tubagem. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" /> 4. Microscópio Figura configuração filtração slide.Para distribuir uniformemente DAPI e SYBR ouro amostras coradas sobre o respectivo filtro de matriz de alumina (1), os filtros necessitam de ser colocado entre a torre de filtro (2) e da haste do colector de filtração e fixada com um grampo (4). Um vácuo regulado de pressão (5) vai acelerar o processo de filtração (top desenho esquemático, painel de fundo a fotografia original). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" /> Figura 5. A purificação e concentração de partículas de fago. Um total de 1 ml de cada gradiente de densidade de cloreto de césio é mergulhado em cima uns dos outros antes de levando a amostra pré-tratada (A). Cada camada deve ser marcada no exterior do tubo para facilitar a extracção após ultracentrifugação. Marcas de seta vermelha onde o tubo será perfurada para extrato a fracção de VLP. (BE) Micrografias de concentrados virais: micrografias de epifluorescência 0,45 concentrados virais representativos micrometros de filtrados de STAR7 (B) e CAR9 (D). As grandes partículas, incluindo as células bacterianas eram visíveis a partir dos 0,45 mm a partir de ambos os filtrados-STAR7 (B) e (D) CAR9 amostras, enquanto que apenas as VLP (setas brancas) permanecem após ultracentrifugação de gradiente de cloreto de césio; Estrela 7 (C) e CAR9 (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" /> Figura 6. Exemplo de DAPI e análise micrografia SYBR Gold. Tela a partir da análise de (A) e DAPI (B) SYBR ouro coradas exemplo corrediça. (A) Comprimento e largura (mm) das partículas em destaque todas(= Micróbios) pode ser avaliada com a ajuda de um programa de imagem. Note-se a agregação no centro da imagem. Estes agrupamentos terão de ser excluídos da análise subseqüente. (B) Durante vírus análise e bactérias precisam ser finalmente resolvido por limiares em VLP e faixas de tamanho celular (VLP vermelho, verde celular). Note-se que normalmente há alguns VLP tênues Sem categoria pelo respectivo programa de imagem. Estes VLP que aparecem como pontos brancos leves devem ser contados e adicionados aos contagem viral automatizados manualmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" /> Figura 7. Concentrações de SYBR ouro manchado amostras. Micrografias de um filtro de 0,02 matriz de alumina contendo vários números de SYBR manchado amostras de vírus. O painel A mostra afILTER contendo uma quantidade adequada de água do mar filtrada, enquanto que as concentrações no filtro mostrados em B são muito altos e em C muito baixo para a contagem de confiança. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" width="600" /> Figura 8. Os resultados de citometria de fluxo de saída da análise de uma amostra de recife-água. O painel (A) mostra a água de grau molecular só com microesferas amarelo-verdes fluorescentes (0,75 um), utilizadas para verificar a fundo mínima com as configurações do instrumento. Painel (B) mostra a saída do recife amostra de água correr com configurações idênticas e layout como em A. Note-se que as contas ainda podem ser vistos no mesmo local, junto com várias populações de autótrofos. (C) </strong&gt; A mesma amostra como em (B), usado para fazer-gate o citômetro de fluxo, visando eventos positivos SYBR (autotrófica + contagem de heterotróficos) ea minimização de fundo. (D) A amostra representativa recife-água coradas com SYBR Green I. Usando o gating estabelecido em (C), a contagem total de micróbios foram gerados, e micróbios heterotróficas e autotróficas particionado pela clorofila autofluorescência (ver McDole et al. 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" width="600" /> Figura 9. Exemplo de dados metagenome microbianas. Padrões entre os dados da seqüência metagenomic microbianas e do site variáveis ​​dependentes. Aqui, a abundância relativa de Synechococcus </em&gt; spp. foi positivamente correlacionada com a tampa por cento do coral, enquanto Pelagibacter spp. não foi (painéis da esquerda). A via metabólica para a transferência conjugative foi positivamente correlacionada com as concentrações de nitrato, enquanto que a via metabólica para o reparo do DNA foi consistente entre todos os metagenomes (painéis à direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Estrela 7 </td><td> CAR9 </td></tr><tr><td> Número total de Lê </td><td> 939.311 </td><td> 591.600 </td></tr><tr><td> Número de pré-processados ​​Lê </td><td> 579.664 </td><td> 360.246 </td></tr><tr><td> A média de Sequence Length (pb) </td><td> 395 ± 131 </td><td> 451 ± 159 </td></tr><tr><td> Sequências anotados (%) </td><td> 42,218 (7,3%) </td&gt; <td> 9117 (2,5%) </td></tr><tr><td> Desconhecido (%) </td><td> 537446 (92,7%) </td><td> 351129 (97,5%) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Características dos dados de dois viromes gerados a partir das Ilhas da Linha do Sul, Starbuck e Millennium. O grau de anotação é baseada em BLAT usando o servidor MG-RAST. <img alt="Tabela 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" width="700" /> Tabela 2. Os resultados representativos mostrando dados de vários locais durante uma expedição. Os parâmetros aqui analisados ​​incluem medições química da água emparelhado com microbiana e abundâncias virais. A tabela contém ainda os nomes dos arquivos referentes aos respectivos dados metagenomic para cada local de amostragem. As concentrações de carbono e nutrientes inorgânicos são dadas em nmol / L. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" target="_blank">Por favor</a>clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology at JoVE.com

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Desvendando os jogadores invisíveis no Oceano - Um Guia de Campo para Química da Água e Microbiologia Marinha

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

unraveling-unseen-players-ocean-field-guide-to-water-chemistry-marine

Research

JoVE Journal

Environment

25.2K visualizações.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 