We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

سوف الأساليب المعروضة هنا يوفر أداة لتوليد تقييم شامل لديناميات الفيروسية والجرثومية في النظم الإيكولوجية المائية. انهم مستهدفون لقياس الأسهم يقف الموارد العضوية وغير العضوية المتاحة للمجتمعات الميكروبية وتميز ماكياج من الفيروسية والميكروبية حاضر المجتمع. بجانب قياس وفرة الفيروسية والجرثومية وفرة الكتلة الحيوية، المعلومات تسلسل الجينوم تكشف بنية مجتمعهم وظيفة. وقد وضعت جميع الطرق أو تعديلها للسماح للتطبيق في المواقع الميدانية النائية. ومع عدم وجود بيئة معملية تسيطر يخلق أصلا بعض الإمكانيات لأخطاء. نحن هنا نناقش بعض المحاذير المرتبطة بكل من المعلمات المقدرة. بجانب إمكانية التلوث أثناء التعامل مع العينة بعض المعلمات أيضا تسفر عن احتمال الخطأ في عملية التحليل. الكربون العضوي المذاب يمكن أن يحدث تلوث الكربون خلال إجراءات أخذ العينات (عينات المصب، أو على مقربة من قارب أو الغطاس)، خلال إعداد العينات (تلوث المعدات أو التعامل غير مقصود)، وحتى أثناء التخزين من عينة (عينات أخرى في الثلاجة تحتوي على العضوية المذيبات / المتطايرة). لتجنب مصادر التلوث المختلفة للسلوك كما بضع خطوات التعامل ممكن، كما نقل كل عينة يشكل مصدرا إضافيا للتلوث. يجب أن العينة لا تحصل على اتصال مع أي بند لا حمض غسلها أو حرقها. أخيرا، تعيين الفريزر التخزين حصرا للعينات لا تحتوي على المواد العضوية المتطايرة وضمان سلامة العينات خلال فترات التخزين الطويلة. إذا لا يمكن أن تبقى العينات المجمدة خلال الفترة تحمض السفر لفترات طويلة من عينات DOC مع حمض الهيدروكلوريك المركز (كما هو موضح 38-41) قد يكون بديلا للتطبيق. للتحقق من دقة قياس المواد المرجعية إجماع DOC ينبغي استخدام ريجularly خلال قياس DOC تشغيله. خصوصا المياه في أعماق البحار (&gt; 2000 م) إشارات ذات قيمة في تقييم أداء الآلة التحليلية كما أنها مستقرة جدا في محتوى DOC في 42. جسيمات المواد العضوية بالإضافة إلى تجنب التلوث الكربون العضوي، وتتطلب أخذ العينات بوم اهتماما خاصا لضمان دقة من حجم المصفاة. وإذا كان حجم استهداف 500 مل يجب أن يخرج لأي سبب من الأسباب المحتملة هذا يحتاج إلى الإشارة إلى ربط كمية بوم القبض على مرشح لالراشح منها تم اشتقاق ذلك. المغذيات غير العضوية كما هو الحال مع أخذ عينات من الكربون العضوي، ويجب إيلاء الاهتمام لاحتمال تلوث العينة العناصر الغذائية المولدة من مصادر مختلفة مثل المراكب أو تصريف مياه الصرف الصحي (12). الفلاتر المستخدمة لأخذ عينات من الكربون العضوي مع أحجام المسام اسمية قدرها 0.8 ميكرون، قد لا تستثني كل الكتلة الحيوية الميكروبية وSHولد بالتالي تغييرها إلى 0.2 ميكرون مرشحات لهذه الخطوة الترشيح. وعلاوة على ذلك، وحدود الكشف تشكل مشكلة مع عينات المواد الغذائية؛ خاصة في المياه السطحية الشحيحة حول العديد من مواقع الشعاب المرجانية (على سبيل المثال، Cotner وآخرون. 43). حدود الكشف هي تقريبا حول 0.1، 0.2، و 0.1 ميكرومول / لتر لالامونيوم والنترات والنتريت، وأورثو فوسفات على التوالي (انظر 36،12،37) المجهر بجانب التغيرات في تركيز تحليل عينات الصور من الشرائح المجهر ينتج المزيد من احتمالات الأخطاء. على سبيل المثال، قد تكون الصور من التركيز في بعض المناطق في مجال الرؤية، والتركيز في مناطق أخرى. كما عالية النقاء الألومينا مرشح المصفوفة هو نوع فلتر جامد جدا، أي حطام تحت التصفية قد يسبب مرشح كله على الجلوس على زاوية إلى الشريحة. ونتيجة لذلك، يمكن للصور أن تكون دائما من التركيز في أجزاء مختلفة من مجال الرؤية لمرشح معين، وإعادةgardless المحاذاة المجهر. إعادة التنضيد والمرشحات، وضمان السفلي من مرشح نظيفة، ويمكن تحسين هذا إذا لوحظ. أيضا، في بعض الحالات قد يكون هناك اثنين من طائرات التنسيق فيها الفيروسات والميكروبات يمكن العثور عليه. هذا هو نتيجة لأشياء ملطخة تصبح بعيدة عن مرشح على تصاعد والعائمة تصل إلى الجانب السفلي من غطاء الانزلاق التي يمكن أن تجعل التهم لا يمكن الاعتماد عليها. لذا فمن المستحسن دائما للتحقق من نوعية العينات أثناء العملية. التدفق الخلوي كما هو الحال مع عينات مجهرية، قد تكون هناك اختلافات بين التدفق الخلوي العينات التي تتطلب تعديلات للعملية التحليلية التي تحدث بشكل طبيعي. على سبيل المثال، تبعا لحساسية الجهاز، قد تكون الاستشعاع خافت خلايا Prochlorococcus دون مستوى الضجيج ولن يكون كميا. حبات بمثابة عنصر تحكم عينة الداخلية (على سبيل المثال، للتأكد من أن التركيب الصكonse إلى إشارات الفلورسنت يتسق من يوم إلى يوم (ويبقى مستقرا خلال الفترة السابقة نفسها). إذا أضيفت إلى عينة بتركيزات معروفة، كما أنها يمكن أن تكون بمثابة الرقابة الداخلية للتحقق من المدى حجم العينة. ومع ذلك، فمن المستحسن لتشغيل دائما قسامة من المجمدة سابقا &quot;القياسية&quot; عينة مياه البحر التي تم إذابة والملون مع عينات من الاهتمام لتوفير المكافحة البيولوجية إضافية للتعامل بين أشواط لوحة 96-جيدا العينة. اعتمادا على الموقع، وعينات من مياه البحر قد تبدو مختلفة جدا عن بعضها البعض. يمكن فرز السكان &quot;التمثيلي&quot; ثم عرض تحت المجهر epifluorescent (EM) أن يكون وسيلة جيدة للتحقق بسرعة السكان العوالق النباتية إما Synechococcus س. أو حقيقيات النوى الضوئي. Prochlorococcus الخلايا عادة ما تكون غير مرئية تحت EM لأنها تتلاشى بسرعة كبيرة. بالإضافة إلى كلوروفيل أ، Synechococcus س. تحتوي أيضا على درجة الحموضةphycoeurythrin otopigment (PE)، والتي تنبعث الضوء بأطوال موجية أقصر (540-630 نانومتر) من الكلوروفيل أ (660-700 نانومتر). عندما متحمس خلايا Synechococcus مع الأزرق / الضوء الأخضر (470-490 نانومتر)، فإنها ستظهر الذهبي إذا ما نظر إليها في إطار تصفية الانبعاثات التي تزيل جميع الأطوال الموجية للضوء أقل من 510 نانومتر. وعلى سبيل المقارنة، فإن نسبة حقيقية النواة تبدو حمراء، عندما متحمس بنفس الطول الموجي للضوء. Metagenomics الفيروسية من المهم أن نلاحظ أن عملية تركيز فلب والتخزين تؤثر على المجتمع استردادها. يمكن أن يحدث فقدان الجسيمات الفيروسية في كل خطوة في هذه العملية، وبالتالي، فإن اختيار تنقية وتخصيب بروتوكولات الفيروسية يمكن أن تؤثر في نهاية المطاف التكوين التصنيفي الملحوظ وتنوع metagenomes الفيروسي الناتجة 44،45،18. يمكن أن يتم تركيز العينات باستخدام TFF 19 أو الكيماوية التلبد 20. في هذا النهج، posit الكيماويةاتهم ively أيونات الحديد تربط الجزيئات الفيروسية بشكل طبيعي سالبة الشحنة تشكيل (&gt; 8 ميكرون) مجمعات للحديد الفيروسية الكبيرة التي تلبد من الحل، ويمكن استردادها باستخدام مرشحات 8 ميكرون. بعد ذلك تم بالكلاب الحديد قبالة الجسيمات الفيروسية وإعادة حله باستخدام المغنيسيوم، وحامض الأسكوربيك، وEDTA، وترك الجزيئات الفيروسية المركزة لاستخراج الحمض النووي 20. بعد مقارنة هذه الطرق الحالية اثنين، استنتجنا أن طريقة كلوريد الحديد هو أقل استهلاكا للوقت من TFF تركيز الفيروسي، ولكن قد تنتج بعض المحاذير. وجدنا أن تفكك وانحلال الحديد للفيروسات يتطلب شقين أكثر تركيزا حل المغنيسيوم، حمض الاسكوربيك EDTA مما ذكر 20 من أجل حل بالمضي قدما قبل يحط حامض الاسكوربيك. وبصرف النظر عن هذه المسألة، وبروتوكول ينقي الجسيمات الفيروسية التي كتبها الحجم التجزئة وحدها، وإزالة الملوثات الميكروبية باستخدام 0.2 ميكرون الترشيح. الفيروسات الكبيرة لا تمر عبر FILTإيه (على سبيل المثال، يانغ وآخرون. 46) وبالتالي لن يتم الكشف في metagenome، في حين تفعل بعض البكتيريا (McDole، بيانات غير منشورة). هذا يؤدي إلى تلوث جرثومي في حين التمييز ضد الفيروسات الكبيرة. إلا أن قضية محددة وثيقة الصلة أيضا لإزالة الميكروبات في اتصال مع تركيز TFF. كما ثبت أن العلاج الكلوروفورم لإزالة الفيروسات الحساسة الكلوروفورم مع الأغشية الدهنية الخارجية 47 تشير بعض الدراسات إلى أن 0.22 ميكرون الترشيح يمكن استخدامها لإزالة معظم البكتيريا. كما ينبغي الإشارة إلى أن طريقة عرض يستهدف في المقام الأول الجراثيم، الناقل الأكثر وفرة من المواد الوراثية في البيئات البحرية. لأن فج ويعتقد عموما لا يحتوي على الدهون عادة 48 أنها أكثر مقاومة للعلاج الكلوروفورم. على حد علمنا لا يوجد طريقة &quot;اللحاق جميع&quot; حتى الآن. الطريقة المعروضة هنا يتم تكييف من OUالخبرة الميدانية ص على مدى السنوات ال 10 الماضية في مختلف البيئات البحرية الاستوائية التي تمتد إلى نظم القطب الشمالي. الميكروبية Metagenomics بناء المكتبات ميتاجينومية عن الميكروبات (مثل البكتيريا والعتيقة) هو أكثر وضوحا من metagenomes الفيروسي كما أنه من الأسهل لتوليد تركيزات الحمض النووي الحد الأدنى المطلوب لإعداد مكتبة. رابط تضخيم بندقية مكتبات (LASLs) 17،49،50 وكله الجينوم التضخيم القائم على التضخيم متعددة التشريد (MDA) هما الأساليب الأكثر شيوعا لتوليد الحمض النووي الكافي لتسلسل. استخدام نجمة داود الحمراء في الحصول على الحمض النووي تركيزات أعلى في metagenomes الميكروبي ضروري في بعض الأحيان. ومع ذلك، يمكن أن يسبب هذا القطع الأثرية في تسلسل البيانات، مثل overamplification من minicircles دوامي السياط. ومن المعروف أن الأساليب MDA تفضيلي لتضخيم الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل ودائرية، مما أدى إلى نتائج غير الكمية 51،52. الاقتراب من LASLs الأمثل وبالتالي قد 50 بمثابة بديل أفضل في تضخيم كل من الجراثيم والحمض النووي الفيروسي للميتاجينومية التسلسل. من المهم أن نلاحظ أن النهج LASLs له خطوات متعددة، ويتطلب معدات متطورة، ويقتصر على القوالب dsDNA. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أنسجة عدة استخراج الحمض النووي لاستخراج الحمض النووي من كل من غرام وغرام إيجابي سلبي من الكائنات الحية، ولكن لم يتم التحقق منه لأصناف الجراثيم بشكل فعال المتمردة ليز أو الهياكل المرتبطة بها (على سبيل المثال، العتيقة معين، الأبواغ أو الجراثيم الفطرية) . بالتالي خطوة الضرب حبة قد يكون من الضروري الحصول على الحمض النووي من بعض الميكروبات. وهذه التقييمات الشاملة يؤدي إلى فهم أفضل لعمل الفيروسية والجرثومية النظام البيئي. على الرغم من إجراء بعض الدراسات لتقييم جهود جميع المعلمات المقترحة، وكثير منها تم التحقيق مختارة. اقترح نيلسون وآخرون. 53 اتصال betwالتابعين موائل الشعاب محددة واستنفاد في كل من DOC والعوالق البكتيرية تركيزات النسبية إلى المياه البحرية. وقد رافق هذه التغييرات التركيز من قبل التفرقة مميزة للمجتمعات العوالق البكتيرية. Dinsdale وآخرون. 5 أظهرت أن زيادة التأثير البشري رافقه 10X فرة أعلى من الخلايا الميكروبية وجزيئات شبيهة بالفيروس. كانت المجتمعات الميكروبية في المياه البحرية المحيطة الجزر المأهولة أيضا حصصا متزايدة من heterotrophs ومسببات الأمراض المحتملة 5. أخيرا McDole وآخرون. 4 أظهرت، من خلال تقديم النتيجة microbialization، أن الأنشطة البشرية تتحول الطاقة إلى الميكروبات، على حساب من macrobes. هذه الدراسات ركزت على الجراثيم والكيمياء الماء معايير محددة، وتوفر رؤى جديدة في هيكل النظم الإيكولوجية البحرية والكيمياء الحيوية. الجمع بين البيانات التقليدية من جهود الرصد البيئي - مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة القيم، والكتلة الحيوية الأسماك وdiversiتاي، غطاء القاعية، أو التعرض لتأثير الإنسان - مع كيمياء المياه والتقييمات الميكروبية، سيؤدي على الأرجح في جهود الرصد البيئي أكثر حساسية، مما قد يؤدي إلى جهود المحافظة المستهدفة بشكل أكثر تحديدا.

وتتعرض النظم الإيكولوجية البحرية لمجموعة واسعة من الاضطرابات التي تؤدي إلى تغييرات من توافر المغذيات إلى الكتلة الحيوية من الحيوانات المفترسة مهيمنة. على مدى العقد الماضي، وقد أثبتت دراسات متعددة على أهمية المجتمعات الميكروبية في النظم الإيكولوجية البحرية 1-4. فمن الواضح أن التغيرات في المجتمع البكتيري والفيروسي وترتبط بشكل وثيق مع التدهور العام للبيئة البحرية 5. قد تكون سهلت هذه التغييرات من قبل الجيوكيمياء تغير في عمود الماء مثل توافر الأكسجين أو إعادة التمعدن الكربون 6،7. نتيجة الترابط بين macroorganisms، كيمياء المياه والنشاط الميكروبي حلقات التغذية المرتدة يمكن تسريع وتيرة التدهور البيئي 8. في 1970s و 80s جرت محاولات متعددة لكشف الدورات البيولوجية الكيميائية في النظم الإيكولوجية البحرية 9-11. كان واحدا من التحديات الرئيسية لهذه الدراسات في وقت مبكر لعدمنهج موحدة لقياس المعلمات البيوكيميائية تقييمها. وإن كانت هناك بروتوكولات المتاحة، في المقام الأول على المواد المغذية 12،13 مياه البحر، وتقييم ديناميات الكربون وبنية المجتمع الميكروبي كانت تقتصر من قبل على الأدوات والأساليب المتاحة. مع أساليب المقارنة JGOFS EqPac، وشارب وآخرون. 14 واقترح لأول مرة على بروتوكول موثوقة وموحدة لتقييم الكربون العضوي المذاب (DOC) التركيز. من قبل 2000s في وقت مبكر التحديات التحليلية لتحديد الموارد المتاحة للمجتمع الميكروبي وبالتالي قد تم حلها إلى حد كبير ونهج تميز المجتمعات الميكروبية في البيئات التي تسيطر عليها ثقافة أنشئت (انظر ديلونغ 15). تعتمد الطرق التقليدية التسلسل في ذلك الوقت إلى حد كبير على ثقافات نسيلي المزروعة. أوائل التسلسل الجيني للعينات البيئية الطبيعية كشف، مع ذلك، أن غالبية التنوع البيولوجي الميكروبي قد ضاعت من قبل النباتات المزروعةالأساليب القائمة على أوجه 16. في عام 2002، Breitbart وآخرون 17 بندقية تستخدم التسلسل لأول مرة لوصف المجتمع فيروسية في عينات مياه البحر البيئية تأسيس طريقة لتسلسل الجينوم الكامل للمجتمعات الفيروسية البحرية جاهل. ضمن تقديرات الميكروبية الموجودة، والفيروسات لا تزال لا سيما في ظل مدروسة، حيث أن معظم من الصعب الثقافة وأنها تفتقر إلى علامة الحفظ عالميا مثل 16S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) الجينات التي تستخدم عادة لتقييم التنوع والتنميط المجتمعي. يوفر نهج التسلسل ميتاجينومية بديلا للأساليب التي تعتمد على الثقافة واستهداف الجينات لتحليل المجتمعات الفيروسية المعقدة. بينما التسلسل أول metagenomes الفيروسية الناتجة عن مياه البحر باستخدام سانجر تسلسل 17، وقد أدى تطوير تقنيات التسلسل من الجيل التالي والتقنيات الجزيئية محسنة لزيادة سريعة في الدراسات ميتاجينومية 18 </sتصل&gt;. سير العمل المختبر الحالي للmetagenomics الفيروسية ينطوي على الفصل، والإثراء، و / أو تركيز الجسيمات الفيروسية، تليها الحمض النووي (DNA أو RNA) استخراج وإعداد المكتبة، والتسلسل 19-21. لمزيد من المعرفة القائمة على فيروسية، جرثومية وعمل الكيمياء الحيوية في النظم الإيكولوجية المائية، مقارنة مجموعات البيانات في الأنظمة المختلفة في جميع أنحاء العالم أمر ضروري. ومع ذلك، فقد تم تطويرها بشكل كبير على البروتوكولات التي أنشئت لالبيئات القريبة من الشاطئ مع مرافق المختبرات الوصول إليها بسهولة. وبالتالي، عدم وجود طرق موحدة الحقل يعرقل هذه المقارنات عبر النظام البيئي. هنا نقدم اختبرنا بدقة وموحدة جيدا التكيفات من الدولة من بروتوكولات الأبحاث الفنية للاستخدام في المواقع الميدانية النائية. وقد أثبتت هذه الأساليب الناجحة في دراسات متعددة تغطي العقد الماضي 5،22 وتستخدم حاليا من قبل مختلف المختبرات البحرية وكذلك على نواتقييم الشعاب المرجانية وبرنامج رصد (RAMP) في جميع أنحاء المحيط الهادي 4. وتشمل بروتوكولات أخذ العينات المعلمات المياه الكيمياء (تركيزات الكربون العضوية وغير العضوية، وتركيز المغذيات غير العضوية)، وفرة الفيروسية والجرثومية (بكتريا مباشرة، التهم الفيروسية مباشرة، والتدفق الخلوي لتقييم ذاتي التغذي مقابل نسب غيري التغذي)، والفيروسية والجرثومية بنية المجتمع و إمكانات التمثيل الغذائي من خلال تحليل ميتاجينومية (لمحة عامة انظر الشكل 1). يطلب من النتائج التي تم الحصول عليها من الأساليب المذكورة هنا من أجل توضيح معالم الخلفية البيولوجية الكيميائية الأساسية اللازمة لتوصيف شامل النظم الإيكولوجية المائية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1307">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:325px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration setup&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 &#8211; 36 % Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A508-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">High-density polyethylene (HDPE) container</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Combustion oven (550&#176; C)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml HDPE vials&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02-896-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">25 mm GF/F filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-874-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>XX62-000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, non-powdered gloves</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">19-170-010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bilge pump&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Thirsty Mate 124PF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 l collapsible low-density polyethylene carboy&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Reliance Fold A Carrier II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>CFP-2-E-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum-cured silicon tubing for TFF</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>96440-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hose clamps</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>P-68007-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-77410-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8.0 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVHV010RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-125-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml plastic scintillation bottle&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>03-341-72C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clean bucket (10 - 20 L)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 % glutaraldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m&#160; high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DAPI solution 25 &#181;g ml-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular grade water</td>
			<td>sigma aldrich</td>
			<td>W-4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>BP351-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP399-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>G31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slide</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate task wipe&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide Station with vacuum pump</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">DNA extraction kit</td>
			<td style="width:217px;">Macherey-Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td>Nucleospin tissue kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Proteinase K (20 mg ml-1)</td>
			<td style="width:217px;">Lifetechnologies</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-proof 100% Ethanol</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45503-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cesium chloride (CsCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>bp1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m alumina matrix disposable syringe filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>O992613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra - swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:149px;">333790</td>
			<td>SW41 Ti Rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DNase I (100 u &#181;l-1)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycogen</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">G-1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 % Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:149px;">15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2473-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02674-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20 &#956;g ml-1 Proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">p3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">50ml Oak Ridge Tube&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">05-562-16B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

نقدم لك هنا مجموعة من بروتوكولات الأبحاث اختبارها بدقة وقياسية جيدا تكييفها للاستخدام في البيئات البحرية البعيدة. وتشمل بروتوكولات أخذ العينات وتقييم الموارد المتاحة للمجتمع الميكروبية (الكربون العضوي المذاب، الجسيمات العضوية والمغذيات غير العضوية)، ووصف شامل للمجتمعات الفيروسية والبكتيرية (عبر التهم الفيروسية والجرثومية المباشرة، تعداد الميكروبات autofluorescent، و بناء metagenomes الفيروسي والجرثومي). نحن نستخدم مزيج من الأساليب، التي تمثل حقل مشتتة من التخصصات العلمية التي تضم بروتوكولات أنشئت بالفعل وبعض من أحدث التقنيات المتقدمة. تقنيات التسلسل خاصة ميتاجينومية تستخدم لالفيروسية والبكتيرية توصيف المجتمع، وقد أنشئت في السنوات الأخيرة فقط، وبالتالي لا يزال يخضع لتحسين مستمر. وقد أدى هذا إلى مجموعة متنوعة من CURREN إجراءات أخذ العينات وتجهيز العيناتTLY في الاستخدام. مجموعة من الأساليب المعروضة هنا يوفر ما يصل الى نهج موعد لجمع وتجهيز العينات البيئية. المعلمات تناولها مع هذه البروتوكولات تسفر الحد الأدنى على المعلومات الأساسية لتوصيف وفهم الآليات الكامنة وديناميكية المجتمع الفيروسية والجرثومية. أنه يعطي سهلة لمتابعة المبادئ التوجيهية لإجراء مسوحات شاملة ويناقش الخطوات الحاسمة والمحاذير المحتملة ذات الصلة إلى كل أسلوب.

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology at JoVE.com

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

كشف اللاعبين غير مرئي في المحيط - دليل ميداني للكيمياء المياه وعلم الأحياء المجهرية البحرية

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

unraveling-unseen-players-ocean-field-guide-to-water-chemistry-marine

Research

JoVE Journal

Environment

25.2K Views.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 

Video: Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

A whole cell bioreporter assay with Burkholderia sartisoli RP037-mChe was developed to detect fractions of an organic contaminant (i.e., fluorene) available for bacterial degradation after active transport by mycelia bridging air-filled pores in a water unsaturated model system.

ككل نهج Bioreporter خلية لتقييم النقل والتوافر الحيوي للملوثات العضوية في أنظمة غير المشبعة المياه

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

مختبر الأحيائي تغذية الأسماك لتقييم آخر Antipredatory من المركبات الثانوية من الأنسجة من الكائنات البحرية

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

جل الآلي الحجم التحديد لتحسين نوعية المكتبات تسلسل الجيل المقبل من إعداد من عينات المياه البيئة

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

وPCR الفحص دوبلكس الرقمي للوقت واحد الكمي ل<em&gt; المعوية النيابة.</em&gt; وما يرتبط بها من البراز-الإنسان HF183 علامة في المياه

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

نظيفة أخذ العينات وتحليل نهر ومصبات الأنهار المياه للدراسات المعدنية تتبع

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP، وتحسين أسلوب INEX ل<em&gt; في الموقع</em&gt; قياس الجسيمات والمذاب المركبات التي تتم معالجتها بواسطة مغذيات تعليق النشطة

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

بروتوكول للجزيئات البلاستيك الصغيرة أخذ العينات على سطح البحر وتحليل عينة

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Controlled-release of Chlorine Dioxide in a Perforated Packaging System to Extend the Storage Life and Improve the Safety of Grape Tomatoes

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties of the pouch were monitored in containers with or without fruit. The pouch was affixed to the inside of a perforated clamshell containing grape tomatoes, and the effect on microbial population, firmness, and weight loss was evaluated during a 14 day storage period at 20 &#176;C. Within 3 days, the ClO2 concentration in the clamshells reached 3.5 ppm and remained constant until day 10. Thereafter, it decreased to 2 ppm by day 14. The ClO2 pouch exhibited strong antimicrobial activity, reducing Escherichia coli populations by 3.08 log CFU/g and Alternaria alternata populations by 2.85 log CFU/g after 14 days of storage. The ClO2 treatment also reduced softening and weight loss and extended the overall shelf life of the tomatoes. Our results suggest that ClO2 treatment is useful for extending the shelf life and improving the microbial safety of tomatoes during storage without impairing their quality.

Here, we describe a protocol for the application of a novel, slow-release ClO2 product that reduces spoilage and extends the shelf life of fresh fruit. The slow-release ClO2 product was added to standard commercial grape tomato packaging and tested against Escherichia coli and Alternaria alternata.

تسيطر عليها الافراج عن ثاني أكسيد الكلور في نظام تغليف مثقوبة لتمديد حياة التخزين وتحسين سلامة العنب الطماطم

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

استخراج المبيدات العضوية من البلاستيك الكريات والبلاستيك تحليل نوع

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

أوزة إيمبروفيسوس بالانوس "نموذج البحرية"-استزراع و "التعبير الجيني"

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...