We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

ここで紹介する方法は、水生生態系におけるウイルスおよび微生物動態を総合的に評価を生成するためのツールを提供します。これらは微生物群集への利用可能な有機および無機資源の立って株式を定量化すると、ウイルスや微生物群集の存在メーキャップを特徴づけるためにターゲットとしている。次にウイルス豊かさと微生物の豊かさとバイオマスを定量化するために、ゲノム配列情報は、彼らのコミュニティの構造と機能を明らかにしている。すべての方法が開発またはリモートフィールド位置における適用を可能にするように改変されている。しかし制御された実験室の設定の欠如は、本質的なエラーのためのいくつかの可能性が生じる。ここでは、評価されたパラメータのそれぞれに関連付けられたいくつかの注意点について説明します。次汚染の可能性への試料中にも分析プロセスにおいてエラーの可能性をもたらすいくつかのパラメータを処理する。 溶存有機炭素炭素汚染は（下流サンプリング、またはボートやダイバーの近くで）、試料調製中（機器または不注意な取り扱いの汚染）、さらには、試料の保存中に（他のサンプルを冷凍庫で有機含むサンプリング手順の間に発生する可能性が溶剤/揮発性物質）。各サンプルの再配置は、汚染の追加のソースを提起するように、可能な限り少ない操作ステップとして汚染行為のさまざまな情報源を避けるために。サンプルを洗浄したり燃焼し酸ではない任意の項目と接触して取得するべきではありません。最後に、揮発性有機物質を含有しないサンプル専用のストレージ·冷凍庫を指定すると、より長い貯蔵期間中にサンプルの完全性を確保します。サンプルは、濃HClでDOCサンプルの拡張移動期間酸性化中に凍結保存することができない場合（38〜41に記載のように）適用される代替することができる。測定精度DOCコンセンサス標準物質がregのに使用されるべきであることを確認するにはDOC測定実行中にularly。特に海洋深層水（&gt; 2000メートル）の参照、そのDOCコンテンツ42に非常に安定しているような分析機械の性能を評価する上で貴重である。 粒子状有機物有機炭素の汚染を回避することに加えて、POMサンプリングを濾過容積の正確さを保証するために特別な注意を必要とする。 500ミリリットルのターゲットボリュームは、潜在的な理由で外れる必要がある場合、これは、それが由来したのろ液に、フィルタ上に捕捉されたPOMの量を関連付けることに注意する必要があります。 無機栄養素有機炭素のサンプリングと同じように、注意がボートや排水放電12のような様々な情報源で生成された可能性栄養素試料汚染を払わなければならない。 0.8μmの公称孔径を有する有機炭素サンプリングに使用されるフ​​ィルタは、すべての微生物バイオマスおよびshを除外しないかもしれないウルドは、したがって、この濾過工程のために0.2μmのフィルタに変更すること。また、検出限界は、栄養サンプルに問題を提起する。特に多くのサンゴ礁の場所（ 例えば 、Cotner ら 43）の周りに貧栄養表層水で。検出限界は、おおよその周りに0.1、0.2、およびアンモニウム、硝酸塩や亜硝酸塩、およびオルト-リン酸0.1モル/ Lのそれぞれ（36,12,37を参照）である顕微鏡検査顕微鏡スライドからのサンプル画像分析物の濃度の変化の横さらなるエラーの可能性をもたらす。例えば、画像は、視野の一部の地域では、焦点から外れて、その他の焦点である。高純度アルミナマトリックスフィルタは、非常に剛性のフィルタタイプであるように、フィルタの下のごみは、全体のフィルタがスライドに角度の上に座る可能性があります。その結果、画像は、特定のフィルタの視野の様々な部分に焦点から外れ一貫することができ、再顕微鏡整列のgardless。それが観察されている場合、フィルタを再マウント、フィルターの下の確保がきれいで、これを改善することができます。また、場合によっては、ウイルスや微生物が見出されることができる2つの焦点面が存在してもよい。これは実装時のフィルタから離脱しつつ、かつカウントが信頼できないことができますカバースリップの下側に浮上染色オブジェクトの結果である。したがって、常にプロセスの間に、サンプルの品質をチェックすることをお勧めします。 フローサイトメトリー顕微鏡の試料と同様に、分析プロセスの調整を必要とサンプルをフローサイトメトリーとの間の天然に存在する違いがあるかもしれません。例えば、機器の感度に応じて、薄暗い蛍光Prochlorococcus細胞がノイズレベル以下とすることができ、定量化されない。ビーズは、測定器のRESPことを確認するために、 例えば 、（試料内部対照として役立つ蛍光シグナルへオンセは日から一貫している（そして、実行自体の間に安定したまま）。既知の濃度で試料に加えた場合、彼らはまた、試料体積の実行を確認するための内部対照として役立つことができる。しかし、それは常に96ウェルプレート実行間サンプルの取り扱いのための追加の生物学的コントロールを提供するために、関心のあるサンプルと一緒に解凍し、染色されている以前に凍結された「標準」海水試料のアリコートを実行することをお勧めします。場所によっては、海水試料は、互いに非常に異なって見える場合があります。迅速シネココッカス·エスピーまたは光合成真核生物のいずれかとして植物プランクトンの個体数を確認するには良い方法であることができる「代表」集団をソートして、落射蛍光顕微鏡（EM）の下に表示する。Prochlorococcus細胞は、彼らが速すぎてフェードので、EMの下で、通常は表示されません。また、 シネココッカス·エスピークロロフィルする。また、pHを含めるクロロフィルA（660から700ナノメートル）より短い波長（540から630 nm）の光を発光するotopigment phycoeurythrin（PE）。 シネココッカス細胞は青/緑色光（470〜490ナノメートル）で励起されると510 nm以下の光のすべての波長を取り除く発光フィルターの下で見た場合、彼らは黄金色に表示されます。光の同じ波長で励起されたときの比較により、真核画分は、赤になります。 ウイルスメタゲノムこれは、VLPの濃度および貯蔵の過程を回収コミュニティに影響を与えることに留意することが重要である。ウイルス粒子の損失は、プロセス内のすべての段階で発生できるので、ウイルスの精製および濃縮プロトコルの選択は、最終的には結果としてウイルスメタゲノム44,45,18の観察分類学的組成や多様性に影響を与えることができる。サンプルの濃度は、TFF 19または化学ベースの凝集20を用いて行うことができる。化学ベースのアプローチでは、電着物ively帯電した鉄イオンは自然に負に帯電したウイルス粒子が溶液から凝集し8ミクロンのフィルターを用いて回収することができる大規模な（&gt;8μmの）鉄 - ウイルス複合体を形成する結合する。続いて、鉄は核酸抽出20の濃縮ウイルス粒子を残し、マグネシウム、アスコルビン酸、およびEDTAを使用してウイルス粒子をオフにキレート化され、再溶解される。これら二つの現在の方法を比較した後、我々は、塩化鉄法はTFFウイルス濃度未満で時間がかかるが、いくつかの注意点をもたらすことができると結論付けた。我々は、鉄ウイルスの解離および溶解が、アスコルビン酸が分解する前に進める溶解するために20を報告したよりも2倍以上濃縮されたマグネシウム-アスコルビン酸-EDTA溶液を必要とすることを見出した。さておき、この問題から、このプロトコルは、0.2μmの濾過を用いて微生物の汚染物を除去する、単独のサイズ分画によりウイルス粒子を精製する。大型のウイルスはFILTを通過しないER（ 例えば 、Yang ら 46）、従ってメタゲノム中に検出されませんが、いくつかの細菌が行う一方、（McDole、未発表データ）。大ウイルスを差別しながらこれは細菌汚染が生じる。 その特定の問題がしかしTFF濃度との接続中の微生物の除去にも関連しています。クロロホルム処理、外部脂質膜47をクロロホルムに敏感なウイルスを除去することが示されているように、いくつかの研究では、0.22μmのろ過細菌の大部分を除去するために使用できることを示唆している。また、提示された方法は、主に、バクテリオファージ、海洋環境における遺伝物質の最も豊富なキャリアをターゲットに留意すべきである。ファージは、一般的に、それらがクロロホルム処理に対してより耐性である脂質48を一般的に含んでいないと考えられるからである。我々の知る限りでは「キャッチオール」の方法は、これまでに存在しません。ここで紹介する方法は、OUから適応されている北極のシステムにまたがる熱帯様々な海洋環境の最後の10年間のRフィールドでの経験。 微生物メタゲノムそれは、ライブラリ調製に必要な最小限のDNA濃度を生成することが容易であるように、微生物のためのメタゲノムライブラリーの構築（ すなわち 、バクテリアや古細菌）ウイルスのメタゲノムよりも簡単です。複数置換増幅（MDA）に基づくリンカー増幅ショットガンライブラリ（LASLs）17,49,50および全ゲノム増幅は、配列決定のために十分なDNAを生成するために、2つの最も一般的に使用される方法である。微生物メタゲノムより高いDNA濃度を得るためにMDAの使用が必要な場合がある。しかし、これはそのような渦鞭毛藻ミニサークルのoveramplificationとして配列データ内のアーチファクトを引き起こす可能性があります。 MDA法は、非定量的な結果51,52、結果として優先的に一本鎖および環状DNAを増幅することが知られている。最適化されたLASLsは50に近づき、微生物および配列決定のためのウイルスメタゲノムDNAの両方を増幅する中、より良い代替手段として役立つことがあります。これはLASLsアプローチは、複数のステップを有する精巧な装置を必要とし、二本鎖DNAテンプレートに限定されていることに留意することが重要である。さらに、組織DNA抽出キットは、グラム陽性およびグラム陰性の門の両方からDNAを抽出することが示されているが、それは効果的に溶解する難治微生物の分類群またはそれらに関連する構造（ 例えば 、ある種の古細菌、胞子、または真菌胞子）に検証されていない。したがって、ビーズビーティングステップある種の微生物からDNAを得るために必要であり得る。 これらの総合的な評価は、ウイルスおよび微生物生態系の機能をより良く理解することになります。いくつかの研究が提案されたすべてのパラメータを評価するための努力を行ってきたが、多くは選択されたものを調査してきた。 Nelson ら 53は betw接続を示唆沖合からの相対の両方のDOCとbacterioplankton濃度の具体的なサンゴ礁の生息地や枯渇をEEN。これらの濃度変化がbacterioplanktonコミュニティの明確な分化を伴っていた。 Dinsdale ら 5が増加人為的影響が微生物細胞およびウイルス様粒子の10倍より高い存在量を伴っていたことを示した。有人島を囲む海域における微生物群集も従属し、潜在的な病原体5の大きな画分を持っていた。最後McDole ら 4は、人間活動がmacrobesを犠牲にして、微生物にエネルギーをシフトしていること、microbializationスコアを導入することによって示した。これらの研究は、海洋生態系の生化学的構造に小説洞察を提供、特定の微生物と水の化学パラメータに焦点を当てた。温度およびpH値は、魚のバイオマスと多様化のように - 生態系モニタリング努力の伝統的なデータを組み合わせるTY、底生カバー、またはヒトへの影響への暴露 - 水化学及び微生物アセスメントで、おそらくより特異的に標的保全活動につながる可能性がより敏感な環境モニタリングへの取り組み、になります。

海洋生態系は頂点捕食者のバイオマスへの栄養素利用から変化をもたらす摂動の広い範囲に供される。過去10年間、複数の研究では、海洋生態系1-4微生物群集の重要性を実証している。これは、細菌およびウイルスのコミュニティの変化が密接に海洋環境5の全体的な低下と関連していることは明らかである。これらの変化は、酸素の可用性または炭素再石灰6,7として水柱に改変された地球化学によって容易にすることができる。マクロ生物間の相互依存性の結果として、水の化学的性質と微生物活動のフィードバックループは、生態系の劣化8の速度を加速することができる。 1970年代と80年代に多数の試みが海洋生態系9-11に物質循環を解明するために行われた。これらの初期の研究のための主要な課題の一つは不足だった査定生物地球化学的パラメータを測定するための標準化されたアプローチの。主に海水の栄養分12,13上で利用可能なプロトコル、ありましたけれども、炭素動態の評価と微生物群集構造が利用可能なツールおよび方法によって制限されていました。 JGOFS EqPac方法比較すると、シャープら 14は初めて溶存有機炭素（DOC）濃度評価のための信頼性の高い標準化されたプロトコルのために提案した。 2000年代初頭によって（デロング15を参照）微生物群集への利用可能なリソースを決定するための分析的な課題は、このように大部分が解決されていたし、制御培養環境中で微生物群集を特徴付けるためのアプローチが確立されていた。当時の伝統的な配列決定方法は、主に栽培クローンの文化に依存していました。天然試料の初期の環境遺伝子配列は、微生物多様性の大部分はcultivによって見逃されていたことが明らかになったATIONベースの方法16。 2002年には、Breitbart ら 17は、培養されていない海洋ウイルスのコミュニティの全ゲノムを配列決定する方法を確立し、環境海水試料中のウイルスのコミュニティを記述するために初めてショットガンシーケンシングを使用していました。 ほとんどは培養が困難であるとして、既存の微生物アセスメントの中では、ウイルスはまだ、特に下に研究されたままであり、彼らはそのような16SリボソームRNA（rRNAの）は、典型的には、多様性とコミュニティプロファイリングを評価するために使用される遺伝子として普遍的に保存されたマーカーを欠いている。メタゲノムシーケンシングアプローチは、複雑なウイルスのコミュニティを分析するための文化に依存すると遺伝子標的方法に対する代替手段を提供します。海水から生成された最初のウイルスメタゲノムはサンガー配列17を使用して配列決定したが、次世代配列決定技術および改善された分子技術の開発は、メタゲノム研究18の急速な増加につながっている</s&gt;まで。ウイルスメタゲノミクスの現在の研究室のワークフローは、核酸（DNAまたはRNA）を抽出、ライブラリの準備、および配列決定19-21に続くウイルス粒子の分離、濃縮、および/ ​​または濃度を伴う。 水界生態系におけるウイルス、微生物および生化学的機能に対する既存の知識を促進するため、世界中の様々なシステムのデータセットを比較することが不可欠です。しかし、確立されたプロトコルは、主に容易にアクセス可能な研究施設とニアショア環境向けに開発されてきた。したがって、標準化されたフィールド法の欠如は、これらのクロス生態系の比較を妨げる。ここでは、遠隔フィールド位置で使用するための芸術研究プロトコルの状態から徹底的にテストし、うまく標準化された適応をご紹介します。これらの方法は、過去10年間5,22にまたがる複数の研究において成功することが証明され、現在NOAA上だけでなく、様々な海洋研究所によって使用されている太平洋全域4リーフの評価と監視プログラム（RAMP）。サンプリングプロトコルは、水質パラメータ（無機および有機炭素濃度は、無機栄養濃度）、ウイルス及び微生物の存在量（直接細菌数、直接ウイルス数、従属栄養比対独立栄養性を評価するためにフローサイトメトリー）、及びウイルス及び微生物群集構造を含み、メタゲノム解析により代謝電位（概要については図1を参照）。ここに記載された方法から得られた結果を総合的に水界生態系を特徴づけるために必要な鍵生物地球化学的バックグラウンドのパラメータを解明するために必要とされる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1307">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:325px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration setup&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 &#8211; 36 % Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A508-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">High-density polyethylene (HDPE) container</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Combustion oven (550&#176; C)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml HDPE vials&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02-896-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">25 mm GF/F filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-874-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>XX62-000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, non-powdered gloves</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">19-170-010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bilge pump&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Thirsty Mate 124PF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 l collapsible low-density polyethylene carboy&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Reliance Fold A Carrier II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>CFP-2-E-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum-cured silicon tubing for TFF</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>96440-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hose clamps</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>P-68007-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-77410-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8.0 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVHV010RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-125-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml plastic scintillation bottle&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>03-341-72C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clean bucket (10 - 20 L)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 % glutaraldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m&#160; high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DAPI solution 25 &#181;g ml-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular grade water</td>
			<td>sigma aldrich</td>
			<td>W-4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>BP351-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP399-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>G31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slide</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate task wipe&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide Station with vacuum pump</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">DNA extraction kit</td>
			<td style="width:217px;">Macherey-Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td>Nucleospin tissue kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Proteinase K (20 mg ml-1)</td>
			<td style="width:217px;">Lifetechnologies</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-proof 100% Ethanol</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45503-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cesium chloride (CsCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>bp1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m alumina matrix disposable syringe filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>O992613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra - swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:149px;">333790</td>
			<td>SW41 Ti Rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DNase I (100 u &#181;l-1)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycogen</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">G-1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 % Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:149px;">15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2473-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02674-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20 &#956;g ml-1 Proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">p3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">50ml Oak Ridge Tube&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">05-562-16B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

ここでは、遠隔海洋環境での使用に適合徹底的にテストされ、十分に標準化された研究プロトコールのシリーズをご紹介します。サンプリングプロトコルは、微生物群集（溶存有機炭素、粒子状有機物、無機栄養素）への利用可能なリソースの評価、およびダイレクトウイルスおよび微生物数を経由してウイルスおよび細菌コミュニティの包括的な説明（、自家微生物の列挙が含まれ、ウイルスおよび微生物メタゲノムの建設）。我々はすでに確立されたプロトコルと開発された最も最近の技術のいくつかを含んで科学分野の分散フィールドを表す方法の組み合わせを使用しています。ウイルスおよび細菌群集の特徴付けに使用される、特にメタゲノム配列決定技術は、近年でのみ確立されているため、依然として一定の改良が施される。これは、サンプリングの様々な導かれ、試料処理手順のカレンたTLY使用中。ここに提示される方法のセットが収集した環境サンプルを処理する日付のアプローチまで提供する。これらのプロトコルでアドレスパラメータが特徴付け、ウイルスおよび微生物群集ダイナミクスの基礎となるメカニズムを理解するために不可欠な情報の最小をもたらす。これは、総合的な調査を行うためのガイドラインに従うことを容​​易に与え、重要なステップとそれぞれの技術に関連する潜在的な注意事項について説明します。

顕微鏡検査顕微鏡試料は、それらが所望の品質であることを確認するためにすぐに分析すべきであることができる。豊かさと細菌群集のサイズ分布を測定するために、DAPIスライドを落射蛍光顕微鏡で検査されます（ 図6A）（励起/発光。461分の358 nmの、McDole ら 2012を参照）。細胞数および寸法は、イメージングソフトウェア（ 例えば 、イメージプロ（ImagePro）またはImageJの）を使用して収集することができる。長さおよび幅の測定値から細胞体積（V）は、全ての細胞が、以下の式を使用して半球状のキャップをシリンダーの形状を有していることを仮定することによって導出される。 V =π/ 4×W 2（L - / 3 ワット ） Lは長さであり、wは 、各セル23,4の幅である。微生物バイオマスは、その後foの以前に確立サイズ依存関係を用いて推定することができるR海洋微生物群集24。一般的に海洋細菌は、0.1〜4程度の長さの範囲であるが、いくつかの場所で〜8μmのに上がる。 DAPIで染色されたフィルター（0.2μm）が細菌だけを表示しますが、SYBRゴールドステイン（0.02μm）のために使用されるフ​​ィルターは、細菌やウイルスが含まれています。ウイルスの存在量を測定する微生物と同じプロトコルに従う、しかし325から375の励起が使用され、発光極大は537 nmの（ 図6B）である。 定量的データを生成するために、サンプルボリュームは、元の試料中のウイルスの存在量に応じて調整する必要があるかもしれない。フィルタへの正しいボリュームが最もよく​​水の所与体について経験的に決定される。ウイルスの濃度を変化させたサンプルを含む顕微鏡写真の例を図7に示されている。 以前の研究からの結果は、微生物にそのウイルスを提案比（VMR）は、一般的に約6サンゴ礁システム（ノウルズ未発表データ）中の平均で、25-29水生システムで1から50までの範囲であり、3〜20で。 フローサイトメトリー直接カウントおよび微生物群集の大きさの推定に加えて、フローサイトメトリーを介して従属微生物に対する栄養の比率の評価は、さらに収集されたサンプル（ 図8に示す例示的なフローサイトメトリー出力）から抽出することができる。総細菌細胞の数を決定するために、サンプルは、SYBRグリーンIで染色し、530/30バンドパスフィルタを有する光電子増倍管は、検出のために使用される。クロロフィルおよびフィコエリトリン（585/42バンドパスフィルタ）（背面675から735ナノメートルの範囲で得られたバックLPミラーへ）チャネルが未染色試料における独立栄養の存在量をカウントするために使用される。従属栄養微生物の豊富さ、非から独立栄養カウントを決定するために、染色された部分は、その後、SYBR染色された合計カウント（McDole ら提出された）から減算される。 ウイルスメタゲノムウイルスメタゲノムは、コミュニティの構造と機能を決定するために全ゲノム配列情報を使用して、ウイルスの生態に培養非依存的な分子アプローチを利用する。メタゲノミクスは、地元の17〜30地球規模へのウイルスで社会の複雑さと多様性の我々の理解を進めてきた。ウイルスメタゲノムデータの分析のためのバイオインフォマティクスツールの広い配列の最近の開発は、メタゲノミクスのレンズを通して、より包括的なビューvirosphereのを可能にする、計算ボトルネックを減少している。 ここに提示される方法は、残骸および細胞材料を除去するために大きな孔サイズのナイロンメッシュで濾過前の組み合わせを用いて海水からの濃度のウイルス粒子の単離および濃縮を強調TFF（ 図3）より大きな細胞を除去する後続の0.45μmでろ過した試料。この方法は、私たちはより少量で下流プロセスを実行することができ、ほぼ100倍濃縮サンプル（ 図5B-5E）を生成します。ウイルス溶解物内の残りの微生物細胞の成長、したがって、フィールド·ステーションと実験の間の長い輸送時間中のサンプルのウイルスの存在量の変化を防止するために、クロロホルムは多くの場合、保存のために2％の最終濃度まで添加される。 VLPの単離および精製に続いて、そのようなSYBRゴールド、核酸色素と落射蛍光顕微鏡検査は、ウイルス粒子（ 図5B-5E）の存在および純度を確認するために使用される。 ここでは、南線島サンゴ礁から2つのウイルスメタゲノムを提示し、具体的には、スターバックス（STAR7）とミレニアム（CAR9、以前キャロラインとして知られている）の島。 120 Lサムの総体積PLE水は10メートルの深さで、各サイトから収集し、セクション3.7および5.2で説明したように処理した。パラグラフ4（ 図5B）に記載の方法に従って検証として塩化セシウム勾配遠心分離から精製されたVLPはCAR9（ 図5D）は3.3×10 8粒子/ mlとSTAR7ために、1mlあたり2.9×10 9粒子であった。 DNAの総量は、ナノドロップ測定値に基づいて、約400 ngのあったこれらのサンプルから単離した。 DNAは、配列データの特性を表1に提示されている。既存のデータベースを使用して、類似性検索に基づくファージPhi29ポリメラーゼを用いて増幅され、2011年に環境ゲノミクスコア施設によって配列決定し、配列の大部分（&gt; 70％）は、多くの場合、結局特徴付けられていない、 すなわち 、未知の起源と機能。同様に、ここで紹介する2 viromesは未知の配列の97％以上を提示した。その結果、非データベース依存解析は、解析のために使用し、（ウイルスメタゲノミクスの「暗黒物質」の研究機会の新しい腕を開いたSeguritan ら 。 印刷中）。 微生物メタゲノム微生物メタゲノムの解析は、微生物群集存在し、これらのコミュニティの機能説明の特徴づけが可能になる。例としては、macrobial群集構造の変化や利用可能な栄養素と種の豊富さとその優勢な代謝経路（;ケリーら2014。 図9）との間に病原体や病原性5,22や比較の存在の推定値が含まれています。 水化学水質パラメータは、一般に、所望のデータを生成する大規模な分析処理を行う。 DOC分析用試料は、高温触媒酸化31,3を介して測定される図2に示すように、フローインジェクション分析36,12,37による元素分析33-35、および無機栄養素に結合された同位体比質量分析を介して、粒子状有機物（POM）。すべての分析が正常に完了した後、 表1に示すように、情報は、微生物およびウイルスのコミュニティの特性を補完するために利用可能であろう。この情報は、有機炭素と窒素のサンプルの安定同位体比で賞賛することができ、独立栄養と従属栄養の比（McDole ら提出）（ハースら 35参照 ）。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" width="600" /> プロトコルセクションに記載されている方法の図1.概要。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" target="_blank">このfiguの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください</a>再。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" /> 図2.サンプル処理リグのセットアップ。ここで紹介ろ過セットアップ（模式図の左側、実際の画像右側のパネル）は、必ずしもサンプルを生成するために必要とされるものではなく、大幅にプロセスを促進します。セットアップ（1）ハタイNiskinユニットが搭載されたバックプレートから成る。下向きの出口に、ハタイNiskinユニットは、インラインフィルターホルダーにシリコンチューブ（2）に接続されている。これらは、HDPEサンプリングバイアルにそれぞれのフィルタを介してサンプリングされた水のパス（3）の右下に取り付けられてみましょう。濾過プロセスは、圧力計（5）によって調節され、加圧された空気（4）を通って加速される。オーバーフロー盆地はHDPEバイアルまたはPOMろ過の変更中に水をこぼす防ぐことができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" target="_blank">してください</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig3highres.jpg" /> ナイロン（Thurber ら 19から変更）図3の接線流フィルタのラインナップを濾過メッシュ試料水は、接線流フィルタに蠕動ポンプ（2）を介してリザーバ（1）から圧送される（3）。背圧の不在下での戻りライン（4）に沿って貯留槽（1）の試料水に戻る。背圧は、戻りライン上のホースクランプ（5）を介して印加されると、水がフィルタを通過し、廃棄またはろ液リザーバ（6）へ送られる。すべての試料水がチューブラインに集中しているまで、ろ液ラインを集中するように、サンプル水が交換される。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" /> 図4.顕微鏡スライドろ過セットアップ。均等に、それぞれアルミナマトリックスフィルタにDAPI及びSYBRゴールドで染色サンプルを配布する（1）、フィルタはクランプ（4）でろ過マニホールドのフィルタ塔（2）とステムの間に配置して固定する必要がある。圧力規制真空（5）は濾過プロセス（概略図トップ、実際の画像下のパネル）を迅速化します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" /> 図5.精製し、ファージ粒子の濃度は、それぞれ 、塩化セシウム密度勾配を1mlの合計は、前前処理された試料（A）をリードすると、互いの上に積層されている。各層は、超遠心分離後の抽出を容易にするために、管の外側にマークされるべきである。チューブが元に貫通されます赤い矢印マークVLP画分を消化管。 STAR7（B）とCAR9（D）の0.45μmの濾過された代表的なウイルス濃縮物の落射蛍光顕微鏡写真：ウイルス濃縮物の顕微鏡写真（BE）。唯一のVLP（白矢印）は塩化セシウム勾配超遠心分離後に残るのに対し、細菌細胞を含む大きな粒子は、STAR7（B）とCAR9（D）のサンプルの両方から0.45μmの-濾液から見ることができた。スター7（C）およびCAR9（E）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" /> 図（A）及びDAPI（B）SYBRゴールドで染色スライド例の分析から、DAPIおよびSYBRゴールド顕微鏡分析。スクリーンの6例 。すべての（A）の長さと幅（μm）は、粒子を強調（=微生物）は画像プログラムの助けを借りて評価することができる。画像の中央に凝集を注意してください。これらのクラスターは、分析の間、ウイルス（B）。その後の分析から除外される必要があり、細菌は、VLPおよび細胞サイズの範囲（赤色VLP、セルラ緑）にサイズのしきい値により選別される必要がある。通常、各撮像プログラムによって未分類一部のかすかなVLPがあることに注意してください。としてかすかな白のドットを現れるこれらのVLPは、手動で数え、自動化されたウイルスのカウントに追加される必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" /> 図SYBRゴールドの7濃度を染色したサンプル。SYBR染色ウイルスサンプルの様々な数字を含む0.02アルミナマトリックスフィルタの顕微鏡写真。パネルAは、AFを示していILTERは、Bに示したフィルタ上の濃度は信頼性の高いカウントのためには低すぎる高すぎるとCであるのに対し、フィルタリング海水の適切な量を含んでいる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" width="600" /> 図サンゴ礁-水試料の分析出力フローサイトメトリーの8の結果。パネル（A）は、唯一の機器の設定と最小限の背景を検証するために使用される黄緑色の蛍光マイクロスフェア（0.75ミクロン）で分子グレードの水を示しています。パネル（B）は、ビーズが依然として独立栄養のいくつかの集団と一緒に、同じ場所で見ることができる。（C）A.ノートのように同一の設定やレイアウトを使用して実行リーフ水サンプルの出力を示している</strongのバックゲートをする流れをフローサイトメーターで使用、（B）のように&gt;同じサンプル、SYBR陽性事象（独立栄養+従属カウント）をターゲットとし、バックグラウンドを最小限に抑えることができる。（D）を使用してのSYBR Green Iで染色された代表的なサンゴ礁水試料ゲーティング（C）に設立され、総微生物カウントが生成された、とクロロフィル自家蛍光によって仕切ら従属栄養と独立栄養微生物（McDole ら4参照 ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" width="600" /> 図微生物メタゲノムデータの9例。微生物のメタゲノム配列データとサイト従属変数間のパターン。ここでは、 シネココッカスの相対量</eM&gt;属。積極Pelagibacter属のに対し、サンゴのパーセントカバーと相関していた。 （パネル左）ではありませんでした。 DNA修復のための代謝経路は、すべてのメタゲノム（右パネル）の間で一致していた一方、接合伝達のための代謝経路は正に、硝酸塩濃度と相関していた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> スター7 </td><td> CAR9 </td></tr><tr><td>の総数は読み込み</td><td> 939311 </td><td> 591600 </td></tr><tr><td>プリプロセスの数は、読み込み</td><td> 579664 </td><td> 360246 </td></tr><tr><td>シーケンスの長さを意味する（BP） </td><td> 395±131 </td><td> 451±159 </td></tr><tr><td>注釈付き配列（％） </td><td> 42218（7.3％） </td&gt; <td> 9117（2.5％） </td></tr><tr><td>不明（％） </td><td> 537446（92.7％） </td><td> 351129（97.5％） </td></tr></tbody></table> 南ライン諸島、スターバックス、ミレニアムから生成された2つのviromes表1.データの特性。注釈の程度はMG-RASTサーバーを使用してBLATに基づいています。 <img alt="表2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" width="700" /> 1遠征中に様々なサイトからのデータを示す表2.代表的な結果。ここで評価されたパラメータは、微生物およびウイルスの存在量とペア水質測定を含む。テーブルには、さらに、各サンプリング位置に対するそれぞれのメタゲノムのデータを参照するファイル名が含まれています。炭素と無機栄養濃度がマイクロモル/ Lに記載されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" target="_blank">してください</a>この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology at JoVE.com

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

水化学と海洋微生物学へのフィールドガイド - 海における幽玄選手の解明

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

unraveling-unseen-players-ocean-field-guide-to-water-chemistry-marine

Research

JoVE Journal

Environment

25.1K ビュー.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 