These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Declaración de Ética: muestras identificadas-De tejidos y plasma humanos se obtuvieron de Hendrick Medical Center bajo una Junta de Revisión Institucional aprobado protocolo. 1. La adición de anticuerpo biotinilado NOTA: La vigilancia de este paso es opcional. Ver protocolo alternativo si no de supervisión. <ol><li> Obtener placas derivados recubierto con avidina disponibles en el mercado (véase Materiales y Equipos Tabla). </li><li> Añadir 50 l de tampón fosfato salino (PBS) pH 7,2 a los pocillos. NOTA: Preincubación de PBS a 28 ° C para reducir al mínimo los cambios relacionados con la temperatura de resonancia. </li><li> Software del escáner bioensayo abierto y siga el asistente de configuración para definir el procedimiento experimental que incluye la selección de espacios en blanco, estándares y muestras en el diseño de la placa, el ajuste de temperatura (28 ° C), el número de escaneos por minuto (1), y la duración del experimento ( 150 min para dar cabida a los pasos de preparación). </li&gt; <li> Inserte la placa de ensayo preparado en la etiqueta escáner bioensayo gratuita y comenzar la primera exploración. Cuando la primera exploración, seleccione &quot;autorreferencia para empezar&quot;. La línea base es el conjunto inicial de exploraciones recogidos en el inicio del experimento. Si esta es la primera lectura realizado en esta placa específico, permitir que el escáner se ejecute para equilibrar la temperatura y eliminar la deriva en la línea de base. Vea la Figura 2 para una captura de pantalla de una línea de base seguido de la adición de la muestra. </li><li> Después de la línea de base se ha estabilizado, o al menos 5 exploraciones, una pausa en la lectura y expulsar el plato. </li><li> Retire PBS por el dumping en el fregadero y se añaden 50 l RL21A anticuerpo biotinilado en [10 mg / ml en PBS pH 7,2] a todos, pero los pozos de control en el plato. Añadir 50 l de PBS a los pocillos de control. </li><li> Inserte la placa posterior en el escáner bioensayo y reanudar la lectura hasta que se alcance la saturación, de aproximadamente 1,5 horas. </li><li> Pausa la lectura y expulsar el plato. </li><li> Lave el<html> la placa 3 veces con 200 l / pocillo de solución salina tamponada con fosfato + 0,05% de Tween 20 (PBST) seguido por 3 lavados con 200 l / pocillo de PBS pH 7,2. Repita con PBS. Toque en el exceso de PBS de la placa sobre toallas de papel antes de pasar al siguiente paso. NOTA: Este paso se puede realizar en un lavador de placas automático o lavar la placa 3 veces con 200 l de PBST por vertidos de líquido en un fregadero y la sustitución de PBST con una pipeta. </li><li> Añadir 50 l de PBS pH 7,2 a todos los pocillos activos. </li><li> Inserte la placa posterior en el escáner bioensayo y reanudar la lectura para monitorear resonancia post-lavado. </li><li> Detener la lectura y expulsar el plato. </li></ol> Protocolo alternativo para el Paso 1: <ol start="13"><li> Añadir 50 l RL21A anticuerpo biotinilado en [10 mg / ml PBS] a todos los pocillos. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 1,5 horas o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar la placa 3 veces con 200 l / pocillo PBST seguido de 3 lavados con 200 l / PBS así como en el paso 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. La adición de analito <ol><li> Retire el PBS y añadir 50 l por pocillo de tampón de ensayo apropiado. Para este ensayo, se utilizó comercialmente disponible suero humano normal diluido 1:20 en PBS. </li><li> Software del escáner bioensayo abierto y siga el asistente de configuración para definir procedimiento experimental. </li><li> Inserte la placa en el escáner bioensayo y comenzar una línea de base leer. Si esta es la primera lectura realizado en esta placa específica, dejar correr el escáner que se equilibre la temperatura y eliminar la deriva en la línea de base. </li><li> Después de la línea de base se ha estabilizado, o al menos 5 exploraciones, una pausa en la lectura y expulsar el plato. </li><li> Retire el tampón de ensayo de los pozos. </li><li> Controles de espiga con HLA A * 02: 01 monómero portador relevante (FLSL) o (SLLV, YLEV, o KVL) péptidos irrelevantes en concentraciones que van desde [0,625 a 10 mg / ml] en tampón de ensayo. Añadir 50 l de estándares a los pocillos de control de la placa </li><li> Añadir 50 l de analito en tampón de ensayo a la muestrapocillos de la placa. Para este ensayo, se disparó se utilizó suero humano disponible comercialmente. </li><li> Inserte la placa posterior en el escáner bioensayo y reanudar la lectura hasta que se alcance la saturación, de aproximadamente 30 a 60 min. </li><li> Pausa la lectura y expulsar el plato. </li><li> Lavar la placa 3 veces con 200 l / pocillo PBST seguido de 3 lavados con 200 l / PBS así como en el paso 1.9. </li><li> Añadir 50 l de tampón de ensayo a todos los pocillos activos. </li><li> Inserte la placa posterior en el escáner bioensayo y reanudar la lectura para monitorear resonancia post-lavado. </li><li> Detener la lectura y expulsar el plato. NOTA: El tampón de ensayo podría ser PBS, medios de cultivo de tejidos, o suero humano diluido 1:20 en PBS dependiendo del objetivo del ensayo. </li></ol> Análisis 3. Datos <ol><li> Analizar el uso del software de escáner bioensayo o exportar archivos de datos brutos a software de análisis estadístico preferido. El software del escáner bioensayo genera automáticamente la curva de unión basado en eldisposición de la placa proporcionado durante la instalación experimental. NOTA: Si no se utiliza el software del escáner bioensayo para el análisis, siga los pasos 3.2 a 3.4. </li><li> Restar la línea de base y el control negativo de cada punto de datos subsiguiente. </li><li> Calcular la media y la desviación estándar para los pocillos replicados en cada punto de tiempo. </li><li> Generar un gráfico de la curva de unión o seleccionar los datos finales para gráficos de barras. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

Los autores, Debra Wawro Weidanz y Robert Magnusson, son, respectivamente, Consejero Delegado y Director de Tecnología de Sensores Resonant Incorporated, que produce el lector y ensayo de placa placas bioensayo utilizados en este artículo.

El método descrito en este documento introduce un sistema de detección de biomarcadores para el diagnóstico del cáncer que permitan la detección rápida de complejos de péptido / HLA solubles en suero, plasma, orina o saliva muestras de pacientes en un alto rendimiento de 96 o de formato de 384 pocillos. Este sistema de ensayo que utiliza receptor de la célula T imitando anticuerpos monoclonales y un sistema de detección de etiqueta libre reduce el tiempo de análisis a menos de 1 hr en comparación con 3,5 hr por ELISA convencional. Este enfoque de alto rendimiento permite una rápida estratificación de los pacientes a los ensayos clínicos de vacunas terapéuticas de cáncer o productos biofarmacéuticos. Los métodos actuales para la detección de estos objetivos enfermedad requieren purificación por afinidad y HPLC-MS / MS de muestras de pacientes individuales, un proceso que consume tiempo y engorroso. Aunque este método es susceptible de técnicas de ELISA convencionales, existe la preocupación de que los reactivos de detección secundarias, tales como el anticuerpo anti-microglobulina β2 podrían alterar la estructura de la naciente HLUna molécula de inhibir la unión y a la detección limitar TCRM. Detección sin etiquetas alivia estas preocupaciones. Este procedimiento podría ser modificado para su uso en otros sistemas de etiqueta libre tal como un sistema de resonancia de plasmón superficial. Sin embargo, esto reduciría en gran medida las capacidades de rendimiento más altos en comparación con el sistema de bioensayo utilizado en este estudio. Este protocolo puede ser modificado de manera efectiva para la detección de biomarcadores no HLA en el suero y plasma del paciente con la adherencia a unos pocos pasos críticos. Se recomienda el control del proceso de recubrimiento inicial de anticuerpos para la optimización de la superficie, como &lt;200 pm cambio dará lugar probablemente a baja señal para la etapa posterior detección. La línea de base y post-lavado lee son útiles para el análisis de seguridad como la abundancia de proteínas de suero puede enmascarar la unión de baja concentración de analito. Finalmente, la variación de temperatura de las muestras puede dar como resultado así a la variación también. Se recomienda que todas las muestras se pre-incubaron und el controlador de temperatura de la unidad biosassay libre etiqueta fijado en 3.2 ° C por encima de la temperatura ambiente. Las muestras refrigeradas deben disponer de tiempo suficiente para alcanzar la temperatura de funcionamiento. Las modificaciones futuras de este protocolo incluirán multiplexación de TCRM en la superficie de la placa. El sistema de bioensayo es actualmente susceptibles de manchas de pozos a una densidad de al menos 8-plex. Mediante la introducción de 4-8 TCRM a cada pocillo, por volúmenes de muestra de prueba se reducen y permitir la recogida de datos cada vez más complejos por paciente. Esta capacidad podría informar además los pacientes con respecto a las opciones terapéuticas.

El antígeno leucocitario humano de clase I (HLA) muestras de péptidos de 8-11 aminoácidos de longitud derivados de la degradación proteasomal del repertorio de proteínas intracelulares y presenta estos péptidos en la superficie de todas las células nucleadas 1,2. El complejo HLA es &quot;biomarcador de la naturaleza&quot;, lo que indica la salud de cada célula (Figura 1) para que circulan los linfocitos T citotóxicos (CTL). Reconocimiento de la enfermedad asociada péptidos resultados en la eliminación de la célula infractor por CTL. Por lo tanto, la respuesta inmune adaptativa es muy efectivo en la eliminación de la infección viral y tumor. Sin embargo, el sistema inmune ejerce una presión que a menudo promueve la selección en busca de virus o tumor capaz de evadir una respuesta eficaz de CTL. Receptores de células T (imitando TCRM) anticuerpos monoclonales (mAb) que reconocen específica de péptido / HLA-A * 02: 01 complejos tales como los derivados de proteínas asociadas con cáncer de mama, factor de migración de macrófagos inhibitoria (MIF19-27) 3 y NY-ESO-1 157-165, permiten la detección y destrucción de las células del cáncer de mama en la ausencia de un antitumoral efectiva de respuestas de CTL 4,5. Este trabajo representativo se centra en el HLA-A * 0201 molécula, que se expresa hasta en un 30% de la población. Sin embargo, la identificación de otros complejos de HLA / péptido relevantes, seguido por la producción de TCRM permite el desarrollo de inmunoterapias dirigidas y el diagnóstico de enfermedades compañera, la ampliación de la utilidad de este trabajo a una población mucho más amplia. Una porción de los complejos de péptido / HLA con destino a la superficie celular se libera en el plasma. Debido a la naturaleza altamente compleja de péptidos / HLA piscinas, los métodos actuales para la minería de la immunopeptidome de biomarcadores HLA asociados son mucho tiempo. Este proceso requiere la purificación por afinidad de HLA soluble a partir de plasma, la separación de HLA péptidos asociados por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa(RP-HPLC) y la secuenciación de péptidos por espectrometría de masas en tándem (MS / MS) 6,7. Aunque este proceso es una opción viable para el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas, es un proceso engorroso como una herramienta de diagnóstico compañero para objetivos asociados HLA ya en la vacuna terapéutica o de la tubería biofarmacéutica 8-10. TCRM dirigida contra estos objetivos proporcionan las herramientas para el desarrollo de diagnóstico compañero rápida destinadas a estratificar a los pacientes en los ensayos clínicos pertinentes y ofrecer opciones terapéuticas más informadas. En este trabajo, un sistema de detección de biomarcadores gran avance para el diagnóstico del cáncer se presenta que utiliza TCRM y un sistema de bioensayo libre de etiquetas que monitorea las interacciones biológicas con pasos de procesamiento mínimos. El sistema de bioensayo-etiqueta libre se basa en un método, que utiliza el efecto de resonancia de modo de guiado (GMR) que se produce en rejillas de guía de onda dieléctrica 11-14. Cuando los contactos de luz de banda ancha de la difracciónrejilla en las placas requeridas para este sistema, dos longitudes de onda específicas se reflejan. La interacción de unión entre un receptor y su ligando inmovilizado se monitoriza en tiempo real mediante el seguimiento del cambio de longitud de onda de resonancia con un analizador de espectro 12. Picos de resonancia separadas se producen por el incidente TE (normal al plano de incidencia vector eléctrico) y TM (vector magnético normal al plano de incidencia) estados de polarización que proporcionan múltiples puntos de datos que puede aumentar potencialmente la precisión de detección 11,14. El uso de anticuerpos placas pre-sensibilizadas en este sistema de ensayo libre de etiquetas, el tiempo de ejecución de un ensayo con el análisis de datos es de aproximadamente 45 min. Además, múltiples muestras de pacientes pueden ser interrogados en un formato de 96 o 384 pocillos, una clara ventaja sobre un formato basado en HPLC-MS / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

Según la Sociedad Americana del Cáncer, más de 200.000 mujeres serán diagnosticadas con cáncer de mama invasivo cada año y aproximadamente 40.000 morirán de la enfermedad. Muestras de la clase de antígenos leucocitarios humanos (HLA) I péptidos derivados de la degradación proteasomal de las proteínas celulares y presenta estos fragmentos en la superficie celular para ser interrogado por los que circulan los linfocitos T citotóxicos (CTL). Generación de imitar receptor de células T (TCRM) anticuerpos monoclonales (mAb) que reconocen el cáncer de mama específica de péptido / HLA-A * 02: 01 complejos tales como los derivados de factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF 19-27) y NY-ESO- 1 157-165 permiten la detección y destrucción de las células del cáncer de mama en la ausencia de una respuesta eficaz CTL antitumoral. Complejos HLA / péptido intactos clase I se derraman por las células de cáncer de mama y representan biomarcadores de cáncer potencialmente relevantes. En este trabajo, un sistema de detección de biomarcadores gran avance para el cáncer de diagnósticos incorporación de receptor de células T anticuerpos monoclonales imitan combinados con una novela, biosensor libre de etiquetas utilizando-modo guiado de resonancia tecnología de sensores (GMR) se presenta. Detección de cobertizo MIF / HLA-A * 02: 01 complejos en los sobrenadantes de células MDA-MB-231, Punta de suero humano, y el plasma del paciente se demuestra. El impacto de este trabajo podría revolucionar la medicina personalizada a través del desarrollo de diagnóstico de enfermedades de compañía para inmunoterapias específicas.

Se realizó un conjunto representativo de experimentos utilizando el bien caracterizado TCRM, RL21A, un anticuerpo monoclonal IgG2a murino que reconoce específicamente un péptido (19-27 MIF o FLSL) dentro del contexto de la HLA-A * 02: 01 3 molécula. El monómero de péptido / HLA cognado, así como monómero de HLA irrelevante 15, se utilizó para demostrar el procedimiento descrito. La Figura 3 ilustra el formato de ensayo. RL21A es específico para el monómero FLSL / HLA con poca reactividad cruzada con otro péptido / HLA complejos 3. Esta especificidad se recapitula utilizando el sistema de bioensayo libre de etiquetas (Figura 4). La sensibilidad del sistema de ensayo biológico libre de etiqueta para este experimento es en el rango bajo nanomolar como se determina por titulación del anticuerpo RL21A en FLSL inmovilizada / monómero de HLA (Figura 5). Aunque la señal de fondo es significativamente mayor en las muestras de suero, sdetección ESPECÍFICOS de monómero FLSL / HLA en el suero humano con púas se logra en la Figura 6 y un gradiente de concentración es fácilmente discernible en estas muestras. Finalmente, los sobrenadantes de la línea celular MDA-MB-231, mostrados previamente para presentar la FLSL / HLA-A * 02: 01 molécula, se muestran para contener monómero soluble FLSL utilizando esta etiqueta plataforma de ensayo libre (Figura 7). La posterior adición de monómero FLSL / HLA aumenta la señal en RL21A (Figura 7). Debido a la sensibilidad del sistema, bien a la variación bien incluyendo cambios de resonancia negativos pueden ocurrir como resultado de las fluctuaciones de temperatura como se ha visto como una función de las desviaciones estándar de las Figuras 4 y 5. Estas variaciones se pueden reducir dramáticamente por pre-incubación de todas las muestras y el lector de placas de bioensayo a una temperatura en ligero exceso de la temperatura ambiente (es decir, 28 ° C). En la Figura 8, brevemente, 96-bien placas de poliestireno se recubrieron con [10 mg / ml] de RL21A durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavó con PBST, se bloquearon con leche baja en grasa 0,5%, se lavó con PBST, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con diluciones en serie de FLSL HLA monómero en el suero humano normal diluido 1:10 en PBS para generar una curva estándar o plasma de paciente diluido 1:10 en PBS. La placa se lavó con PBST, se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con conejo microglobulina β2 anti-humano [1: 5000] para detectar HLA intacto, y se lavaron en PBST. Las placas se incubaron a continuación durante 30 min con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo [1: 10.000] y se lavaron con PBST. Detección colorimétrica se realizó usando ABTS (2,2&#39;-azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico] sal -diammonium) sustrato con un tiempo de incubación de 15 min y se observó a 405 nm en un lector de microplacas. FLSL / HLA se detectó en tres muestras de pacientes. En la Figura 8B, el paciente RL.064 plasma se diluyó 1:20 en PBS y luego añadired a la placa y monitoreados en el detector sin etiquetas durante 60 minutos. Detección específica de complejo FLSL / HLA en el suero del paciente se llevó a cabo. Prueba t de Student se realizó con gráficos y estadísticas de software (p &lt;0,05). En la Figura 8C, las secciones de tejido se tiñeron a 1 mg / ml con el ratón anti-HLA-A2 (BB7.2) como control positivo, RL21A, IgG2b e IgG2a, respectivamente como controles negativos. La tinción se detectó utilizando un kit anti-ratón de detección, DAB (diaminobenzadina) y QS hematoxilina para la tinción nuclear como lo indique el fabricante. La tinción de tejido tumoral por RL21A confirma la presentación de complejos FLSL / HLA. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Tumor la presentación de antígenos por el antígeno leucocitario humano de clase I transformación cancerosa es un trastorno intracelular. HLA muestra intracellulproteínas ar y revelar cambios relacionados con el cáncer en la superficie celular. CTL y TCRM son capaces de reconocer las células cancerosas a través de complejos HLA-péptido distintas a las células. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Captura de adquisición de datos en el software del escáner bioensayo Ejemplo de adquisición de datos que muestra la línea de base inicial scan seguido por RL21A Además anticuerpo a una placa recubierta con 10 mg / ml de complejo FLSL / HLA. Las concentraciones de anticuerpos son como indicado. Cada línea representa un individuo bien monitoreado en el tiempo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Figura 3:. El formato del ensayo Ilustración de anticuerpos inmovilizados sobre la superficie de la rejilla de difracción de la placa de ensayo rel capturaEvant complejos péptido / HLA en solución. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Figura 4: Especificidad del RL21A para FLSL / HLA complejo Demostración de la especificidad de la biotinilado RL21A TCRM por su correspondiente monómero (FLSL) HLA en comparación con monómero de HLA irrelevante (YLEV, SLLV, y KVL).. Biotinilado RL21A TCRM [10 mg / ml] se inmovilizó sobre la superficie de la placa de ensayo recubierta de avidina y la detección se realizó utilizando no marcado monómero HLA relevante o irrelevante [10 mg / ml] en PBS. RL21A era específico para el Complejo FLSL / HLA. ANOVA de dos vías se realizó con gráficos y estadísticas de software (p &lt;0,001). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Figura 5:. La unión sensibilidad de RL21A a sus afines péptido / complejo HLA Ilustración de la detectisobre el límite y vinculante sensibilidad de RL21A al complejo FLSL / HLA. Biotinilado HLA Monómero FLSL [10 mg / ml] se inmovilizó sobre la superficie de la placa de ensayo y RL21A no marcado se añadió a la placa en diluciones seriadas en PBS como se indica. Detección para este sistema estaba en el intervalo nanomolar bajo. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Figura 6: Detección de HLA complejos en suero enriquecidas humano Demostración de la detección de HLA en el suero humano.. Biotinilado RL21A TCRM [10 mg / ml] se inmovilizó sobre la superficie de la placa de ensayo recubierta de avidina. Agrupado suero humano normal de pinchos con relevante (FLSL) o irrelevante (SLLV) monómero de HLA se diluyó 1:20 en PBS y después se añadió a la placa y monitoreado en el detector sin etiquetas durante 60 minutos. Detección específica del complejo FLSL / HLA en el suero humano se logró. En general, la señal de fondo (monómero SLLV irrelevante) es altaer para las muestras de suero diluidas en comparación con los analitos purificados en PBS (véase la Figura 4). ANOVA de dos vías se realizó con gráficos y estadísticas de software (p &lt;0,0001). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Figura 7:. Se detectaron los complejos de HLA solubles en cáncer de mama sobrenadantes de cultivo celular La capacidad para detectar HLA en sobrenadantes de células de cáncer de mama se demuestra. Biotinilado RL21A TCRM, RL9A TCRM (control negativo), y un control de isotipo se inmovilizaron sobre la superficie de la placa de ensayo. Se añadieron pinchos [5 mg / ml] y no enriquecido MDA-231 sobrenadantes de cultivo celular y la unión se controló durante 60 minutos en el detector sin etiquetas. FLSL y monómero SLLV HLA pinchos muestras representan controles positivos para RL9A y RL21A vinculante. Utilizó un modelo lineal se realizó a través de gráficos y estadísticas de software (p &lt;0,0001). Figura 8:. Detección específica de complejos FLSL / HLA en muestras de pacientes (A) una enzima tradicional ensayo de inmunoabsorción ligado (ELISA) se utilizó para detectar los complejos específicos FLSL / HLA en el plasma del paciente. (B) Biotinylated RL21A TCRM o IgG2a [10 g / ml] se inmovilizan en la placa de ensayo avidina. (C) el tejido del tumor de mama de RL.064 paciente estaba manchada como está descrita anteriormente 3 para verificar la presentación de tumores de los complejos FLSL / HLA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Complejos HLA / péptido intactos clase I se derraman por las células cancerosas, lo que representa un potencial biomarcador del cáncer relevante. Utilizando la tecnología de sensor de etiqueta libre y receptor de células T imitando anticuerpos monoclonales, detección de cobertizo MIF / HLA-A * 02: 01 complejos en los sobrenadantes de células MDA-MB-231, Punta de suero humano, y el plasma del paciente se demuestra, lo que permite el desarrollo de una novela cáncer de la plataforma de diagnóstico.

La detección del antígeno leucocitario humano biomarcadores en cáncer de mama Utilizando-Label gratuita tecnología de biosensores

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K vistas.  Texas Tech University Health Sciences Center.  Complejos HLA / péptido intactos clase I se derraman por las células cancerosas, lo que representa un potencial biomarcador del cáncer relevante. Utilizando la tecnología de sensor de etiqueta libre y receptor de células T imitando anticuerpos monoclonales, detección de cobertizo MIF / HLA-A * 02: 01 complejos en los sobrenadantes de células MDA-MB-231, Punta de suero humano, y el plasma del paciente se demuestra, lo que permite el desarrollo de una novela cáncer...

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Investigación

Inmunología e Infección

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

La detección de la aspergilosis pulmonar invasiva en pacientes con neoplasia hematológica maligna, mediante el uso de la tecnología de flujo lateral

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Detección ultrasensible de biomarcadores utilizando una impresión Molecular basado Biosensor capacitiva

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Un análisis de Microarray de proteínas para la determinación serológica de anticuerpos las respuestas siguientes infección por Clostridium difficile específica de antígeno

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

Etiqueta-libre neutrófilo enriquecimiento de la secreción de la vía aérea paciente derivado mediante microfluídica inercial de lazo cerrado

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...