We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

NOTA: El cuidado y la manipulación experimental de todos los ratones de este documento fue aprobado por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Cornell. 1. Configuración de Cirugía <ol><li> Esterilizar todos los instrumentos necesarios utilizando un autoclave o procedimientos de esterilización aprobados. Como mínimo, incluir un bisturí, tijeras, tijeras Vanna, pinzas, desarmador de joyero, hisopos de algodón, un conjunto de retractores, el implante (Figura 1A) y su sistema de entrega (Figura 1 D, E). </li><li> Limpie todas las superficies, incluyendo cualquier perillas estereoscopio, con etanol al 70% y / o desinfectantes adecuados. </li><li> Crear un campo estéril sobreponiendo el stereotax personalizado (Figura 1D) y los alrededores de sobremesa con paños estériles. Una almohadilla térmica (preferiblemente realimentación controlada) debe ser colocado en la parte superior de la stereotax y bajo los paños estériles. </li></ol> 2. Preparaciónel ratón de Cirugía <ol><li> Anestesiar un ratón debajo del 5% de isoflurano / oxígeno en una cámara de inducción hasta que la frecuencia respiratoria disminuye a aproximadamente 1 respiración / seg. </li><li> Transferencia de ratón a un área de ensayo fuera del campo estéril, usando un cono de la nariz para continuar la exposición isoflurano. Reducir isoflurano al 2%. Aplicar colirio para prevenir la sequedad de la córnea. </li><li> Administrar glicopirrolato (un fármaco anticolinérgico) a 0,05 mg / 100 g de ratón por vía intramuscular en los miembros posteriores utilizando 29-30 agujas G y 3/10 cc jeringa, la entrega de aproximadamente el 50% del volumen de inyección por extremidad. NOTA: Glycopyrrolate sirve para evitar la acumulación de líquido en los pulmones, mientras que el ratón está bajo anestesia. </li><li> El uso de máquinas de cortar eléctricos, afeitarse una porción de la cara dorsal del ratón, aproximadamente 3 cm de largo por 2 cm de ancho y centrado en el arco torácico. Limpie cualquier pelo recortado bien lejos de la zona afeitada. </li><li> Administrar las siguientes inyecciones por vía subcutánea y distal a la afeitadaparche con 29 a 30 agujas G 3/10 y jeringas CC: 1 ml / 100 g de ratón 5% de glucosa en solución salina (para la hidratación), 5 mg / kg ketoprofeno ratón (un AINE para la analgesia), 0,2 mg / kg de dexametasona ratón ( un esteroide antiinflamatorio para reducir la inflamación). </li><li> El uso de bastoncillos de algodón, realizar tres lavados alternados de yodo y etanol al 70%, 1 min de espera entre lavados. </li><li> Administrar 100 l de bupivacaína al 0,125% (un bloqueo nervioso periférico) por vía subcutánea usando 29 a 30 agujas G y 3/10 cc jeringa para el centro del parche de afeitado para reducir el dolor en el sitio de la incisión. </li><li> Transferencia de ratón para el stereotax personalizado (Figura 1D), inserte el termómetro rectal, y esperar aproximadamente 10 minutos para bupivicaína surta efecto. </li></ol> 3. Exponer y Limpie el dorsal Láminas de 3 Adyacente Vértebras torácicas <ol><li> Uso de la hoja de bisturí, crear un pequeño (5 mm o menos) de la incisión por encima de las vértebras de interés (Figura 2A). </li><li&gt; Uso de fórceps o mediante la inserción de la punta de tijeras quirúrgicas y la difusión de las asas, aumentar el tamaño de la abertura en la piel por disección roma. </li><li> El uso de un bisturí o unas tijeras quirúrgicas, disociar suavemente fascia conectivo entre la piel y el músculo subyacente. </li><li> Use retractores de contener la piel, permitiendo tan grande un área de trabajo como sea posible (Figura 2B). Tener cuidado de no aumentar la carga en el pecho y de ese modo obstruir la respiración. </li><li> El uso de un par de pinzas, agarre el rostral-más vértebra que estará expuesta a través del músculo suprayacente. Usando un bisturí, el tejido cortado a ambos lados del proceso dorsal de todo 3 vértebras (Figura 2c). </li><li> El uso de cualquier combinación de una hoja de bisturí, hisopos de algodón, y / o un raspador de hueso, eliminar todo el tejido que recubre a partir de las láminas dorsal (Figura 2D). </li><li> Con unas tijeras quirúrgicas, corte con cuidado tendones unidos a las vértebras en ambos lateral bordes de la columna vertebral (Figura 2E). </li><li> Utilizando el bisturí, eliminar suavemente mayor cantidad de tejido a partir de los bordes laterales de la columna vertebral como sea posible a fin de proporcionar una superficie de sujeción limpio. </li><li> Desbridar suavemente las vértebras de cualquier tejido blando restante usando un raspador de hueso y / o hisopo de algodón. Recorte cualquier tejido incongruente en otro lugar utilizando tijeras quirúrgicas (Figura 2F). NOTA: Es esencial tanto para sujeción y la realización de la laminectomía dorsal que las vértebras están expuestos limpiamente. A cauterizador puede ser útil en el control de la hemorragia posterior. </li><li> Shift retractores para contener el tejido que rodea la columna vertebral, además de la piel (Figura 2F). </li><li> Coloque las barras laterales de implantes a las púas en los postes de entrega y cargar estos en los post-titulares (como en la figura 1E). </li><li> Sujete el 3 vértebras usando las barras laterales, aplicando la presión suficiente para mantener securely (Figura 2G, H). El uso de fórceps para ayudar a asegurar una sujeción nivel del 3 vértebras. Tenga en cuenta que varios intentos pueden ser necesarios. Asegúrese de que las barras laterales son tanto a nivel y paralelo antes de realizar la laminectomía. </li><li> Con cuidado, limpie y seque la superficie dorsal de las vértebras sujetada mediante hisopos de algodón. </li></ol> 4. Realizar una laminectomía dorsal <ol><li> Inserte la punta de las tijeras Vannas en el espacio epidural de la vértebra sujetada medial y los apriete a la ligera; si el hueso está seca, debe grieta a lo largo de la longitud de la lámina dorsal. Repita este procedimiento en el lado contralateral para liberar la lámina. </li><li> Agarre suavemente la lámina suelta por el proceso dorsal con fórceps, cuidadosamente cortar cualquier tejido conectivo en los extremos rostral y caudal de la lámina y levante a la basura. </li><li> El uso de solución salina 0,9% y / o líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), lave la basura cualquier overlyi sangreng de la médula espinal. Use hisopos de algodón para absorber el exceso de líquido. </li><li> Con unas tijeras Vannas, recorte cuidadosamente los bordes laterales de la columna vertebral a las barras laterales del implante. Una vez más, lavar y controlar el sangrado mediante hisopos de algodón y solución salina / ACSF. </li><li> En el caso de que una parte del periostio se ha separado y se superpone a la médula espinal, eliminar suavemente este tejido usando hisopos de algodón y / o un 29 - aguja de 30 G. Tenga cuidado de no dañar la médula espinal en esta parte del procedimiento. No hay que confundir el periostio suelto con la duramadre tapados. </li><li> Con cuidado, sellar los bordes expuestos restantes del hueso con uno o ambos de acrílico y cianoacrilato dental (Figura 2I). Tenga especial cuidado de no permitir que las colas fluyan a la médula espinal expuesta. </li></ol> 5. Selle la Cámara <ol><li> Coloque la placa superior con cuidado para que las 4 ranuras se alinean con los 4 agujeros en los paneles laterales y la apertura se superpone a la vuelta expuestaal cable (Figura 1B y 2J). </li><li> Usando un destornillador de joyero, iniciar cuidadosamente el primer tornillo, estabilizando el eje del destornillador con otro par de pinzas. No apriete el tornillo en esta etapa, pero la inserta de manera que las primeras roscas están comprometidos. Repita este proceso para los otros 3 tornillos. NOTA: Es útil el uso de titanio u otros fórceps no magnetizables para ayudar a colocar los tornillos en esta etapa. </li><li> Con los 4 tornillos en su lugar, apriete cada tornillo, alternativamente, por la misma cantidad en pequeños incrementos hasta que los tornillos están bien sujetos (Figura 2C). Tenga en cuenta que no es inusual para la placa superior se flexione durante este proceso. Tenga cuidado de no apretar demasiado los tornillos, ya que la cabeza del tornillo puede romper y excesiva presión a la baja va a desalojar a la abrazadera y / o resultar en lesiones de la médula espinal. </li><li> Utilice un elastómero de silicona para llenar el espacio entre la médula espinal y la ventana de vidrio. Porque doeNO producir ácido acético durante el curado, utilice KwikSil elastómero marca y puntas de mezcla. Aplicar una porción liberal de la silicona a la médula espinal expuesta. Tenga cuidado para deshacerse de cualquier silicona que contiene burbujas de aire de la punta de mezcla antes de la aplicación a la médula espinal. </li><li> Trabajando rápidamente, presione suavemente a 5 mm # 0 cubreobjetos en la inserción en la placa superior. Aplicar suficiente presión para apretar gradualmente el elastómero líquido para rodear la médula espinal, pero no resultar en compresión de la médula espinal (Figura 2L). Ajuste de tiempo para que el elastómero es de aproximadamente 90 segundos, así que asegúrese de que el cubreobjetos se aplica rápidamente. </li><li> En el caso de un cierre fallido, espere hasta que el elastómero se ha puesto, retire con cuidado desde el implante con fórceps, y repetir 05.04 a 05.05. </li><li> Cubrir los bordes de elastómero exudado con dental acrílico / de cianoacrilato y adherirse al hueso circundante tanto como sea posible para evitar que el elastómero se desplace sobre la superficie de la médula espinal. </li><li> Retire retractores y tire de la piel alrededor del borde del implante. Uso de cianoacrilato, se adhieren a la piel a los bordes del implante (Figura 2 M, N). </li><li> Inserte # 0-80 - 1/4 &quot;set tornillos en las alas de la placa superior (Figura 1C y 2 O). </li><li> El uso de acrílico dental, sellar los huecos en las ranuras de los tornillos de la placa superior (Figura 2P). </li></ol> 6. Cuidado posoperatorio <ol><li> Retire los animales de la anestesia y el lugar en una gran jaula limpia. Asegúrese de que la jaula es suficientemente grande para que la cámara no se pega en nada (como la inmersión en forma de V para una botella de agua y / o alimentos) durante el curso de la locomoción normal a lo largo de la jaula. NOTA: Una jaula de ratas estándar es ideal. </li><li> Coloque la jaula en una superficie calentada mientras el animal se recupere. No devuelva el ratón a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. </li><li> Compruebe beha animalesVior dentro de 1 - 2 horas después de la operación para detectar signos de dolor o angustia y la integridad del implante. NOTA: En condiciones normales, el animal debe ser capaz de deambular con perturbaciones modestos a la circulación. </li><li> Continúe revisando animales cada 8-12 h durante las primeras 72 horas, la medición de peso y el monitoreo del comportamiento. Compruebe que los animales son activos y móvil durante la noche. Alimento húmedo en forma de suelo Chow mezcla con agua o geles nutricionales, pellets de perro chino, y el agua potable debe ser proporcionada a nivel del suelo. Hidratación adicional mediante inyecciones subcutáneas o intraperiotoneal debe proporcionar según sea necesario. </li><li> Administrar 5 mg / kg ketoprofeno ratón y 0,2 mg / kg por vía subcutánea dexametasona ratón a las 24 y 48 puntos de tiempo hr, después de la operación. Además, desde 0,005 hasta 0,010 mg / 100 g de ratón debe administrarse cada 8 h por inyección subcutánea durante 72 h. </li></ol> 7. En Vivo Imaging <ol><li> Anestesiar un ratón bajo5% de isoflurano / oxígeno en una cámara de inducción hasta que la frecuencia respiratoria disminuye a aproximadamente 1 respiración / seg. </li><li> Traslado del ratón a la stereotax personalizado (Figura 1D) con realimentación controlada almohadilla térmica e insertar un termómetro rectal. Reducir isoflurano al 2%. </li><li> Administrar glicopirrolato 0,05 mg / 100 g por vía intramuscular ratón en los miembros posteriores utilizando 29-30 agujas G y 3/10 cc jeringa, la entrega de aproximadamente el 50% del volumen de inyección por extremidad. </li><li> Administrar 1 ml / 100 g de ratón 5% de glucosa (para la hidratación en solución salina) por vía subcutánea una vez por hora. </li><li> Inserte los soportes de cámara roscados en los post-titulares utilizados para la cirugía (Figura 1F). Ajuste la altura y torcer los puestos en los tornillos de ajuste en la placa superior. </li><li> Con ambos titulares unidos, elevar los titulares de los puestos titulares hasta el pecho puede expandirse libremente en la inspiración. NOTA: Tanto el firme compromiso de los titulares y la libre expansión del significativos llevados pechoTLY reducir los artefactos de movimiento debido a la respiración. </li><li> Realizar las imágenes si lo deseas. </li><li> Cuando la imagen se haya completado, los puestos más bajos, retorcer, los titulares de la cámara, retire el termómetro rectal, y el lugar del ratón sobre una superficie caliente para recuperarse. No devuelva el ratón a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. </li></ol>

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M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+a+phase-specific+role+of+STAT3+during+central+and+peripheral+nervous+system+axon+regeneration.">In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+Two-photon+Microscopy.">In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy.</a> J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).</li><li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

La técnica ha demostrado aquí permite repetida, lapso de tiempo, las imágenes en vivo del ratón dorsal SC a muchas semanas después de la operación sin necesidad de procedimientos quirúrgicos posteriores. Este procedimiento representa una mejora sustancial sobre los estudios de imagen de repetición de la cirugía o más de los enfoques histológicos portmortem, donde se pierde la información sobre la dinámica celular. Tenemos previamente 30 demostraron el valor de esta técnica para el estudio de la patología SCI en vivo. La extensión longitudinal máxima de formación de imágenes se determinó mediante el crecimiento de un tejido denso y fibroso sobre la superficie dorsal de la SC. Con el tiempo, este crecimiento resultó en la pérdida de contraste y resolución de imagen. Este crecimiento también se ha visto en las preparaciones quirúrgicas alternativas 31. Anecdóticamente, hemos observado que este crecimiento puede ser minimizado mediante el lavado cuidadosamente la superficie dorsal SC para eliminar productos de la sangre, el sellado de la superficie deel hueso cortado con cianoacrilato, sellando los bordes de la cámara de bien con elastómero de silicona, y minimizando el espacio intersticial entre el SC dorsal y el vidrio de cubierta. Recientemente, otro enfoque similar a nuestro propio uso de una cámara de policarbonato se ha demostrado 32. El uso de policarbonato es ventajoso puesto que es compatible con rayos X y las modalidades de formación de imágenes acústicas, que no es el caso para nuestras piezas de acero inoxidable. Sin embargo, con la tecnología ahora ubicua de las impresoras 3D, partes de la cámara se pueden fabricar a partir de una amplia variedad de materiales para adaptarse a necesidades específicas. Hemos impreso recientemente todas nuestras partes en un fotopolímero clara. Una desventaja clave de una cámara cerrada es la incapacidad para administrar dosis repetidas de drogas o colorantes exógenos adecuados para la formación de imágenes 34 SC. Sin embargo, mediante la capitalización de la estabilidad mecánica de nuestro sistema actual, ya hemos utilizado nuestra cámara presente para el éxitoLy anclar un catéter intratecal conectado a un puerto de inyección implantado subcutáneamente, lo que permitió la administración de fármacos en múltiples puntos de tiempo incluso en un sistema de cámara cerrada (trabajo no publicado). Además, debido a la naturaleza modular de la placa superior, las futuras versiones de esta preparación se incluir una cámara de resellable para permitir la aplicación repetida de ambos agentes terapéuticos y etiquetas fluorescentes. También es posible prever placas superiores con estuches para la grabación de electrodos, insertos ópticos y puertos para suministro de fármacos. Tales adiciones probablemente serían más difíciles de poner en práctica el uso del sistema más minimalista de Fenrich et al., 31. En conclusión, nuestro cámara proporciona una plataforma de puerta de enlace sobre el cual se pueden basar diversos experimentos.

Time-lapse en microscopía vivo en organismos intactos permite la visualización directa de los procesos biológicos complejos que son inaccesibles para el análisis tradicional punto de una sola vez, como la inmunohistoquímica. Específicamente, la microscopía de múltiples fotones (MPM) 1 permite la formación de imágenes en la dispersión de tejido, tal como el neocórtex roedor, donde se ha logrado de formación de imágenes hasta 2,3 y en exceso de 4 1 mm. Cuando se combina con las preparaciones quirúrgicas 5-7 en los que un procedimiento permite acceso óptico al cerebro durante semanas a meses, estos enfoques de microscopía se han utilizado para estudiar los procesos dinámicos en el cerebro en estados sanos y enfermos 8-11. Además, los protocolos se han desarrollado 12,13 que proporcionan para formación de imágenes in vivo en animales despiertos (es decir, no anestesiados), lo que permite la imagen funcional celular resolución durante ensayos de comportamiento. Estos protocolos se han utilizado para Comparisons de correlacionado la actividad neuronal 14, calcio astrocito señalización 15 en animales anestesiados y despiertos, la identificación de los grupos neuronales específicos de la tarea 16, y la capacidad de las neuronas para discriminar la localización de objetos a la estimulación de la barba 17. Dado el potencial de este enfoque para elucidar los mecanismos sanos y patológicos, de lapso de tiempo de imágenes in vivo se aplicó a la médula espinal de ratón (SC), lo que permite la identificación de la degeneración axonal aguda (AAD) como un mecanismo de la enfermedad 18. Estudios posteriores efectos de las lesiones periféricos en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) axón de regeneración 19, el papel de los vasos sanguíneos en la regeneración de axones 20, quimiotaxis glial en respuesta a la lesión 21, la migración de células T en la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) 22, la actividad investigados de la microglia y astrocitos 23,24 25 en respuesta a amyotrophesclerosis ic lateral (ALS), el papel de STAT-3 en crecimiento axonal después de la lesión SC (SCI) 26, y un mecanismo de pérdida de axón y recuperación de la EAE 27. A pesar del éxito de estos enfoques, todos estos estudios se limitaron a ya sea una sola sesión de imágenes, limitando así los estudios de dinámica de corto plazo, o de lo requerido repetida aberturas quirúrgicas de los animales en cada punto de tiempo de formación de imágenes, limitando el número de puntos de tiempo accesibles y el aumento de la probabilidad de artefactos experimentales de confusión. Los protocolos para estas cirugías han sido publicados anteriormente 28,29. Recientemente, publicamos una técnica 30 para la implantación de una cámara de médula crónica que permitió time-lapse de imágenes MPM en el SC ratón sobre varias semanas sin necesidad de reintervenciones. Brevemente, esta preparación quirúrgica incluyó la realización de la laminectomía en la columna torácica inferior y la implantación de una cámara de cuatro partes. La cámara incluyetres piezas a medida mecanizadas de acero inoxidable que se ligan las vértebras que rodea la laminectomía y un cubreobjetos de vidrio colocada sobre el SC y asegurado con elastómero de silicona. Esta técnica permitió la proyección de imagen de rutina a más de 5 semanas de la operación en los estados sanos y heridos sin la necesidad de reintervenciones. El número de puntos de tiempo de formación de imágenes se limita solamente por la frecuencia a la que el animal puede tolerar la inducción anestésica. Curso de la vida Imaging estaba limitado por el crecimiento de un tejido denso y fibroso sobre la superficie de la SC. Además, hemos comprobado que el implante quirúrgico no tuvo ningún efecto a largo plazo sobre la función motora. Desde nuestra publicación inicial, los enfoques alternativos que permitan también la imagen a largo plazo en el SC se han descrito en otra parte 31-33. Este protocolo demuestra nuestro procedimiento para la implantación de la cámara de la médula desarrollamos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:68px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:201px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">15000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">forceps, scissors, scalpel, etc.</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">multiple&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -magnetic fixator</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -retractor</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-09</td>
			<td>other retractors may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -elastomer</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">feedback controlled heating blanket</td>
			<td style="width:68px;">CWE Inc.</td>
			<td style="width:115px;">Model: TC-1000 Mouse&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Part No. 08-13000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">stereotax</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber holders</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:68px;">Loctite</td>
			<td style="width:115px;">Loctite 495</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8101</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8501</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycopyrrolate</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:68px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bupivacaine</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ketoprofen</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Elastomer</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Mixing Tips</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIKMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

Siguiendo el procedimiento anterior, cada etapa de la cirugía debe imitar los resultados de cada etapa de la cirugía se indica en la figura 2. Especial cuidado debe tenerse cuando se aplica el elastómero de silicona para eliminar las burbujas de aire bajo el cristal o al menos garantizar que se encuentren situado en la periferia de la zona de interés (Figura 2 l). Para un cirujano experimentado, las complicaciones quirúrgicas que requieren la eutanasia, ya sea durante la cirugía o después de la cirugía dentro de la primera 24 hr ocurren en aproximadamente el 20% de las operaciones. Estas complicaciones más frecuentemente surgen de hemorragia excesiva de tejidos blandos o el fracaso para fijar firmemente la cámara a la columna vertebral. En cámaras implantadas con éxito, la ventana permanece normalmente ópticamente transparente para varias semanas (Figura 3). A pesar de los mejores esfuerzos, una opaco, fibroso, crecimiento neoplásico a menudo se forma dentro de unos pocos días, resultando en Obscurio parcialng de la ventana (Figura 3C - F, línea discontinua negro). Estructuras fluorescentes son difíciles de ver mediante microscopía 2PEF debajo de este tejido fibroso. Nos encontramos con una distribución bimodal de los resultados, con aproximadamente el 50% de las ventanas implantados con éxito restante claro durante más de 5 semanas de la operación, y aproximadamente el 50% convirtiendo ofuscado en 1-3 semanas. Para las ventanas que quedan claras, la mayoría de los lugares dentro de la experiencia de visualización de la ventana sólo un modesto grado de neovascularización en o por encima de la duramadre (Figura 3D - F, asteriscos verde), que no obstaculice la imagen 2PEF. Nuestro estudio anterior 30 mostró un aumento en la densidad de microglia, pero no de astrocitos debajo de la ventana y las vértebras adyacentes, lo que indica inflamación leve análoga a la observada en la ventana preparaciones craneales 5. En ratones transgénicos que expresan la proteína fluorescente amarilla (YFP) en un subconjunto de la raíz dorsal Ganglia (DRG), las neuronas (línea YFPH; Jackson Labs), los axones eran claramente distinguibles por semana después de la operación (Figura 4A y B) y hasta cuatro meses en un animal (datos no mostrados). Los vasos sanguíneos (Figura 4A y B) se hacen visibles por fluorescente retro-orbital inyección de dextrano marcado con Texas Red en el plasma sanguíneo. La microglía también se visualizaron en ratones que expresan GFP en un CX3CR1 ratón knock-in (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) cruzaron la línea YFPH (Figura 4C). Contraste y la resolución se deterioraron modestamente con el tiempo (Figura 4C) debido a la formación de un sobrecrecimiento fibroso descrito previamente 30. Rutinariamente Imaged durante 3 horas en una sola sesión y sin mortalidad y con la frecuencia que cada 12 horas. Duración de la sesión y la frecuencia está limitada por la tolerancia del animal para la inducción anestésica, concomitante con las consideraciones éticas que acompañan el dolor y la angustia de los animales de laboratorio. &lt;<html> p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> Figura 1. Una suite personalizado quirúrgica facilita la entrega de cámara durante la implantación y estabiliza la cámara durante las sesiones de formación de imágenes posteriores. Dos barras laterales y una placa superior (A) se ensamblan (B) con los tornillos pequeños en la cámara de la columna vertebral (C). Una mesa de operaciones con mensajes extensibles (D) permite la entrega y la sujeción de las barras laterales a las vértebras usando pasadores de retención (E). Sesiones de formación de imágenes posteriores en lugar de utilizar mensajes roscados internamente para adjuntar a la cámara a través de los tornillos de fijación en las alas del implante (F). El panel B de esta figura ha sido modificado desde Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 con permiso de Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> Figura 2. Una laminectomía dorsal y se realiza una cámara de imágenes crónica se implanta para proporcionar acceso óptico a la médula espinal. El procedimiento se describe en el montaje. En primer lugar, la piel (paneles A, B; secciones de protocolo 3.1 a 3.4) y los músculos (C; 3,5) se retraen para exponer las tres vértebras subyacente. Se retira el tejido que recubre estos tres vértebras (D, E, F; 03/06 a 03/10) y de los procesos laterales se raspan limpia antes de que se sujetan por ambos lados (G, H; 3,12). Con cuidado, la lámina dorsal de la vértebra central es eliminado y los bordes de la médula sellado (I </strong&gt;; 4. 6). Se aplica una placa superior (J; 5,1) y los tornillos fijado en su posición (K; 5,3) para asegurar la cámara antes de sellar la cámara con elastómero de silicona y cubierta de vidrio (L; 5,5). Después se retiran los pasadores de entrega (M; 5,8), la piel se pega a los lados de la cámara (M, N; 5,8) y los tornillos de fijación se insertan en las alas (O; 5,9). Por último, las ranuras de los tornillos están sellados con acrílico dental (P; 5.10). Y el ratón se coloca en una jaula limpia para recuperar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> Figura 3. Una cámara espinal crónica sigue siendo ov ópticamente transparenteer varias semanas. Imágenes de luz blanca de la médula espinal, que van desde varios minutos (A) y tres semanas después de la operación (F). Hitos vasculares son identificables en todos los puntos (flechas amarillas). Pocos cambios se ve en uno después de la cirugía día (B). Sobrecrecimiento denso fibroso (C - F, delimitada por la línea discontinua en la parte inferior derecha) está presente tan pronto como tres días y los resultados en la ofuscación parcial del área de imagen. Neovascularización leve (D, E, F, asteriscos verdes) también está presente, pero no oculta la vasculatura originales con luz blanca o de imágenes 2PEF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" /><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Figura 4. Una cámara de médula crónica permite la formación de imágenes multi-fotón repetido sin la necesidad de cirugías repetidas. de formación de imágenes repetidas de ratones transgénicos que expresan YFP en un subconjunto de los axones DRG (verde) en las funiculi dorsales de la médula espinal y la vasculatura (rojo) marcado por inyección intravascular de colorante (A, B). La actividad de la microglia (malva) también se puede seguir a través del tiempo en Thy1-YFP / CX3CR1-GFP ratones dobles transgénicos (C). Mientras que los axones y microglia permanecen visibles, contraste y resolución disminución modesta en el tiempo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

En este vídeo, se describe un procedimiento para la implantación de una cámara de imagen óptica crónica sobre la dorsal de la médula espinal de un ratón vivo. La cámara, procedimiento quirúrgico, y la imagen crónica son revisados ​​y demostraron.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de la médula espinal de ratón

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

13.9K vistas.  Cornell University.  En este vídeo, se describe un procedimiento para la implantación de una cámara de imagen óptica crónica sobre la dorsal de la médula espinal de un ratón vivo. La cámara, procedimiento quirúrgico, y la imagen crónica son revisados ​​y demostraron. 

Video: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Investigación

Neurociencias

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Imágenes de difusión en la médula espinal de rata Cervical

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Un en Vivo Dúo color método de proyección de imagen dinámica Vascular tras lesión medular contundente

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...