Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple conceder RG4595A1 / T para DD y las subvenciones del NIH / NINDS NS051470, NS052189 y NS066361 a las figuras KA y películas adaptadas y / o reimpresión de Dávalos et al., J Métodos Neurosci. 2008 Mar 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, con permiso de Elsevier.

1. La construcción del dispositivo de estabilización de la columna <ol><li> Para la misión STS-A Narishige abrazaderas compacto de la médula espinal y el Narishige MA-6N adaptador de cabeza afirmado. </li><li> Diseño personalizado y hacer una placa base de acero inoxidable para mantener las dos partes Narishige en la alineación de modo que la cabeza del animal con el apoyo, mientras que su columna vertebral y la cola se sujetan. Tenga en cuenta que todo el dispositivo debe caber bajo el lente de un microscopio por lo general en una platina del microscopio baja. </li></ol> 2. Cirugía en animales <ol><li> Pre-calentar el microscopio de la cámara con un dispositivo de calentamiento de aire y mantener a 37 ° C. </li><li> Pesan los animales y hacer la mezcla anestésica con 100 mg de ketamina, 15 mg y 2,5 xilazina acepromacina mg por kg de peso corporal, diluido en solución de NaCl al 0,9% en condiciones estériles. </li><li> Anestesiar a los animales mediante la inyección de la anestesia mezcla (KXA) por vía intraperitoneal. Pellizcar los pies regularmente se deben realizar para asegurar una anestesia profunda a lo largo deel experimento. Suplemento con la mitad de la dosis original cada hora o cuando sea necesario. </li><li> Use una almohadilla de calefacción animales pequeños como para proporcionar respaldo térmico, mientras que la realización del procedimiento quirúrgico. </li><li> Aplique un ungüento de lágrimas artificiales en los ojos para prevenir la deshidratación y el daño corneal. </li><li> Afeitarse la parte posterior del primer animal con un dispositivo de corte y luego con una cuchilla para eliminar por completo el cabello del área alrededor de la incisión. </li><li> Eliminar el vello rasurado y desinfección de la superficie de la piel afeitada con una gasa con alcohol. </li><li> Realice una pequeña (alrededor de 1,5 cm) incisión longitudinal de la piel sobre el nivel deseado la columna (vértebras torácicas se muestra aquí). </li><li> Exponer la musculatura de la espalda con cuidado retracción del tejido conjuntivo subcutáneo. </li><li> Separar cuidadosamente los músculos paravertebrales de la columna vertebral en el nivel deseado. Realizar el menor número de incisiones posible separar los músculos de ambos lados de cada apófisis espinosa y luego raspar los músculos separados unoforma de la superficie laminar. </li><li> Elige la lámina que será eliminado y preparar los sitios de entrada de las abrazaderas de la columna a cada lado de la columna vertebral, inmediatamente rostral y caudal a la laminectomía. Con cuidado, desplazar el tejido muscular para hacer cuatro bolsillos en las abrazaderas se inserta. </li><li> Levante la columna vertebral con la recta de dientes con punta de pinza para permitir la inserción segura de la curva puntas romas tijeras bajo la lámina sin tocar la médula espinal. Realizar la laminectomía lentamente cortando el hueso en un lado y luego en el otro lado. </li><li> Use un hisopo de algodón o insertar precortadas pequeñas piezas de espuma de gel absorbible esponja de gelatina al lado de la incisión para reducir el sangrado menor. Use un vaso pequeño cauterizador para controlar el sangrado, si fuera necesario. Use precalentado líquido estéril cefalorraquídeo artificial (ACSF) para lavar los tejidos. </li></ol> 3. La estabilización de la columna vertebral y la preparación de imágenes in vivo <ol><li> Plac<html> e el animal sobre una superficie de elevación en la placa base del dispositivo de estabilización espinal y asegurar la cabeza en el adaptador de la cabeza de espera. </li><li> Coloque las abrazaderas de la columna vertebral de la misión STS-un dispositivo a lo largo del eje antero-posterior del animal en los bolsillos ya preparados que flanquean la laminectomía (Figura 1). Las dos pinzas deben ser colocados en un ángulo de 45 º respecto al eje rostro-caudal del animal para permitir el espacio suficiente para bajar una lente de inmersión en agua sobre la médula espinal expuesta (Figura 1). </li><li> Coloque la abrazadera de la tercera parte de la misión STS-Un dispositivo en la base de la cola para el cuerpo del animal puede ser suspendido en el aire después de la eliminación de la plataforma de elevación de la duración de los experimentos de imagen (Figura 1). </li><li> Construir un pequeño pozo de Gelseal (Amersham Biosciences Corp.) que rodea la médula espinal expuesta para facilitar el mantenimiento de la médula espinal en ACSF y la inmersión de la lente de un microscopio en esta solución para imágenes in vivo. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. En imágenes in vivo de la médula espinal de ratón con el microscopio de dos fotones <ol><li> La transferencia de los animales en el dispositivo de estabilización espinal dentro de la cámara precalentada cubrir el microscopio y seguro que en un escenario reducido microscopio colocando la laminectomía directamente debajo de la lente (Figura 1). </li><li> Inferior de una lente de inmersión en agua con cuidado en la solución ACSF asegurarse de que no toque las abrazaderas de la columna vertebral o Gelseal. </li><li> El uso de epifluorescencia para identificar el área de interés y se centran en ella. Cambiar al modo de escaneo láser y realizar imágenes in vivo utilizando el apropiado de dos fotones de longitud de onda de excitación láser, dicroicos y paso de banda de los filtros de los fluoróforos presentes en el tejido imágenes. </li></ol> 5. Imágenes repetitivas y el cuidado post-operatorio <ol><li> Al final de los experimentos de imagen, eliminar el ratón desde el dispositivo de estabilización de la columna y limpie con cuidado la Gelseal del área alrededor de la laminectomía.Limpie bien la zona. </li><li> Restaurar y sutura de los músculos de la espalda durante la laminectomía. </li><li> Restaurar y sutura de la piel sobre la laminectomía, se esponja con betadine. </li><li> Proporcionar una solución de Ringer lactato ml (Baxter Healthcare) como un suplemento de nutrientes y la hidratación, así como el tratamiento analgésico por vía subcutánea (0,1 mg / kg de buprenorfina). </li><li> Administrar por vía intraperitoneal tratamiento antiséptico (0,03 ml por ratón, el 2,27% enrofloxacina inyectable solución antibacteriana). </li><li> Lugar de los animales en un cojín de la calefacción hasta que la recuperación completa de la anestesia y posteriormente se casa de forma individual. </li><li> Repita la administración antiséptico día durante los primeros 3-5 días después de la cirugía y el tratamiento analgésico cada 8-12 horas durante 2-3 días después de la operación. Monitor de animales a diario para garantizar un comportamiento normal y plena recuperación. </li><li> Para re-imágenes a través de la laminectomía mismo, vuelva a abrir la piel y los músculos de sutura y repita los pasos descritos en los apartados 2 a 4. </li><li> Re-localizar el Previously imágenes área mediante el uso de los vasos sanguíneos como un mapa de lo descrito previamente 10. </li></ol> 6. Los resultados representativos Todos los animales procedimientos fueron realizados bajo los lineamientos establecidos por Cuidado de Animales institucional y los Comités de Uso de la Universidad de California, San Francisco y están de acuerdo con las regulaciones federales. Una imagen del dispositivo de estabilización de la columna y un esquema que muestra la posición del ratón en el dispositivo a una lente de un microscopio se muestra en la Figura 1. Dejando espacio suficiente para los movimientos de la respiración debajo del cuerpo del animal asegura estable de imágenes in vivo en la médula espinal. La figura 2 muestra la estrecha relación entre la microglia y la vasculatura, ya que fue fotografiada en vivo en la médula espinal de CX3CR1 GFP / + ratones transgénicos 18, en el que la microglía son endógenamente marcado con GFP. Figura 3 muestra ejemplos de repeticiónimágenes in vivo, ya que se llevó a cabo en las áreas de la médula espinal misma en ratones que expresan una proteína fluorescente en los axones espinales (YFP-H línea 3) y microglia (en el CX3CR1 GFP / + ratones). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" /> Figura 1. Estabilización de la columna espinal de ratón de imágenes in vivo utilizando microscopía de dos fotones. (A) Una placa de acero a medida base se utiliza para apoyar y alinear la misión STS-A Narishige compacto abrazaderas de la médula espinal y la MA-6N Narishige sosteniendo la cabeza de adaptador como se muestra aquí. (B) La posición correcta de los adultos ratones transgénicos anestesiados con anestesia KXA en el dispositivo de estabilización de la columna. El inserto muestra la ubicación de las abrazaderas de la columna vertebral inmediatamente rostral y caudalmente a la laminectomía y el tejido expuesto de la médula espinal. &lt;img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. En imágenes in vivo de las células microgliales de alta densidad y los vasos sanguíneos en la médula espinal de ratones anestesiados. Proyectado, pero no alineados z-pilas de (A) de alta densidad GFP-positivas microglia (verde) en la médula espinal de un CX3CR1 GFP / + ratón en estrecha proximidad con los vasos sanguíneos (rojo, marcado con la inyección intravenosa de rodamina dextrano). (B) Ampliación de imagen en alta como en la etiqueta (A) de una sola célula microglial pegado a la pared de un vaso sanguíneo con los procesos se extendía alrededor de la nave y hacia el parénquima de la médula espinal. Las barras de escala, 10μm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" /> Figura 3. Repetitivos de imágenes in vivo de los mismos segmentos axonal y microglia, ya que fueron reubicados y reimaged en la médula espinal de ratones anestesiados en diferentes días. (A) YFP-lab<html> axones ELED en los días 0 y 5. (B). Las mismas estructuras vasculares y células microgliales rodean imágenes en vivo en la médula espinal de CX3CR1 GFP / + ratones en los días 0 y 1. Las barras de escala, 10μm. Movie 1. Secuencia timelapse Representante adquiridos en vivo de la médula espinal de ratón. Esta secuencia muestra con gran detalle la dinámica del proceso microglial (verde) y sus interacciones con el sistema vascular (rojo, marcado con inyección intravenosa de rodamina dextrano) a través del tiempo dentro de un tejido densamente poblado con estructuras fluorescentes. Las imágenes en bruto se han corregido sólo por el ruido de fondo, el brillo y el contraste y la película timelapse fue construido por la z-proyección de imagen de las pilas de forma secuencial adquirida, sin alineación de la imagen, con un promedio o z-selección de los planos individuales. Los vasos sanguíneos pasan por una serie similar de aviones z como las imágenes de la microglía. Z profundidad de avión: 38 micras.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la película. Movie 2. Timelapse secuencia que demuestra la estabilidad de la prima el método de imagen a nivel de un único plano-z. Rápida adquisición de la misma y única plano z en la médula espinal de los ratones CX3CR1 GFP / + colocado en el dispositivo de estabilización de la columna vertebral bajo anestesia KXA, demuestra un mínimo desplazamiento de la imagen entre imágenes consecutivas a una velocidad de barrido de un cuadro / s que es más rápido que el la frecuencia respiratoria del ratón. El desplazamiento residual menor de edad se debe probablemente al latido del corazón. <a alt="Movie 2" href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">Haga clic aquí para ver la película.</a>

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	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2++signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion.">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure.">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

El método aquí descrito permite estable y repetitiva de imágenes in vivo de la densamente poblada estructuras fluorescentes celular en la médula espinal de ratones anestesiados utilizando microscopía de dos fotones. La estabilidad alcanzada es el resultado de un dispositivo de estabilización a medida la columna vertebral y un régimen anestésico que reduce las vías respiratorias inducida por el artefacto de movimiento. El dispositivo de estabilización de la columna permite el espacio para resp...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Rodamina B dextrano </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 70 kDa, se diluye en ACSF (3% w / v) </td></tr><tr><td> La ketamina HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> No NDC: 67457-001-10 </td><td> Inyectables, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> Lloyd Laboratorios </td><td> NADA No: 139-236 </td><td> Xilazina inyectables, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromacina </td><td> Vedco </td><td> NADA No: 117-531 </td><td> Inyectables, 10mg/ml </td></tr><tr><td> Las lágrimas artificiales ungüento </td><td> Fénix farmacéutico </td><td> No NDC: 57319-760 - 25 </td><td> Lubricante </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Pescador </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> McPherson-Westcott Tijeras </td><td> World Precision Instrumentos </td><td> 555500S </td><td> Curvas, con puntas romas tijeras </td></tr><tr><td> Pinzas rectas </td><td> World Precision Instrumentos </td><td> 555047FT </td><td> Pinzas dentadas punta </td></tr><tr><td> Cauterizar los vasos pequeños </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, Pfizer Inc. </td><td> Mixer Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> La médula espinal compacto abrazaderas </td><td> Narishige </td><td> STS-A </td><td></td></tr><tr><td> Sosteniendo la cabeza de adaptador </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences Corp. </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer lactato </td><td> Baxter Healthcare &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. </td><td> NDC No: 12496 - 6757-1 </td><td> La buprenorfina, inyectables </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> NADA 140-913 </td><td> Enrofloxacina, inyectable antibacteriano 2,27% (20 ml) </td></tr><tr><td> Cojín de la calefacción - Grande </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy

Imágenes in vivo utilizando microscopía de dos fotones 1 en ratones que han sido genéticamente modificadas para expresar proteínas fluorescentes en células específicas de los tipos 2.3 ha ampliado significativamente nuestro conocimiento de los procesos fisiológicos y patológicos en numerosos tejidos in vivo 4-7. En los estudios del sistema nervioso central (SNC), ha habido una aplicación amplia de imágenes in vivo en el cerebro, lo cual ha producido una plétora de nuevos hallazgos y muchas veces inesperados sobre el comportamiento de las células como las neuronas, astrocitos, microglia, en condiciones fisiológicas o patológicas 08.17. Sin embargo, las complicaciones técnicas en su mayoría han limitado la implementación de imágenes in vivo en los estudios de la médula espinal de ratón vivo. En particular, la proximidad anatómica de la médula espinal a los pulmones y el corazón genera artefacto de movimiento significativo que hace imágenes de la médula espinal que viven una tarea difícil. </p&gt; Hemos desarrollado un método novedoso que supera las limitaciones inherentes de las imágenes de la médula espinal mediante la estabilización de la columna vertebral, la reducción de las vías respiratorias inducida por los movimientos y facilitando así el uso de la microscopia de dos fotones de la imagen de la médula espinal de ratón in vivo. Esto se logra mediante la combinación de un dispositivo a medida estabilización de la columna con un método de anestesia profunda, lo que resulta en una reducción significativa de las vías respiratorias inducida por los movimientos. Este protocolo de vídeo muestra cómo exponer una pequeña zona de la médula espinal de vida que se puede mantener en condiciones de estabilidad fisiológica durante largos períodos de tiempo manteniendo la lesión tisular y el sangrado al mínimo. Representante imágenes primas adquiridas en detalle vivo en alta resolución, la estrecha relación entre la microglia y la vasculatura. Una secuencia de timelapse muestra el comportamiento dinámico de los procesos microgliales en la médula espinal de ratón vivo. Por otra parte, un análisis continuo de la misma z-marco demostrars de la excelente estabilidad que este método puede lograr la generación de pilas de imágenes y / o películas timelapse que no requieren la alineación de la imagen después de la adquisición. Por último, se muestra cómo este método puede ser utilizado para revisar y crear la imagen de la misma zona de la médula espinal en los puntos de tiempo posteriores, teniendo en cuenta los estudios longitudinales en curso de los procesos fisiológicos o patológicos en vivo.

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Un protocolo de mínima invasión para estabilizar la columna espinal de ratón y realizar repetitivas<em&gt; En vivo</emImagen&gt; de la médula espinal utilizando microscopía de dos fotones se describe. Este método combina un dispositivo de estabilización de la columna y un régimen anestésico para reducir al mínimo las vías respiratorias inducida por los movimientos y producir imágenes de los datos en bruto que no requieren la alineación o de otro tipo de post-procesamiento.

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

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Research

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Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

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Video: In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Investigación

Neurociencias

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

En Vivo De dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de la médula espinal de ratón

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

Visualización de la proteína quinasa Una actividad en ratones de trabajo fijos en la cabeza utilizando la microscopía de imágenes de por vida con fluorescencia de dos fotones in Vivo

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...