This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

Declaración de Ética: NOTA: El protocolo para el manejo de animales fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de California, Irvine, protocolo # 2010-2943. 1. La eliminación de la médula espinal <ol><li> Coloque toallas de papel humedecidas con isoflurano líquido ~ 100%, USP en cámara de la eutanasia y colocar toallas de papel secas en la parte superior. Coloque el ratón en la cámara encima de las toallas de papel secas así ratón no está tocando el isoflurano y asegúrese de que la cámara se cubre. Espere al menos un minuto después de la interrupción de la respiración para asegurarse de que el ratón es sacrificado. </li><li> Realizar una transección de la médula del cuello para asegurar el ratón es sacrificado. No realice una luxación cervical ya que esto podría dañar la médula espinal. </li><li> Pulverizar el ratón con etanol al 70% para mojar el cabello. </li><li> Utilice tijeras finas afilados para quitar el pelo y la piel de la parte posterior del ratón para exponer la columna vertebral cervical de la lámina de aproximadamente 1 (C1) A la lámina sacral 4 (S4). </li><li> Usando un escalpelo con una cuchilla # 10, hacer incisiones a la izquierda y derecha de la columna vertebral para separarlo de músculo y grasa. Esto hará que la eliminación de la médula espinal mucho más fácil. </li><li> opcional: a curvas rongeurs Luer se pueden utilizar para recoger distancia carne adicional. </li><li> Mientras sujeta la parte superior de la columna vertebral con pinzas dentadas Graefe, inserte titanio curvado tijeras Vannas con la parte curvada hacia arriba en la columna vertebral expuesta en C1, teniendo cuidado de no tocar la médula espinal. </li><li> Deslice el titanio curvadas tijeras Vannas todo el camino a la derecha y hacer un pequeño corte. Un sonido crunch pequeña debe ser oído y sintió como las tijeras cortan las vértebras. Repita este corte en el extremo izquierdo de la cuerda. Tenga cuidado de no ir demasiado rápido o hacer demasiado grande de un corte como este se arriesgará a dañar el cable con las tijeras. </li><li> La única lámina debe ser capaz de ser levantado con las pinzas una vez que se cortan los lados de las vértebras. REPEAT este paso para cada lámina hasta S4, sin dejar de sujetar y tirar de las vértebras de la médula espinal. NOTA: las vértebras por encima del sitio de trasplante probablemente saldrá una vez que se corta al sitio de trasplante. Continuar el procedimiento comenzando justo debajo del sitio de trasplante. </li><li> opcional: sentar las vértebras hacia abajo para ver donde el sitio de trasplante es y medir y cortar ~ 20 mm rostral y caudal al sitio de trasplante. NOTA: Cuando el trasplante NPCs más no serán necesarios como los NPCs trasplantados generalmente no migran más de 15 mm. La cantidad de la médula espinal necesaria dependerá de experimento y de migración características de tipo celular trasplantado. Para hacer cortes rostral y caudal que son equidistantes al sitio de trasplante le permitirá al centro de trasplante que se encuentra más fácilmente durante la exploración. </li><li> Con un bisturí con una hoja # 11 Corte cuidadosamente los ganglios de la derecha y la izquierda de la cara ventral de la médula espinal a partir de finales rostral. Esta wenfermo permitir la médula espinal para ser removido de las vértebras ventral más fácilmente. NOTA: Hecho rápidamente (pasos 1.7 a 1.11), la médula espinal no se seque. Sin embargo, 1x PBS se puede administrar a la cuerda para mantenerlo húmedo. </li><li> Invierta el ratón y mantenga pulsado el ratón hacia arriba por lo que la médula espinal se encuentra hacia abajo. Retire con cuidado la médula espinal utilizando pinzas dentadas Graefe cerrados. Sin mellar la médula espinal, cortar cuidadosamente cualquier ganglios restantes para permitir la médula espinal para ser levantado en una sola pieza intacta. </li><li> Asegúrese de que la médula espinal es en RPMI-1640 y colocarlo en hielo durante el transporte al microscopio 2P. </li></ol> 2. Preparación de la médula espinal de la Imagen <ol><li> Incorporación de la médula espinal en agarosa <ol><li> Mantenga la médula espinal aislada en RPMI-1640 enfriado en hielo antes de la imagen. </li><li> Pesar de agarosa (baja temperatura de gelificación) y preparar una solución al 5% en 5 ml de PBS 1x. Microondas la solución de agarosa al 5% durante 15 s para disolver el agsurgió y dejar enfriar la disolución a 37 ° C. </li><li> Preparar la médula espinal, colocándolo en una hoja de Parafilm con la cara ventral hacia arriba. </li><li> Pipetear aproximadamente 5 ml de solución de agarosa al 5% sobre el lado ventral de la médula espinal. Deje que la agarosa solidifique por enfriamiento a temperatura ambiente. Solidificación completa tarda aproximadamente 5 minutos. </li><li> Aplique una ligera capa de adhesivo tisular a un 22 mm tapa cuadrada de deslizamiento. </li><li> Invierta la médula espinal incrustado, colocando la cara ventral de Parafilm. El lado dorsal será ahora hacia arriba. Pegue la hoja de la cubierta de la parte dorsal, y sumerja la preparación de la suspensión de agarosa incrustada médula espinal / cubierta en RMPI para solidificar el adhesivo. Eliminar el exceso de agarosa se solidifica utilizando una hoja de afeitar. </li></ol></li><li> Montaje de la médula espinal en la platina del microscopio <ol><li> Aplique vaselina en la parte inferior de la hoja de la cubierta. Esto estabilizará la preparación durante la perfusión. </li><li> Coloque la preparación de la médula espinal en unaobtener imágenes bien en la platina del microscopio con la parte ventral hacia arriba hacia el objetivo de inmersión 25X. El pozo de imagen hecha a la medida es de aproximadamente 20 mm de profundidad, 50 mm de largo y 50 mm de diámetro. </li><li> Image mientras superfusión la preparación con calentado (37 ° C), oxigenada (95: 5 de oxígeno: dióxido de carbono carbógeno) medio RPMI-1640 sin suero. <ol><li> Medios Pre-caliente hasta 37 ° C en el baño de agua y conéctelo a la bomba de tubería mediante la inserción de la tubería en la botella de los medios de comunicación. </li><li> Conserve la temperatura del medio a 37 ° C un dispositivo calentador en la conexión de la tubería a la cámara. Medios de comunicación a través de superfuse bien en 3 ml / min usando un tubo conectado a la bomba de tubería (Figura 1B). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P Imaging de la médula espinal ventral <ol><li> Configuración Microscopio <ol><li> Adquirir imágenes desde Thy1-EYFP médula espinal utilizando un Ultra Ti Camaleón: Sapphire láser sintonizado a 900 nm. Atenuar la potencia del láser en elespécimen a &lt;5% para asegurar un mínimo de fototoxicidad 16. Mantener la temperatura por perfusión perfundido en oxígeno RPMI-1640 en una constante 37 ° C utilizando un único calentador de solución en línea para asegurar la formación de imagen estable, y para prevenir la deriva del tejido y daño celular. </li><li> Para separar la señal fluorescente eGFP y eYFP, coloque una nm dicroico 520 de un solo filo y un solo filo nm divisor de haz dicroico 560 en serie para separar 2P emisión a tres canales, a propósito de dividir la emisión verde para mejorar la visibilidad. NOTA: Estos canales se conocen como azul-verde (emisión &lt;520 nm), verde-amarillo (520-560 nm) y rojo (emisión&gt; 560 nm). Tubos fotomultiplicadores detectan emiten luz en cada canal. </li></ol></li><li> Localización de áreas de imagen de interés <ol><li> Usando el ocular y una fuente de luz de campo claro, se centran el objetivo de inmersión en el borde ventral de la médula espinal para establecer un punto de referencia. </li><li> Haz fuente de luz ambiente seguro está apagado y swprurito de 2P excitación abriendo el obturador de láser. </li><li> Si está disponible, en la búsqueda de tejidos para las áreas de interés, use un ajuste de resolución más baja, mayor volumen sin zoom digital, y una mayor velocidad de barrido que cuando la adquisición de las imágenes finales. La configuración típica con este sistema en la búsqueda de tejidos para una región de interés son: la resolución: 256 píxeles; volumen: x = 600 m, y = 600 m, z = 0 a 300 micras. </li><li> Observar los axones EYFP cerca del borde ventral de la médula espinal. Señal armónica Segundo de colágeno (azul) será más brillante en el borde del tejido de la médula espinal. Ubicar los axones EYFP sólo dorsal a la segunda señal armónica de la señal de colágeno y eYFP se visualiza en el canal de color amarillo-verde. </li><li> Localizar el sitio de trasplante en el centro longitudinal de la preparación de la médula espinal 14. Para los ratones 1 día siguiente eGFP-NPC trasplante, localizar el sitio del trasplante, centrándose la trayectoria del haz en el plano z profundamente en el tejido. El wi sitio trasplantell variar ligeramente entre los animales, pero en general se encuentra ~ 200 m desde el borde ventral. Observar los racimos de eGFP-NPC en los tractos de sustancia blanca, más cerca de los bordes ventrales y laterales en ratones después de 1 día post-trasplante. </li></ol></li><li> La adquisición de imágenes finales <ol><li> Adquirir resolución de imagen de 512 píxeles; volumen: x = 270 m, y = 212 m, y z = 100 micras utilizando software Slidebook 6. Compilar z-pilas mediante la adquisición de planos focales secuenciales en 2,5 micras incrementos. </li><li> Realizar un análisis bidireccional con el offset para garantizar la rápida cuantificación de cualquier objeto que migran en la médula espinal entrelazado apropiado. Asegúrese de que la velocidad de fotogramas adquisición ideal para determinar la velocidad del celular dentro de la médula espinal es de aproximadamente 1 fotograma / seg. NOTA: Los ajustes de imagen se pueden cambiar las preferencias de usuario individuales, tales como la velocidad de fotogramas adquisición, resolución de imagen y volúmenes de imágenes. Volúmenes de imágenes más grandes por lo general tardan más en adquirir a un givresolución en. </li><li> Analizar, cultivos, lisa, y pseudocolor archivos de imagen Slidebook con software de análisis de imágenes, tales como Bitplane Imaris 7.7. Producir vídeos finales de lapso de tiempo peinando volúmenes consecutivos de imagen utilizando un proceso automatizado en Slidebook y Imaris. </li></ol></li></ol>

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The authors have no competing interests.

En tiempo real se requiere 2P imágenes de tejido intacto para investigar la cinética de la APN y las interacciones tras el trasplante en el ratón desmielinizada médula espinal. Intravital de imágenes 2P se utiliza comúnmente para determinar la dinámica celular en el lado dorsal de la médula espinal en ratones vivos, y ha sido utilizado para estudiar la desmielinización dorsal en enfermedad desmielinizante 17-19. Sin embargo, debido NPC trasplantados migran a la materia blanca ventral, que se encuentr...

Los modelos de ratón de desmielinización, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y la infección intracraneal con virus de la hepatitis del ratón neuroadapted (MHV), son excelentes herramientas para estudiar las vías moleculares y las interacciones celulares asociados con la enfermedad. Han liderado y apoyado la eficacia de las terapias farmacéuticas aprobado por la FDA, destinado principalmente a la cesación de la autoinmunidad y la inflamación 1. Sin embargo, una vez que la remielinización endógena ha fracasado, las terapias aprobadas actualmente no reparan efectivamente lesiones de desmielinización en el sistema nervioso central. Por lo tanto, las terapias de reparación centrada en esta etapa de la enfermedad son fundamentales para el alivio de los síntomas crónicos y mejora de la calidad de vida. Recientemente, las células precursoras neuronales (CPN) han venido a la vanguardia como una modalidad terapéutica potencial regenerativo de las zonas de inflamación y desmielinización objetivo. Varios estudios han puesto de manifiesto la capacidad de los NPCs para inducir endogenonos remielinización y participar directamente en la remielinización 2-8. Debido NPCs están involucrados en la remielinización directa, es imprescindible entender su cinética y las interacciones con las células endógenas después del trasplante. Después del trasplante, NPCs migran ventralmente a áreas de daño de la sustancia blanca, entonces rostral y caudal en relación con el sitio de trasplante de 5,9. La cinética de la migración difieren en respuesta a señales ambientales; NPCs trasplantadas en una médula espinal dañada no tienen mayores velocidades que los NPCs trasplantadas en una médula espinal dañada 6. Después de un período migratorio, transferidos NPC proliferan extensamente, a una tasa superior en un cable dañado la médula relativa a una médula espinal intacta 6. Por último, la mayoría de los NPC diferenciarse en oligodendrocitos e iniciar 4,6,9 remielinización directa. La lesión desmielinizada es complejo y puede incluir una población diversa de células en diversas etapas de unactivation. Por ejemplo, una lesión activa la esclerosis múltiple (MS) puede incluir una importante población de células T activadas, microglia y macrófagos M1 M1, pero una lesión MS silenciosa crónica puede estar compuesto principalmente de los astrocitos reactivos con pocas células inflamatorias 10-13. Debido a la diversidad de las células efectoras, de dos fotones (2P) de imágenes en modelos de ratón de la desmielinización es una herramienta extremadamente útil para ayudar a entender las interacciones celulares locales dentro de la lesión. En muchos modelos de investigación MS utilizados ampliamente MS y, la mayoría de las lesiones se localizan en el lado ventral de la médula espinal, una región inaccesible para formación de imágenes 2P intravital debido a la profundidad de la lesión y el alto contenido de lípidos de la médula espinal. Para evitar estos problemas y de las interacciones célula-célula estudio dentro de las lesiones de la médula espinal ventral, hemos desarrollado un sencillo preparación imágenes in vivo 2P 6 ex. Este estudio da seguimiento a una publicación métodos anteriores, que mostróel procedimiento para el trasplante de proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) NPC que expresaban en la médula espinal de ratones después de JHMV cepa de desmielinización inducida por MHV 14. Cinco semanas de edad ratones están infectados con JHMV y trasplantados con eGFP-NPCs a nivel torácico 9 en el día 14 después de la infección. El protocolo que aquí se presenta ofrece los pasos detallados sobre cómo extraer la médula espinal, hacer una preparación ex vivo de agarosa, y de imagen trasplantado interacciones eGFP-NPC con proteína mejorada amarillo fluorescente (eYFP) axones que expresaban. Los ratones que expresan eYFP bajo el promotor Thy1-neuronal específica se utilizaron en este procedimiento 15. Sólo algunos de los axones expresan eYFP, lo que es útil para obtener imágenes de los axones individuales. Aquí mostramos las médulas espinales retirados a los 7 días post-trasplante; sin embargo, las médulas espinales se pueden extraer en cualquier punto de tiempo después del trasplante. Mientras que mostramos interacciones de NPC con axones dañados, nuestro protocolo se puede utilizar en combinación con marcadores fluorescentes genéticosde otros tipos de células para investigar una multitud de interacciones celulares que se producen en toda la médula espinal de ratón.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
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			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:381px;">Isoflurane, USP</td>
			<td style="width:175px;">Piramal Critical Care, Inc</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">14060-09</td>
			<td>sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel blade #10</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel handle</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Luer rongeurs</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">16001-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Graefe forceps</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">15615-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel blade #11</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">12-115F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9414-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Parafilm</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Vetbond (tissue adhesive)</td>
			<td style="width:175px;">3M</td>
			<td style="width:136px;">1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">22 mm square cover slip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">12-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">25x dipping objective, 1.1 NA</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:136px;">CFI Apo LWD 25XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Single inline solution heater</td>
			<td style="width:175px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:136px;">64-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">520 nm single-edge dichroic beam splitter</td>
			<td style="width:175px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF520-Di02-25x36</td>
			<td>Brightline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">560 nm single-edge dichroic beam splitter</td>
			<td style="width:175px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Brightline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">photomultiplier tubes</td>
			<td style="width:175px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:136px;">R928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">C/L variable-speed tubing pump</td>
			<td style="width:175px;">Masterflex</td>
			<td style="width:136px;">77122-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">digital thermometer</td>
			<td style="width:175px;">Comar Instruments</td>
			<td style="width:136px;">3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Slidebook 6 software</td>
			<td style="width:175px;">3i</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Imaris 7.7 software</td>
			<td style="width:175px;">Bitplane</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

<html> Aunque el protocolo de formación de imágenes de la médula espinal explantado se puede utilizar para visualizar cualquier fluorescencia dentro de la médula espinal, nuestros resultados representativos demuestran interacciones eGFP-NPC con EYFP-axones. En primer lugar, se muestra la preparación de la médula espinal ventral incrustado en la Figura 1A. A continuación, se muestra la configuración 2P microscopio y componentes clave en la Figura 1B. La Figura 2 demuestra eGFP y e...

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Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

two-photon-imaging-of-cellular-dynamics-in-the-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K vistas.  University of California, Irvine.  Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal. 

Video: Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Investigación

Neurociencias

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de la médula espinal de ratón

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Imágenes de difusión en la médula espinal de rata Cervical

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Un en Vivo Dúo color método de proyección de imagen dinámica Vascular tras lesión medular contundente

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...