The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O&#8217;Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

참고 :이 프로토콜은 인간의 자원 봉사자 말초 혈액 샘플의 사용이 필요합니다. 인간을 대상으로 모든 연구를 검토하고 헬싱키 선언 (2013)과 건강 보험 양도 및 1996 년 책임에 관한 법안을 준수하기 위해 인간 연구 윤리 심의위원회의 승인을 받아야한다. 전혈에서 T 세포의 분리 1. <ol><li> 시작에 앞서, 실온 밀도 구배 매질을 따뜻하게. 나누어 2-4 멸균 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 밀도 구배 배지 4 ㎖ (1 관 각각 10 ml의 희석 된 혈액의 총량에 대해 사용된다). </li><li> 1-2 나트륨 헤파린 스프레이 혈액의 10 ~ 20 ml의 코팅 (녹색 위) 정맥 혈액 수집 튜브를 얻습니다. 교육을받은 사람의 감독하에 인간의 표본을 수집하고 심사위원회 (Institutional Review Board)에 따라 프로토콜을 승인했다. </li><li> 70 % 에탄올로 튜브의 외부를 닦으십시오. 조심스럽게 Fi의 꼭대기를 제거수집 튜브를 채워하고 멸균 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 혈액을 가만히 따르다. </li><li> 각각의 혈액 수집 튜브에 10 ㎖의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 첨가. , PBS를 수집 경사 전체 혈액에 넣어 천천히 섞는다. </li><li> 25 μL 인간 T 세포 농축 칵테일 / 2 ml의 전체 볼륨을 추가합니다. 20 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 부드럽게 밀도 구배 배지 위에 한 혈액 희석 : 10 ㎖를 피펫을 사용하여, (1) 10 ㎖까지 층. 밀도 기울기 매체의 표면을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 20 오 C. 원심 분리기 계층화 혈액 및 밀도 구배 매체를 20 분 동안 1,200 XG에 </li><li> 밀도 구배 매질 및 밀도 구배 매체 희석 플라즈마 사이의 계면에서 백혈구의 층 사이의 계면을 방해하지 않도록주의하면서, 원심 분리기에서 튜브를 제거한다. 5 ml의 피펫을 사용하여 조심스럽게 백혈구 층을 수집하고 새로운 무균 50 ㎖ 원뿔형 욕조로 전송할전자. </li><li> 50ml로 수집 된 PBL의 볼륨을 가지고 부드럽게 섞어 PBS를 추가합니다. </li><li> 20 O ℃에서 5 분 동안 600 XG에 원심 분리기 가만히 따르다. </li><li> 이 재현 탁 완충액 (PBS 멸균 여과는 1 % BSA 함유) 정렬 계측법 10 ㎖의 멸균 유동 세포를 펠렛 화. 샘플 세포 현탁액 10 μL, 1:10 희석는 혈구 세포를 사용하는 계산 트리 판 블루 (90 μL에 추가) (예상 수익률을 1-4 × 10 6 세포 전체 혈액의 / 튜브). <ol><li> 5 ML 튜브로 전송, 1 ml의 나누어지는 제거, 사량으로 표시하지 T 세포의 분석을 위해 얼음에 보관하십시오. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. </li></ol></li></ol> Alloantigen 특정 T 세포의 2 마그네틱 심화 <ol><li> 1 alloantigen pMHC의 사량을 희석 : (100)를 멸균 종류의 버퍼에. </li><li> 원심 분리기에서 세포 현탁액 20 오 C.에서 5 분 동안 600 XG에 (단계 1.11 9 ml) 중 가만히 따르다. </li><li> 펠렛에 pMHC 량체 alloantigen 희석의 50 μl를 추가세포 (10 7 세포까지). 부드러운 피펫 팅으로 섞는다. 멸균 5 ML 튜브로 전송합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 일종의 버퍼 2 ML을 추가합니다. 20 O ℃에서 5 분 동안 600 XG에 원심 분리기 가만히 따르다. </li><li> 100 μL 종류의 버퍼에 재현 탁 세포. 10 μL 비오틴 선택 칵테일을 첨가하고, 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 5 ㎕의 자성 나노 입자를 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 2.5 ml의 정렬 버퍼와 피펫으로 부드럽게 혼합 추가합니다. 5 ML 튜브로 전송, 100 μL 나누어지는 제거 및 사전 농축 세포의 분석을 위해 얼음에 보관하십시오. </li><li> 세포 분리 자석에 세포 현탁액을 함유하는 5 ㎖의 튜브를 놓는다. 캡 튜브 위에 느슨하게해야한다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 부드럽게 튜브의 캡을 제거합니다. 함께 튜브와 자석을 잡고, 신선한 5 ML 튜브로 튜브의 내용을 가만히 따르다. 누르거나 튜브의 내용을 흔들지 마십시오액체의 마지막 방울을 제거합니다. </li><li> 자석에서 튜브를 제거합니다. 2 ml의에게 차가운 종류의 버퍼를 추가하고 피펫으로 가볍게 섞는다. 이 혈구를 사용하여 세포를 계산하는 트리 판 블루 (10 μL에 추가) : 샘플 세포 현탁액 10 μL은, (1) 희석. </li></ol> 단일 셀 유동 세포 계측법 셀 정렬에 대한 T 세포의 3. 준비 <ol><li> 세포의 모든 튜브에 차가운 종류의 버퍼를 추가 (사량 레이블, 사량 표지 농축 - 유엔, 사량 표지 농축) 3 ㎖에 볼륨을 가지고. </li><li> 4 O C에서 5 분 600 XG에 원심 분리기 및 캔트 버퍼는 세포를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 25 μl의 차가운 종류의 버퍼에 펠렛 세포를 재현 탁. 5 μL 인간의 Fc 블록을 추가합니다. 20 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 유동 세포 계측법 정렬에 대한 항체를 준비합니다. 15 μL 정렬 버퍼, 15 μL 안티 CD5, 15 μL 항 CD14, 15 μL 항 CD19를 섞는다. </li><li> 세포의 각 튜브에 항체 혼합물의 20 μl를 추가합니다. 20 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 각각의 튜브에 차가운 종류의 버퍼의 2 ML을 추가합니다. </li><li> 4 O C에서 5 분 600 XG에 원심 분리기 및 캔트 버퍼는 세포를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 정렬 버퍼에 1~2 × 106 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁. </li><li> 인간 T 세포 배양 배지의 분취 량 100 ㎕를가 (Iscove의 DMEM 2 mM의 루타, 10 mM의 HEPES, 50 ㎍ / ml의 겐타 마이신, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 10 % 열 - 불 활성화 된 인간 AB 혈청, 2.5 NG / ml의 재조합 인간 보충 IL-2)를 96 웰 둥근 바닥 세포 배양 플레이트의 각 웰에. 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 단일 셀 유동 세포 계측법 정렬하여 테트라 머 표지 T 세포 4. 분리 <ol><li> alloantigen-pMHC 량체 표시된 T 세포 (그림 2.A)를 식별하는 게이팅 매개 변수 유동 세포 계측법을 설정합니다. B 세포와 CD14를 발현하는 CD19를 제외, 림프구에 이중선, 게이트를 제거하는 전략을 게이팅 설정하기 위해 사전 농축 사량 표시된 부분을 사용하여단핵구를 발현하고, CD5 식에 의해 T 세포를 식별. (사량으로 표시하지 샘플에서 세포가이 게이트 내에해야한다 - - CD19 CD5 + CD14의 0 %로) 사량 결합 T 세포의 식별을위한 게이팅을 설정하는 형광으로 사량을 뺀 컨트롤을 표시하지 샘플을 사용 . NOTE : 지나치게 제한 게이팅 전략 절연 T 세포의 수를 줄이는 반면, 특정 항원되지 않은 T 세포 또는 T 세포의 분리 될 것이다 충분히 엄격한 아닌 전략을 게이팅. </li><li> 단일 세포 종류의 플레이트 매개 변수를 프로그래밍합니다. CD19 - - 각 웰의 사량 + 셀 (1) CD5 + CD14을 배치 할 분류기을 지시. 각 행의 (그림 2.B 잘 (세포 - CD19 - - 사량 100 CD5 + CD14)을 잘 한 음성 대조군 (어떤 세포가 우물에 분류 없음)과 1 개의 긍정적 인 제어를 포함하도록 설정 판을 직접 </strong&gt;). </li><li> 게이팅 전략 및 플레이트 셋업 계측법 확립 흐름을 사용하여, 직접 유세포 셀 소터를 사용하여 96 웰 플레이트에 각각의 사량 체 - 결합 T 세포를 분리. </li></ol> 5. 문화 및 Alloantigen 특정 T 세포 클론의 확장 <ol><li> 20 O ℃에서 세포 분류, 5 분 600 XG에 원심 분리기 판의 완료 후 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 개최 배양 플레이트. </li><li> 30 초 동안 소용돌이 자극 항 CD3 / 안티 CD28 마이크로 비드는 구슬을 재현 탁합니다. </li><li> 수집 된 T 세포의 자극에 필요한 활성제 비드 부피 (활성제 마이크로 비드 / 웰의 0.5 μl를) 계산한다. 멸균 5 ML 튜브에 자극 구슬의 계산 된 볼륨을 전송합니다. 1 ml의에게 인간 T 세포 배양 배지와 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 자석의 마이크로 비드 서스펜션 튜브를 놓습니다. 캡 튜브 위에 느슨하게해야한다. 실온에서 2 분 동안 인큐베이션. </li><li> 부드럽게 제거튜브의 캡. 신선한 5 ML 튜브에 함께 캔트 튜브의 내용을 튜브와 자석을 들고. 누르거나 튜브의 내용을 흔들지 마십시오. </li><li> 자석에서 튜브를 제거합니다. 인간 T 세포 배양 배지를 추가 (마이크로 비드 100 ㎕ 매체 / 0.5 μL는 처음에 추가). </li><li> 나누어 96 웰 플레이트의 각 웰에 활성제 비드 현탁액 100 ㎕. 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 배양 플레이트를 품어. </li><li> 현미경 검사에 의해 매일 세포의 성장을 모니터링합니다. 문화의 7 일 (그림 3.A) - 증식하는 세포의 작은 클러스터는 5 후 현미경으로 관찰 할 수있다. NOTE :이 시점에서 T 세포 배양의 시각화가 어려울 수 있으며,이 단계에서 관찰 가능한 셀 클러스터의 부재가 성장하는 T 세포의 결여를 지시하지 않을 수있다. </li><li> 세포 격리 후 십사일에서 조심스럽게 문화의 상단 오프 미디어 100 μl를 제거하여 피드 문화 100 μ로 교체고 l 신선한 인간 T 세포 배양 배지. 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 배양 플레이트를 배양 계속합니다. </li><li> 현미경 검사 및 배지의 색의 평가에 의해 매일 세포 성장을 모니터링. 3 일 매체 변경 후 - 대형 전지 클러스터는 현미경 2 볼 수 있어야합니다. 거시적으로, 세포 펠렛은 매체 변화에 따른 14 일 동안 볼 수있게해야합니다. </li><li> 세포 격리를 다음 이십팔일에서 현미경 검사로 성장하는 클론을 식별합니다. 200 μl의 인간 T 세포 배양 배지를 함유하는 48 웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰에 성장 양성 96- 웰 플레이트의 배양을 200㎕ 부피를 전송합니다. </li><li> 항 CD3 자극 / 항 CD28 마이크로 비드 12.5 μl를 함유하는 100 μl를 추가 (- 5.6 섹션 5.2에 기재된 바와 같이 제조 됨). 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 배양 플레이트를 품어. </li><li> 현미경 전 매일 문화의 성장을 모니터링민화 및 배지의 색의 평가. T 세포 배양은&gt; 2 × 6 / ㎖에 도달 할 때 (일반적 3-5일 재 자극 후, 미디어 시작되는 날에 의해 추정 될 수 지푸라기 황변)를 24- 웰 조직 배양 플레이트의 웰에, 전사 문화 500 μl의 인간 T 세포 배지를 추가한다. </li><li> 10~14일에서 pMHC 량체의 분석 바인딩 (섹션 3, 4.1에 기술 된 라벨 및 게이트 전략을 사용하고 있습니다) 유동 세포 계측법에 의해 alloantigen 특이성을 평가하기 위해 T 세포 배양 200 μl를 수집, 재 자극 따릅니다. </li></ol> 6. 장기 다시 자극 및 문화 T 세포 클론의 <ol><li> 지속적으로 14 일마다 할 수 있습니다 원하는 특이 클론 T 세포 배양을 다시 자극하고 확장합니다. 마지막 항 CD3 / CD28의 마이크로 비드 자극 다음 14 일에서 멸균 5 ML 튜브에 T 세포 배양를 수집합니다. 2.5 ml의 부피로, 하나의 튜브에서 동일한 T 세포 클론의 여러 웰을 결합. </li&gt; <li> 2.5 ml의에 최종 볼륨을 가져오고 피펫으로 부드럽게 혼합 매체를 추가합니다. </li><li> 배양 물로부터 이전 마이크로 비드를 제거하기 위해 세포 분리 자석으로 T​​ 세포 배양을 포함하는 5 ㎖의 튜브를 놓는다. 캡 튜브 위에 느슨하게해야한다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 부드럽게 튜브의 캡을 제거합니다. 함께 튜브와 자석을 잡고, 신선한 5 ML 튜브에 세포 현탁액을 가만히 따르다. 누르거나 액체의 마지막 방울을 제거하기 위해 튜브의 내용을 흔들지 마십시오. </li><li> 4 ml의 최종 볼륨을 가지고 매체를 추가합니다. 샘플 10 μL은 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 600 XG에서 원심 분리하여 T 세포 복구. </li><li> 가만히 따르다 뜨는. 10 106 세포 / ml의 인간 T 세포 배양 배지에 재현 탁 T 세포. 전송 한 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분취 량. </li><li> 자극 항 CD3 / 12.5 μl를 함유하는 100 ㎕의 미디어를 추가하여 T 세포를 자극 재NTI-CD28 마이크로 비드 (- 5.6로 섹션 5.2 참조). 6 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 품어. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+activation.">T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).</li><li>Morris, G. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+TCR+balances+sensitivity+and+specificity+for+the+recognition+of+self+and+pathogens.">How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens.</a> Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).</li><li>Arstilla, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+estimation+of+the+human+&#945;&#946;+T+cell+receptor+diversity.">A direct estimation of the human &#945;&#946; T cell receptor diversity.</a> Science. 286 (5441), 958-961 (1999).</li><li>Robbins, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+assessment+of+T-cell+receptor+&#946;-chain+diversity+in+&#945;&#946;+T+cells.">Comprehensive assessment of T-cell receptor &#946;-chain diversity in &#945;&#946; T cells.</a> Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).</li><li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8++T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies.">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).</li><li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo:+new+answers+to+an+old+question.">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li><li>Felix, N. J., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+T-cell+alloreactivity.">Specificity of T-cell alloreactivity.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).</li><li>Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloreactivity+is+limited+by+the+endogenous+peptide+repertoire.">Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).</li><li>Suri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+APCs,+the+autologous+peptides+selected+by+the+diabetogenic+I-Ag7+molecule+are+unique+and+determined+by+the+amino+acid+changes+in+the+P9+pocket.">In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket.</a> J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).</li><li>Yssl, H., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+maintenance+of+cloned+human+T+cell+lines.">Generation and maintenance of cloned human T cell lines.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Moon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+CD4++T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude.">Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).</li><li>Chicz, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+promiscuity+among+naturally+processed+peptides+bound+to+HLA-DR+alleles.">Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles.</a> J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).</li><li>Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ability+to+rearrange+dual+TCRs+enhances+positive+selection,+leading+to+increased+allo-+and+autoreactive+T+cell+repertoires.">The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires.</a> J. Immunol. In press, (2014).</li><li>Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+receptor+T+cells+mediate+pathologic+alloreactivity+in+patients+with+acute+graft-versus-host+disease.">Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease.</a> Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).</li><li>Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+functional+peptide+complexes+of+class+II+major+histocompatibility+complex+proteins+from+subunits+produced+in+Escherichia+coli.">Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).</li><li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4++T+cell+responses.">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This ...

T 림프구는 적응 면역 시스템의 중요한 구성 요소입니다. T 세포뿐만 아니라 직접 효과기 메카니즘을 통해 다양한 병원균에 보호 면역 반응을 매개 할뿐만 아니라 적극적으로 자기 면역 관용을 유지하고 면역 체계에서 다른 세포의 반응을 지시 할 책임이있다. 이러한 함수는 T 세포 수용체 (TCR) 결찰, 사이토 카인 및 케모카인, 및 대사 산물 일 포함한 집적 신호의 숫자를 통해 지향된다. 이 적응 면역으로 T 세포의 역할을 정의하는 특성 특이성을 제공하기 때문에 이러한 신호 중, TCR은 특히 중요하다. TCR은 T 세포의 이펙터 기능을 시작하는 신호를 제공하기 위해 민감도와 특이도가 매우 높은 방식으로 MHC (인간의 ortholog의 HLA) 분자 (pMHC 단지)에 의해 제시 선형 펩티드 항원과 상호 작용한다. pMHC 리간드와 TCR 상호 작용의 생화학 매개 변수 T에 대한 특이성뿐만 아니라 제공세포 활성화는 또한 후속하는 T 세포의 기능 (2)에 정 성적 영향을 미친다. 따라서 공부 T 세포의 기능은 종종 정의 항원 특이성 T 세포 클론의 응답을 검사하는 요구한다. 10 8 별개 αβTCRs 3-4 - 약 10 12 αβ의 T 세포를 함유하는 인간 T 세포 구획, 추정 된 107를 포함한다. 이 다양한 레퍼토리 보호 면역에 대한 T 세포 반응을 필요로 할 가능성이 병원균에서 펩타이드의 광대 한 배열의 인식을위한 기회를 제공한다. 그 항원 5 종래 면역 반응의 부재 10-7 - 이는 자기 MHC 제시 주어진 외래 항원에 대한 T 세포 응답의 주파수는 10-4 정도이다 것으로 추정된다. 나이브 T 세포 레퍼토리는 펩티드 항원 및 한계 반응 제시 자기 MHC 인식하는 능력을 보장하기 위해 흉선 선택에 의해 형성된다자기 항원에 대한 펩타이드의 ivity 보호 면역성이 중개 용 잠재 성을 극대화. 이 위반 반응성, 비교적 큰 주파수, 10-3 설계에서 그러나, - 면역 나이브 개체로부터 T 세포 10-4을, 외국인 MHC 분자뿐만 아니라 그들이 제시 내인성 펩티드를 모두 인식 동종 세포 자극에 반응 6. 동종 pMHC 리간드의 인식은 자기 MHC 제시 외국 항원의 인식과 구조적으로 유사하다; TCR은 동종 MHC 분자뿐만 아니라 펩티드 제시 7 모두 중요한 생화학 적 상호 작용을한다. pMHC의 다양성으로부터 동종 자극의 결과로 T 세포 반응의 강력한 특성상 동종 세포 (8)의 표면에 존재하는 복합체. 이것은 각각의 MHC 약 2 × 4 다른 내인성 펩티드 항원 제시 9 것으로 추정된다. 이 B동종 자극에 대한 응답의 readth은 T 세포 alloreactivity 인한, 이러한 숙주 질환 (GVHD) 대 동종 이식 거부 반응 또는 이식편과 같은 임상 적으로 관련 병리학의 중요한 측면이다. 인간 T 세포 alloreactive 반응 연구는 전통적으로 동종 세포 자극 이후 나이브 T 세포의 클론 반응 검사에 의존하고있다. 한계 희석 조합 같은 동종 세포주 반복 자극은 동종의 HLA (10)의 정의와 인식 클론 T 세포를 생성 할 수있다 분석한다. 내인성 pMHC의 크고 다양한 HLA 레퍼토리는 T 세포의 광범위한 레퍼토리를 자극 주어​​진 동종위한 본 복합체 그러나,이 접근법은, 개별 pMHC 동종 리간드에 대한 반응을 검사하는 문제가있다. 이 벌크 인구 자극 제한 희석 방법은 원하는를 Reacti와 T 세포를 분리하기 위해 다수의 클론의 스크리닝을 필요하나의 pMHC 리간드에 대한 vity. 또한, 개별 pMHC 동종 리간드에 반응 T 세포의 빈도는 소정의 항원에 응답하여 인간 T 세포 클론의 효율적인 생성에 대한 장벽을 제공 나이브 T 세포 집단 중에서 비교적 낮다. 식별 및 클론 집단에서 항원 특이 적 T 세포의 분리는 형광 표지 된 pMHC의 다량 체 (11)의 현상에 의해 활성화되었습니다. 이 접근 방법은 스트렙 타비 딘 - 표지 된 형광 물질에 결합함으로써 표시되어 재조합 가용성 바이오틴 MHC 분자에로드 특정 펩타이드 항원을 이용한다. pMHC의 Multimerization 수용성 pMHC 리간드 TCR의 본질적 낮은 (μM)의 친 화성을 보상 결합력을 증가시킨다. 표지 된 세포를 식별하고 유동 세포 계측법에 의해 단리 할 수​​있다. 그러나,이 접근은 아직 일반적이다 나이브 T 세포 집단 중 항원 특이 적 T 세포의 낮은 주파수에 의해 제한된다대부분의 유동 세포 계측기에 대한 정확한 확인 및 정량 한계 이하의 크기 순서. 이러한 한계를 해결하기 위해, 테트라 - 표지 된 세포 pMHC 량체 라벨 및 후속 자성 비드 농축 방법 (12)을 개발되었다. 이 방법은 신뢰할 수있는 검출, 열거 및 저주파수 항원 특이 적 T 세포의 분리를 보여 주었다. 이 프로토콜은 특별히 개별 pMHC 동종 리간드에 반응 인간 T 세포 클론의 생성을위한 유효 프로토콜을 설명한다. 프로토콜은 단일 정렬 세포로부터 T 세포 클론의 생산 (활성화 세포 분류 유세포 인간 T 세포의 생체 외 배양을위한 견고한 방법 alloantigen 특정 인간 T 세포의 분리를 위해 합체 라벨링 및 농축 pMHC (HLA)을 적용 그림 1의 개요).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="907">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm</td>
			<td style="width:223px;">Becton, Dickenson and Company</td>
			<td style="width:119px;">366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Lymphoprep</td>
			<td style="width:223px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:273px;">Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit</td>
			<td style="width:223px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Dulbecco&#39;s PBS, 1x without Ca or Mg</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EDTA</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Fluorophore-labeled pMHC tetramer</td>
			<td style="width:223px;">NIH Tetramer Facility</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EasySep Biotin Selection Kit</td>
			<td style="width:223px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EasySep Selection magnet</td>
			<td style="width:223px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:273px;">TruStain FcX Human Fc blocking solution</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">422301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">300621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-CD14 FITC (clone HCD14)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">325603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-CD19 FITC (clone HIB19)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">302205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Iscove&#39;s DMEM, without b-ME or L-glutamine</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">15-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HEPES</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">b-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Glutamax</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Gentamicin sulfate (50 mg/ml)</td>
			<td style="width:223px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">GT-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Human AB serum, male donor</td>
			<td style="width:223px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HS-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Recombinant human IL-2</td>
			<td style="width:223px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">AF 200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Media</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cell sorting buffer</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:223px;">1 L</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">BSA</td>
			<td style="width:223px;">10g</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EDTA (0.5 M)</td>
			<td style="width:223px;">2 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Human T Cell Culture Medium</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Iscove&#39;s DMEM</td>
			<td style="width:223px;">351.6 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Heat-inactivated human AB serum</td>
			<td style="width:223px;">40 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HEPES (1 M)</td>
			<td style="width:223px;">4 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Glutamax (100 x)</td>
			<td style="width:223px;">4 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td style="width:223px;">0.4 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">b-mercaptoethanol (14.3 M)</td>
			<td style="width:223px;">1.4 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Recombinant human IL-2 (1 mg/ml)</td>
			<td style="width:223px;">1 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human alloantigen-specific t cells from peripheral blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

전략 정렬 계측법 자성 비드 농축 및 단일 셀을 통해 유동 특이성 alloantigen 정의와이 프로토콜은 클론 인간 T 세포 배양의 생성을 설명한다. (1)가 처리의 개요를 제공하는 도표. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" /> 그림 1 : 프로토콜 개요 프로토콜은 여기에 설명 된 말초 혈액에서 alloant...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood at JoVE.com

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

generation-of-human-alloantigen-specific-t-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.8K 조회수.  University of California, San Diego. This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.