Los autores desean agradecer a Jeffrey Farrell, James Gagnon, y Jennifer Bergmann para comentarios sobre el manuscrito. KWR fue apoyada por el Programa de Becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Posgrado de Investigación durante el desarrollo del ensayo FDAP. Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH para AFS y por becas de la Fundación Alemana de Investigación (Programa de Emmy Noether), la Sociedad Max Planck, y el Programa de Human Frontier Science (Premio de carrera) a PM.

1. Generación de un fotoconvertible Fusión Construir y Inyectar dechorionated embriones de pez cebra <ol><li> Generar una construcción funcional que contiene la proteína de interés fusionada a una proteína fotoconvertible de verde a rojo (ver Discusión), a continuación, utilizar la transcripción in vitro para generar cubiertas de ARNm que codifica la proteína de fusión como en Müller et al., 2012 19. </li><li> Utilice pronasa para eliminar los chorions de aproximadamente 30 embriones de pez cebra en la etapa de una célula. Alternativamente, dechorionate manualmente embriones utilizando fórceps 28. Nota: Los embriones deben dechorionated para la imagen posterior. Si se desea, los embriones se pueden inyectar a través del corion y dechorionated más tarde, justo antes de la imagen. <ol><li> Hacer una solución de 5 mg / ml de stock de pronasa a partir de Streptomyces griseus en medio de embrión de pez cebra 19 estándar. Roca la solución suavemente a TA durante 10 min para permitir que la proteasa se disuelva. Alícuota 2 ml en tubos de microcentrífuga y congelar a -20 ° C. </li><li> De transferencia de fase de una célula embriones a un vaso de diámetro 5 cm o placa Petri de plástico de agarosa-recubierta que contiene ~ 8 ml de medio de embrión. Añadir 2 ml de solución de pronasa Stock descongelado al plato y se incuba a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos. </li><li> Evite la exposición de los embriones al aire o de plástico, ya que el contacto con cualquiera de los dos hará que los embriones dechorionated la rotura. Llene un vaso de vidrio de 200 ml con medio embrión. La transferencia de los embriones al vaso de precipitados por la inclinación de la placa de Petri mientras sumerge en el medio. </li><li> Después de los embriones han depositado en el fondo del vaso de precipitados, se vierte la mayor parte del medio de embrión, luego verter medio de embrión fresco en el vaso de precipitados. El remolino suave del medio de verter en el vaso de precipitados provoca embriones pierdan sus chorions debilitados. </li><li> Repita el paso 1.2.4. </li></ol></li><li> La transferencia de los embriones dechorionated a un plato de inyección de agarosa recubiertas con 29 utilizando una pipeta Pasteur de vidrio con una punta flameado. Llameantela punta de la pipeta evita que los bordes dentados de embriones hiriendo. </li><li> Co-inyectar el ARNm y un 3 kDa Alexa488-dextrano conjugado 29,30 (Figura 1B; véase la discusión para sugerido ARNm y cantidades Alexa488-dextrano). Inyectar directamente en el centro de la célula (no la yema) para asegurar una distribución uniforme de ARNm y colorante fluorescente una vez que comienza la escisión. Nota: La señal Alexa488 se utilizará durante el análisis de datos para generar máscaras compartimentales con el fin de distinguir entre la fluorescencia intracelular y extracelular. </li><li> Transferencia de embriones inyectados a un pozo de agarosa recubiertas de 1-2% de un plato de seis pocillos de plástico llena de medio de embrión. Incubar en la oscuridad a 28 ° C hasta que los embriones han alcanzado esfera última etapa 31 (aproximadamente después de la fecundación 5 h). Compruebe embriones cada uno a 2 horas bajo un microscopio estereoscópico y eliminar los residuos generados por los embriones que han muerto. </li></ol> 2. Montaje embriones de pez cebra para Photoconversion e Imagen en un microscopio confocal invertido <ol><li> Utilice un estereomicroscopio para identificar cuatro y cincuenta y nueve embriones sanos, y utilizar una pipeta Pasteur de vidrio con una punta de flameado para eliminarlos de la placa. </li><li> Expulsar suavemente los embriones en un tubo de microcentrífuga que contiene ~ 1 ml de derretida 1% agarosa de bajo punto de fusión en medio de embrión de 1x Danieau (ver Lista de Materiales) (Figura 2A). Nota: Agarosa debe tener una temperatura entre 40 y 42 ° C; temperaturas más altas podrían dañar los embriones. </li><li> Dibujar los embriones de nuevo en la pipeta junto con algunos de agarosa. Expulsar suavemente la agarosa y embriones en el cristal de la cubierta de un plato de fondo de vidrio (Figura 2B). Asegúrese de que el espesor de la cubierta de vidrio es compatible con el objetivo en el microscopio confocal. <ol><li> Re-utilizar la pipeta de vidrio si se desea. Para limpiar la agarosa residual de la pipeta y evitar la obstrucción, de forma rápida medio embrión pipeta hacia arriba y abajo.Colocar un tubo de 15 ml lleno de ~ 5 ml de medio de embrión junto al estereomicroscopio para este propósito. </li></ol></li><li> Utilice una sonda de metal para colocar los embriones de modo que el polo animal (blastodermo) se enfrenta a la cubierta de vidrio. Trabaje con rapidez ya que la agarosa se solidificará en 20-30 segundos. Utilice el microscopio estereoscópico para supervisar las posiciones de los embriones y reajustar si es necesario hasta que la agarosa se endurece. </li><li> Repetir los pasos 2.1 a 2.4 hasta que se ha montado el número deseado de embriones. Nota: En un experimento típico, cuatro gotas de agarosa que contienen cuatro o cinco embriones cada una caben fácilmente en la cubierta de vidrio. Alrededor de 16 embriones se pueden obtener imágenes durante un solo experimento ideales (Figura 2C). </li><li> Cuando la agarosa se ha solidificado, llenar el plato de fondo de vidrio con medio embrión de 1x Danieau. </li></ol> 3. Photoconverting y medición de la disminución de la señal Photoconverted Uno de los objetivos 25X o 40X agua is apropiado para el tamaño y el índice de refracción de embriones de pez cebra. Es mejor utilizar aceite de inmersión con el mismo índice de refracción que el agua en lugar de agua real es, ya que el agua se evaporará durante el curso del experimento de cinco horas. Asegúrese de que el aceite de inmersión está diseñado para ser utilizado con un agua (no aceite) objetivo. <ol><li> Colocar una gota grande de aceite de inmersión en el objetivo de garantizar que la película de aceite entre el objetivo y la cubierta de vidrio no se romperá como la etapa se mueve a diferentes posiciones embrión durante la formación de imágenes. Coloque de forma segura el plato con fondo de cristal en el escenario para que el plato no se mueva cuando el escenario se mueve. Si es posible, utilice una etapa se calienta a 28 ° C, la temperatura óptima para el desarrollo del pez cebra. </li><li> Definir la posición de cada embrión en el paquete de software del microscopio confocal. Ajuste la profundidad z para cada embrión, y tratar de apuntar a más o menos el mismo plano en cada embrión. Nota: Sobre 30 micras desde el polo animal es un irprofundidad desde ya que en esta profundidad la capa envolvente del embrión se puede evitar, área de imagen se maximiza, y dispersión de la luz es mínimo. Una sola rebanada óptico con un espesor de ~ 3,3 micras proporciona datos suficientes; no hay necesidad de adquirir una pila z (véase la sección 5). </li><li> Recoger dos señales durante el experimento: la señal de &quot;verde&quot; de la Alexa488-dextrano conjugado que se utilizará durante el análisis de datos para aislar extracelular e intracelular de fluorescencia y la señal de &quot;red&quot; de la proteína de fusión después de que se photoconverted. <ol><li> Excite Alexa488 utilizando un láser de 488 nm, y recoger la fluorescencia emitida entre ~ 500 y 540 nm. Nota: Después de fotoconversión, muchos de verde a rojo proteínas fotoconvertible (por ejemplo, Dendra2) puede ser excitado con un láser de 543 nm y emiten fluorescencia entre ~ 550 y 650 nm. Ajuste según sea necesario en función de la proteína fotoconvertible utilizado. </li></ol></li><li> Adquirir &quot;pre-fotoconversión&quot;Las imágenes, y configurar el software del microscopio confocal de imagen cada una de las posiciones previamente definidas (desde el paso 3.2) con las condiciones de imagen apropiadas cada 10 o 20 minutos para un curso de tiempo de cinco horas (ver sección 5 y Discusión). </li><li> Para photoconvert la proteína de fusión, cambiar a un objetivo de 10X y exponer grupos de embriones a la luz UV de una lámpara de arco de mercurio con un filtro de ~ 300-400 nm de excitación en la salida 100% durante 2 min. Cambiar el enfoque a lo largo del eje z para promover fotoconversión uniforme (véase la Sección 5). Asegúrese de que el aceite de inmersión no gotee sobre el objetivo 10x durante fotoconversión. Nota: El cambio de enfoque durante fotoconversión podría ser automatizado con el fin de evitar la variabilidad entre los experimentadores. </li><li> Cambie de nuevo al objetivo 25X o 40X inmediatamente después fotoconversión. Asegúrese de que las posiciones previamente definidas desde el paso 3.2 siguen siendo precisa. Si el plato se desplazó durante photoconversión, vuelva a definir las posiciones de los embriones. <ol><li> Inicie el programa creado en el paso 3.4 y permite imágenes de continuar durante 5 horas. Tenga en cuenta el tiempo transcurrido entre fotoconversión y el inicio de formación de imágenes para cada embrión. </li></ol></li><li> Comprobar de vez en cuando en el experimento. Controle el nivel de medio de Danieau y añadir más si es necesario. Reinicie el software si se ha estancado. </li><li> Con el fin de determinar los valores de fluorescencia de fondo que se utilizará durante el análisis de datos para estimar la asíntota de un modelo exponencial decreciente, incluir algunos embriones que han sido inyectados con Alexa488-dextrano pero no mRNA en el experimento. Para determinar el ruido del instrumento, que también se utiliza durante el análisis posterior de los datos, adquirir una imagen en ausencia de una muestra. </li></ol> 4. El análisis de los datos mediante PyFDAP <ol><li> Inspeccione visualmente el tiempo de los conjuntos de datos curso de cada embrión. Deseche los conjuntos de datos a partir de embriones que murieron durante imaging, que cambió de manera significativa, que tienen muy bajos niveles de señal photoconverted, o que contienen regiones de células con aspecto inusual y han dejado de moverse y dividiendo (típico de embriones heridos o enfermos). Nota: En ocasiones, las burbujas en el aceite de inmersión u otros artefactos aparecerán en una o dos imágenes en un conjunto de datos de otra forma utilizable. Nota alguna de las imágenes que contienen artefactos; que serán descartados después, y los puntos de tiempo restante desde un conjunto de datos tales todavía pueden ser analizados. </li><li> Utilice el paquete de software PyFDAP basado en Python para analizar los datos FDAP. PyFDAP calcula vidas medias mediante la determinación de la intensidad media de fluorescencia roja intracelular y extracelular en cada imagen y ajuste de los datos con una función exponencialmente decreciente 56 (Figura 3). <ol><li> Descarga PyFDAP (ver Lista de Materiales). </li><li> Uso PyFDAP para separar la señal intracelular y extracelular photoconverted (Figura 3A, B). Nosotrose la señal Alexa488, que es estrictamente intracelular, para crear una máscara de intracelular. Aplique esta mascarilla para la imagen del canal rojo correspondiente para evitar píxeles intracelulares de ser considerado en el cálculo de la intensidad media extracelular. Para medir la intensidad media intracelular, invertir la máscara. </li><li> En PyFDAP, mostrar las imágenes enmascaradas generados en el paso 4.2.2. Inspeccione visualmente estas imágenes y descarte los conjuntos de datos en la que las máscaras no distinguen con precisión intracelular desde el espacio extracelular (esto debe ser raro; en cuenta que las membranas celulares se incluyen en imágenes en las que el espacio extracelular se ha enmascarados, pero podrían ser eliminados por alterar el umbral algoritmo o mediante la introducción de una máscara de membrana (por ejemplo, usando la membrana PPC)). También deseche cualquier imágenes individuales que contienen artefactos (por ejemplo, las burbujas en el aceite de inmersión) identificados en el paso 4.1. </li><li> Utilice PyFDAP para calcular la media intensidad de fluorescencia extracelulares e intracelulares para each imagen. PyFDAP calcula los promedios sumando las intensidades de los píxeles que caen fuera de la máscara y dividiendo por el número total de píxeles sumadas. </li><li> Coloque los datos de fluorescencia (Figura 3C) con la siguiente función exponencial: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> donde t es el tiempo post-fotoconversión, c (t) es la intensidad a un valor dado de t, c 0 es la intensidad en t = 0, k es la constante de velocidad de eliminación, e y 0 es la asíntota que la función se acerca como fluorescencia disminuye (Figura 1D). y 0 puede ser limitado basado en las mediciones en el paso 3.8 19. </li><li> Utilice PyFDAP para calcular la vida media de la proteína extracelular e intracelular (τ) de las constantes de velocidad de aclaramiento (k) utilizando la siguiente relación: <img fo:content-width = src &quot;1in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52266 / 52266eq2.jpg&quot; width = &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol> 5. Los experimentos de control para evaluar Photobleaching, inadvertida Fotoconversión y Fotoconversión Uniformidad <ol><li> Fotoblanqueo Evaluación Nota: Photobleaching podría causar una disminución en la intensidad de fluorescencia de artefactos que refleja las propiedades blanqueadoras de la proteína fluorescente, además de la eliminación de la proteína de interés. <ol><li> Para evaluar la posible fotoblanqueo, realizar una serie de experimentos FDAP con intervalos de 10 minutos entre imágenes y un segundo grupo con 20 min intervalos entre las imágenes (Figura 4). Analizar los datos de ambos conjuntos de experimentos utilizando PyFDAP como se describe en la Sección 4. </li><li> Comparar la vida media de los 10 y 20 experimentos de intervalo min. Media más larga vida de 20 min experimentos de intervalo indican fotoblanqueo significativo. Si las vidas medias de ambos experimentos son idénticos, Fotosobleaching no es una preocupación significativa. </li><li> Por otra parte, evaluar fotoblanqueo mediante la adquisición de una serie de ~ 30 imágenes inmediatamente después fotoconversión. Una disminución significativa en la intensidad de fluorescencia indica photobleaching significativo. </li><li> Si se detecta fotoblanqueo, utilizar la potencia del láser inferior, disminuir el tiempo de formación de imágenes, o considerar el uso de una proteína fotoconvertible más fotoestable 32. </li></ol></li><li> Evaluación de fotoconversión inadvertida. Nota: se puede Dendra2 photoconverted usando 488 nm iluminación 27. Cuando Alexa488 emocionante con el láser de 488 nm tal como se describe en el paso 3.3.1, fotoconversión inadvertida y por lo tanto un aumento de artefactos en la vida media aparente de la proteína de interés es posible. Sin embargo, nosotros y otros 33 hemos encontrado que 488 nm iluminación es un método ineficiente de fotoconversión en embriones de pez cebra. <ol><li> Utilice el experimento de control se describe en el paso 5.1.1 para detectar fotoconversión inadvertida. Comparar la vida media de los 10 y 20 experimentos de intervalo min. Vidas medias más cortas de 20 minutos de intervalo experimentos indican fotoconversión involuntaria significativa. Si las vidas medias de ambos experimentos son idénticos, fotoconversión inadvertida no es una preocupación significativa. </li><li> Si se detecta fotoconversión inadvertida, utilice una fuente de láser de 488 nm inferior y los tiempos de imagen más cortos para evitar inadvertidamente photoconverting Dendra2. </li></ol></li><li> Evaluación de la homogeneidad fotoconversión. Nota: Si fotoconversión está sesgado hacia el polo animal del embrión, la disminución de la fluorescencia se verá influenciada por difusión proteína o el movimiento celular en planos más profundos (Figura 5A). <ol><li> Para determinar si fotoconversión es uniforme, expresar una proteína secretada fotoconvertible (para los experimentos con proteínas de fusión extracelulares) o una proteína citoplasmática fotoconvertible (para los experimentos con proteínas de fusión intracelulares). Photoconvert como de costumbre, tgallina adquieren un z-pila que abarca la mayor parte del blastodermo cada 20 min durante 80 min. </li><li> Si fotoconversión está sesgada hacia el polo animal, la intensidad de fluorescencia en planos más profundos aumentará con el tiempo debido a la difusión o movimiento de las células (Figura 5B). Si se detecta fotoconversión no uniforme, se centran más en los embriones durante fotoconversión. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen conflictos a revelar.

El éxito de un experimento FDAP se basa en la generación de una proteína de fusión fotoconvertible funcional. Etiquetado de una proteína puede afectar a su actividad biológica y / o propiedades biofísicas, incluyendo su localización, la solubilidad y la estabilidad 36-41. Estar preparado para probar la actividad de varias construcciones de fusión diferentes con el fin de encontrar uno que es activo. Hemos encontrado que el cambio de la posición de la proteína fotoconvertible relación a la proteín...

Los niveles de proteínas en células y organismos están determinadas por sus tasas de producción y el aclaramiento. Proteínas vidas medias pueden variar desde minutos a días 1-4. En muchos sistemas biológicos, la estabilización o eliminación de proteínas clave tiene efectos importantes sobre la actividad celular. Se requiere la modulación de la estabilidad de la proteína intracelular para la progresión del ciclo celular 5,6, la señalización del desarrollo 7-9, apoptosis 10, y la función normal y el mantenimiento de las neuronas 11,12. Estabilidad de la proteína extracelular afecta a la distribución y la disponibilidad de las proteínas secretadas, tales como morfógenos 13,14, dentro de un tejido. Durante las últimas décadas, la estabilidad de proteínas principalmente se ha evaluado en cultivo celular utilizando pulsos marcaje radioactivo o experimentos de persecución cicloheximida 15. En estos experimentos de pulso-caza, las células son o bien transitoriamente expuestos a un &quot;pulso&quot; de amino radiactivoprecursores de ácido que se incorporan en las proteínas recién sintetizadas, o que están expuestos a la cicloheximida, que inhibe la síntesis de proteínas. Las células cultivadas se recogen a diferentes puntos de tiempo, y, o bien inmunoprecipitación seguido por autorradiografía (en los experimentos de pulso-caza radiactivos) o Western Blot (en experimentos de cicloheximida) se utiliza para cuantificar la liquidación de la proteína en el tiempo. Ensayos de estabilidad de proteínas convencionales tienen varias deficiencias. En primer lugar, las proteínas en estos ensayos a menudo no se expresan en sus entornos endógenos, sino más bien en el cultivo de tejidos y algunas veces en las células de diferentes especies. Para las proteínas cuya estabilidad es dependiente del contexto, este enfoque es problemático. En segundo lugar, no es posible seguir el aclaramiento de proteínas en las células individuales o los organismos con el tiempo, y los datos de estos ensayos refleja un promedio de diferentes poblaciones de células en diferentes puntos de tiempo. Dado que las células individuales pueden haber comenzadocon diferentes cantidades de proteína, pudo haber tomado la etiqueta o cicloheximida radiactivo en diferentes momentos, o puede tener diferentes cinética de depuración, tales datos agregados podrían ser engañosas. Finalmente, en el caso de los experimentos de persecución cicloheximida, la adición del inhibidor de la síntesis de proteínas puede tener efectos fisiológicos no deseados que podrían alterar artificialmente estabilidad de la proteína 16-18. Estas deficiencias se pueden evitar mediante el uso de fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), una técnica que utiliza proteínas fotoconvertible para medir la eliminación de proteínas de forma dinámica en los organismos vivos 19-25 (véase la discusión de las limitaciones de la técnica FDAP). Proteínas fotoconvertible son proteínas fluorescentes cuya excitación y de emisión propiedades cambiar después de la exposición a determinadas longitudes de onda de la luz 26. Una variante comúnmente usado es Dendra2, una proteína fotoconvertible &quot;-verde a rojo&quot; que tiene inicialmente excitas y emisión propiedades similares a las proteínas fluorescentes verdes, pero después de la exposición a &quot;fotoconversión&quot; UV iluminación -su de excitación / propiedades de emisión se vuelven similares a los de las proteínas fluorescentes rojas 23,27. Es importante destacar que, nueva proteína producida después de fotoconversión no tendrá las mismas propiedades de excitación / emisión como la proteína photoconverted, lo que permite el desacoplamiento de la producción y el despacho al fotoconversión y la observación de sólo una piscina de la proteína photoconverted. Etiquetado de proteínas de interés con proteínas fotoconvertible tanto, proporciona una manera conveniente a pulso la etiqueta proteínas en organismos vivos, ópticamente accesibles intactas. En los ensayos de FDAP (Figura 1A), una proteína de interés se marca con una proteína fotoconvertible y se expresa en un organismo vivo (Figura 1B). La proteína de fusión se photoconverted, y la disminución en la señal photoconverted lo largo del tiempo se controla mediante fluorescenmicroscopía ce (Figura 1C). Los datos se ajusta entonces con un modelo apropiado para determinar la vida media de la proteína de fusión (Figura 1D). El ensayo FDAP descrito aquí fue diseñado para determinar las vidas medias extracelulares de las proteínas de señalización secretadas en embriones de pez cebra durante la embriogénesis temprana 19. Sin embargo, este enfoque puede ser adaptado a cualquier organismo modelo transparente que tolera la formación de imágenes en vivo, y podría ser utilizado para monitorear la liquidación de cualquier proteína intracelular o extracelular taggable. Las variaciones de la técnica descrita aquí se han realizado en células cultivadas Drosophila 20,23 y 22 y 21 embriones de ratón.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

Estabilidad de la proteína influye en muchos aspectos de la biología, y la medición de la cinética de eliminación de proteínas puede proporcionar importantes conocimientos sobre los sistemas biológicos. En experimentos FDAP, la liquidación de las proteínas dentro de los organismos vivos se puede medir. Una proteína de interés se marca con una proteína fluorescente fotoconvertible, expresada in vivo y photoconverted, y la disminución en la señal de photoconverted lo largo del tiempo se controla. Los datos se ajusta entonces con un modelo de espacio libre apropiado para determinar la vida media de la proteína. Es importante destacar que la cinética de remoción de las poblaciones de proteínas en los diferentes compartimentos del organismo pueden ser examinados por separado mediante la aplicación de máscaras compartimentales. Este enfoque ha sido utilizado para determinar la vida media intra y extracelulares de las proteínas de señalización secretadas durante el desarrollo de pez cebra. Aquí se describe un protocolo para experimentos FDAP en embriones de pez cebra. Debería ser posible utilizar FDAP para determinar la cinética de remoción decualquier proteína taggable en cualquier organismo ópticamente accesible.

FDAP se ha utilizado para determinar la vida media de las proteínas de señalización extracelular en embriones de pez cebra 19. Una de estas proteínas, estrabismo, induce la expresión de genes mesendodermal durante la embriogénesis 34. Estrabismo-Dendra2 activa la expresión de genes mesendodermal en niveles similares a untagged Estrabismo, como se demuestra por QRT-PCR y en ensayos de hibridación in situ 19. Los embriones se co-inyectados con Alexa488-dextrano y ...

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

11.1K vistas.  Harvard University.  Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo. 

Video: Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Lesiones Embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Los embriones

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...