Este producto está optimizado para nivelar proteínas con la etiqueta de proteína de fluorescencia, y para visualizar la ubicación y la expresión de la proteína de un interesante individuo de laboratorio de pez cebra. Es especialmente útil para obtener imágenes de proteínas expresadas en baja abundancia. Nuestro método simplifica y acelera el proceso de construcción de donantes.
Estos componentes, a excepción del CDS, se incorporan a la red troncal de antemano. El donante también se optimizó para aumentar la eficiencia. El flujo de trabajo de la pantalla de transmisión acumula núcleo heredable al menor costo de tiempo y esfuerzo.
El pez cebra es el organismo modelo ampliamente utilizado en la investigación sobre infecciones e inmunidad. Estamos especialmente interesados en los mecanismos que subyacen a la sepsis. Dado que ahora podemos hacer un marcado de fluorescencia fácilmente usando nuestro protocolo, intentaremos etiquetar una imagen, proteínas de sepsis y células en pez cebra.
Para comenzar, coloque un pez cebra hembra sano y dos peces cebra macho sanos en un tanque de apareamiento. Use un divisor para separar a los machos de las hembras para prepararlos para el apareamiento. El día de la microinyección, prepare la mezcla de microinyección en hielo en un entorno libre de ARNasa.
Con una punta de pipeta sin arnasa, cargue la solución de microinyección en la aguja. Coloque la aguja cargada en un micro manipulador conectado a un micro inyector. Bajo un microscopio, use pinzas puntiagudas para cortar la punta de la aguja pellizcándola suavemente hasta que se rompa.
Ajuste la presión de inyección hasta que la aguja expulse constantemente una gota de un nanolitro. A continuación, retire el divisor del tanque de apareamiento y deje que los peces se reproduzcan durante seis minutos. Recoja y transfiera los embriones en etapa de una célula a una placa de Petri que contenga tampón de embriones.
Examine la salud de los embriones bajo un microscopio óptico y retire los óvulos no fertilizados o los desechos. Reserve 20 embriones sanos en una placa de Petri separada como controles sin inyectar y etiquete la placa. Con un cepillo pequeño, transfiera y alinee suavemente los embriones sanos en etapa de una célula en las ranuras de una placa de microinyección calentada a temperatura ambiente.
Retire el exceso de tampón de la placa. Con la ayuda de la punta de una aguja, ajuste suavemente la posición de cada embrión para que el palo del animal quede frente a la aguja. Inyecte un nanolitro de la solución mezclada en el polo animal.
Después de la inyección, enjuague suavemente los embriones en una placa de 6 pocillos con tampón para embriones. Coloque la placa en una incubadora de temperatura constante de 28,5 grados centígrados. A las 10 horas después de la fertilización, examine el desarrollo embrionario bajo un microscopio estereoscópico y retire los embriones muertos.
A las 24 horas después de la fertilización, recoja los embriones en tubos de 1,5 mililitros para el genotipado y deseche el agua adicional con cuidado. Agregue 100 microlitros de tampón de lisis que contiene proteinasa K a cada tubo. Incube los tubos a 56 grados centígrados durante una hora y luego a 95 grados centígrados durante 15 minutos.
Después de la incubación, agregue 200 microlitros de etanol y mezcle bien. Centrifugar el tubo a 19.000 G durante 10 minutos y desechar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet con 500 microlitros de etanol al 70%. Centrifugar de nuevo y secar al aire el pellet antes de disolverlo en 50 microlitros de agua bidestilada.
Utilice un microlitro del extracto para preparar la mezcla de reacción para la PCR. Después de la PCR, ejecute geles de agarosa con dos microlitros de productos de PCR para confirmar el éxito de la amplificación. Realizar digestión enzimática para evaluar la eficiencia de los sgRNAs.
Mezclar suavemente la solución de digestión e incubar a temperatura ambiente, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ejecute geles de agarosa para productos digeridos junto con controles de PCR no digeridos para confirmar la digestión. Para analizar la eficiencia del sgRNA, abra el sitio web de TIDE y haga clic en Iniciar TIDE.
Introduzca la secuencia guía del sgRNA en el marco de la secuencia guía. Haga clic en Examinar para cargar el resultado de la secuenciación del control de tipo salvaje en el campo de cromatograma de muestra de control. Del mismo modo, cargue el resultado de la secuenciación de la muestra editada en el campo de cromatograma de muestra de prueba.
Haga clic en Actualizar vista para analizar los resultados. Para empezar, utilice la clonación independiente de la ligadura o LIC con exonucleasa III para construir el plásmido donante. Imprimación de diseño F1 con una secuencia superpuesta con el elemento vectorial 1 y parte del elemento 2.
Imprimación de diseño R2 con una parte del elemento 1, el elemento 2 y el elemento 3. Diseñe el cebador F2 para incluir los elementos 3 y 4, y la secuencia de 5 primos del CDS siguiendo el sitio objetivo del sgRNA. Imprimación de diseño R1 con las tres secuencias principales de la secuencia de recubrimiento y una secuencia superpuesta con el vector.
Utilice el CDNA del pez cebra como plantilla y realice la PCR con los cebadores diseñados. Purifique los productos de PCR mediante precipitación de etanol. Digiera el vector donante con enzimas de restricción como pCI y Acc65I, y purifique el vector donante digerido.
Cuantificar los fragmentos de PCR purificados y el vector donante digerido mediante electroforesis en gel de ADN. A continuación, prepare la mezcla de LIC con vector donante purificado e incube en hielo durante 60 minutos. Agregue un microlitro de EDTA 0.5 molar para detener la reacción.
Pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución. Incubar la mezcla de reacción a 60 grados centígrados durante cinco minutos. Enfríe los productos LIC con hielo.
A continuación, transforme las células competentes para DH5-alfa utilizando productos LIC. Coloque las células transformadas en placas Luria-Bertani que contengan la ampicilina y archívelas crecer durante 16 horas. Después de la incubación, elija colonias individuales de las placas LIC para el análisis de digestión enzimática y la secuenciación del ADN.
Extraiga y purifique los plásmidos donantes correctos con un kit de purificación. Inyecte embriones de pez cebra con una mezcla de microinyección para la eliminación de genes'12 a 48 horas después de la microinyección, bajo un microscopio de fluorescencia estereoscópica, observe la fluorescencia de las larvas de pez cebra. Utilizando un método de cribado establecido, seleccione las larvas fluorescentes y críalas por separado.
Al mes de edad, recoja un pequeño trozo de la aleta de mimo de cada pez cebra anestesiado en un tubo de PCR etiquetado. Coloque el pez cebra anestesiado correspondiente en una placa de 6 pocillos llena de agua filtrada esterilizada con rayos UV que coincida con la etiqueta del tubo. Extraiga el ADN genómico mediante el método de lisis alcalina.
Diseñe un cebador delantero aguas arriba del brazo de homología izquierdo y un cebador inverso en el inserto. Realice la PCR, dirigiéndose a las cinco uniones principales de la secuencia. Examinar los embriones F1 obtenidos mediante el apareamiento del pez cebra F seleccionado con el pez cebra de tipo salvaje para determinar los patrones de expresión de GFP.
Genotipado de los embriones F1 mediante PCR de unión. Se observó fluorescencia específica hereditaria en los músculos de toda la progenie F1, lo que indica el etiquetado exitoso de GFP de la conexión 39.9. Se detectó fluorescencia específica hereditaria en el cristalino de toda la progenie F2, lo que sugiere un marcado exitoso de mCherry de la conexión 44.1.
La correcta detonación de las conexiones 39.9 y 44.1 se verificó mediante reacciones en cadena de la polimerasa de unión.
