Damos las gracias a J. Chen para proporcionar la jaula con fluoresceína dextrano protocolo de síntesis. Esta investigación fue financiada por March of Dimes premio 5-AF09-78, la American Heart premio de la Asociación 09BGIA2090075, y el premio del NIH / NHLBI HL107369 R01-01 a SS Un agradecimiento especial a C. Closson por su ayuda de microscopía.

1. Síntesis de la jaula con fluoresceína dextrano (adaptado de la referencia 14.) <ol><li> Prepare una solución 0,1 M de borato de sodio diluido en ddH 2 O. </li><li> Medida 4 mg de 10 kDa aminodextrano y añadirlo al tubo CMNB-jaula con fluoresceína. </li><li> Añadir 500 l de la solución de borato de sodio preparada (paso 1.1) en el tubo CMNB-jaula con fluoresceína. Tape el tubo y agitar durante 30 segundos para disolver la mezcla. </li><li> Dejar que la mezcla de reacción durante la noche en un nutator a temperatura ambiente. Cubrir el tubo con papel de aluminio para prevenir la exposición de la mezcla de la luz ambiental. </li><li> Obtener una columna Zeba desalar giro y giro de la tapa inferior. Marca un punto en la columna, que se utilizarán para orientar la columna cuando la centrifugación. Colocar la columna en un tubo de 15 ml cónicos Falcon. Nota: La solución en la columna de giro es tampón de columna. </li><li> Afloje la tapa superior de la columna de centrifugación desalar. Coloque el tubo cónico de 15 ml Falcon que alberga la columna de centrifugación desalar en una centrifugadora. Orientar la columna de centrifugación con el punto marcado (paso 1.4) frente al centro del rotor centrífugo. Centrifugar el tubo a 1000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación, eliminar la columna de centrifugación desalinización del tubo Falcon. Descartar tanto el flujo de recogidas y el tubo cónico de 15 ml. Obtener un nuevo tubo cónico de 15 ml Falcon, y el lugar de la columna de centrifugación desalar en el nuevo tubo Falcon. Nota: Después de la centrifugación, el lecho de resina columna debe aparecer compactado. Use la columna de inmediato. </li><li> Obtener la mezcla de reacción (jaulas con fluoresceína dextrano) en el paso 1.3. Retire la tapa de la columna de centrifugación y se aspira la mezcla de reacción y se aplican lentamente hacia el centro de la columna de giro desalar. Después de aplicar la mezcla de reacción, coloque la tapa en la columna de giro. </li><li> Coloque el tubo Falcon que alberga la columna de centrifugación desalar en una centrifugadora. Como se ha hecho en el paso 1.5, orientar la columna de centrifugación con el punto marcado hacia el centro del rotor centrífugo. Centrifugar el tubo a 1000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación, una mezcla de color amarillo (fluoresceína enjaulado-dextrano) serán recogidos (aproximadamente 400 l) en el tubo de 15 ml Falcon. Transferencia de la jaula con fluoresceína dextrano mezcla a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Cubrir inmediatamente el tubo con papel de aluminio para prevenir la exposición de la mezcla de la luz ambiental. Liofilizar la jaula con fluoresceína dextrano mezcla en un speedvac. La liofilización de 350 l debe tomar aproximadamente 4 horas. </li><li> Después de completar la liofilización, resuspender el polvo (aproximadamente 3 mg) en ddH2O a una concentración final de aproximadamente 1% w / v. Mezclar con una breve agitación de suspender el polvo. </li><li> Alícuota de la jaula con fluoresceína dextrano en tubos separados de lámina de metal cubierta, y almacenarlos a -20 ° C. </li></ol> 2. La recolección de los embriones y microinyección de jaulas con fluoresceína dextrano * Este procedimiento utiliza el pez cebra como modelo animal el sistema. <ol><li> El día antes de las inyecciones, establecer cruces cebra o 1:01 de hombre a mujer o de 2:1 hombre-mujer en acuarios de cría con separadores. </li><li> A la mañana siguiente cambiar el agua del tanque de cría y eliminar los separadores. Inmediatamente prepare un 5 l 01.10 solución diluida de trabajo de la jaula con fluoresceína dextrano, ya sea en un medio X Danieau (ver Preparación de las soluciones) o ddH 2 O. Cubra el tubo de solución de trabajo con papel de aluminio para prevenir la exposición a la luz. </li><li> Pipeta de la jaula preparada con fluoresceína dextrano solución (paso 2.2) en la aguja. Antes de cortar la punta de la aguja de un tamaño apropiado en el microscopio de disección, coloque un pedazo de filtro amarillo transparente frente a la fuente de luz blanca. El filtro amarillo evitará uncaging espontánea de la fluoresceína dextrano durante las inyecciones. Al mirar a través del ocular ocular, la fuente de luz debe aparecer de color amarillo. </li><li> Recoger los embriones y la pipeta que el molde en una bandeja de microinyección. Establecer el tiempo de microinyección para entregar 3-4 nL de jaulas con fluoresceína dextrano. Bajo el microscopio de disección, orientar a los embriones con unas pinzas y se inyecta (3 a 4 nL) enjaulados fluoresceína dextrano en la base de las células blastómeros (blastómero de yema de interfaz). La etapa de embrión para la inyección debe ser de 1 - a 2 células etapa. </li><li> Después de la inyección, la toma de embriones de la bandeja de molde microinyección y colocarlos en una placa de Petri que contiene limpiar los peces de agua dulce. El azul de metileno puede ser añadido al agua de pescado para prevenir el crecimiento de hongos en una concentración final de 0,02% w / v. Cubrir la placa de Petri con papel de aluminio para evitar que uncaging de la inyección de fluoresceína enjaulado-dextrano. </li><li> Aumentar los embriones inyectados a una etapa en la que las células de interés deben ser fotoactivado. Para la fotoactivación, preparar un 0,6% de baja fusión solución de agarosa en ddH 2 O. Dependiendo de la etapa embrionaria, tricaína (MS222) se puede agregar a la baja temperatura de fusión de agarosa. Para ello, diluir 0,02% de agarosa de bajo tricaína en fusión a una concentración final de 0.0014%. </li><li> Tan pronto como los embriones llegan a la etapa de desarrollo apropiada, dechorionate los embriones en un medio X Danieau con pinzas. Cuando dechorionating, asegúrese de que un filtro de color amarillo transparente se coloca en el camino de la fuente de luz blanca (ver paso 2.3). </li><li> Calentar el 0,6% de baja fusión solución de agarosa a 37 ° C. Pipeta de 1 ml de bajo punto de fusión de agarosa en el pozo de una diapositiva cubreobjetos Labtek cámaras. Cuidado montaje 3 a 4 embriones de baja fusión de agarosa y orientarlos con una pinza con las células que se fotoactivado hacia abajo contra la parte inferior cubreobjetos. </li><li> Deje que la agarosa se solidifique. Después de la solidificación, pipeta de 1 ml de un medio X Danieau más de la agarosa. </li><li> Repita los pasos 2,8 a 2,9 para obtener más embriones. </li></ol> 3. Dos fotones de la activación de jaulas con fluoresceína dextrano * Este procedimiento supone que el embrión expresa GFP reportero. El embrión se ve usando el ion de argón (488 nm) fuente de láser conectado al microscopio LSM 510 META NLO. Una célula de GFP positivos solo se selecciona y fotoactivado con el Mai Tai láser (láser de femtosegundo), junto a la LSM 510. El procedimiento es el mismo para no fluorescente embriones. Por otra parte, la luz blanca se puede utilizar para encontrar la célula para ser activado, seguido por la activación con el Mai Tai fuente de láser. <ol><li> Cargar el software LSM 510. Colocar un filtro amarillo transparente en el camino del haz de luz blanca. </li><li> Seleccione Escanear imagen nueva y haga clic en Iniciar el modo experto. </li><li> Seleccione la pestaña de láser. Encienda el ion argón (488 nm) y Mai Tai (femtosegundo) las fuentes de láser. </li><li> Establecer el Mai Tai longitud de onda de 740 nm. </li><li> Seleccione la pestaña de configuración. Establecer la configuración de camino óptico para el ion argón y láser de Mai Tai. </li><li> Seleccione la ficha Escanear. Cambiar el objetivo de 20X/0.8. </li><li> Ajustar la velocidad de escaneo máximo por clic Max. </li><li> Modo de ajuste, método y número de línea, media, y 1. </li><li> Bajo la pestaña anular la selección de los canales están todas las fuentes excepto por el Mai Tai. </li><li> Colocar un medidor de potencia en la trayectoria del haz óptico. </li><li> Seleccione el botón Cont. para activar una exploración continua. </li><li> Ajustar el% de transmisión hasta que el medidor de potencia lee un láser de potencia media de 47 mW. </li><li> Detener la búsqueda, seleccione el botón Detener. </li><li> En la ficha Canales anular la selección del Mai Tai fuente láser y seleccione el ion argón (488 nm). </li><li> Seleccione el botón de xy rápido. En la ficha Canales ajustar el agujero de alfiler, ganancia del detector, un amplificador de compensación, y la ganancia del amplificador para que el láser de iones de argón para lograr la mejor calidad de imagen. </li><li> Utilizando el controlador de la etapa, encontrar y centrarse en la célula para activar. </li><li> Haga clic en el botón Detener. </li><li> Con la herramienta de zoom, zoom en la celda activa hasta que el factor de zoom en la pestaña muestra el modo de 50 a 70. </li><li> Detener la búsqueda, seleccione el botón Detener. </li><li> Bajo la pestaña Canales anular la selección de los iones de argón láser (488 nm) y seleccione el Mai Tai láser. </li><li> En la ficha Modo de ajustar la velocidad de escaneo de 31,46 segundos. </li><li> Seleccione el botón para iniciar el análisis de dos fotones de la activación de jaulas con fluoresceína dextrano de la celda seleccionada. </li><li> Después de la activación, desactive la Mai Tai láser bajo la pestaña Canales y vuelva a seleccionar el láser de iones de argón (488 nm). </li><li> Establecer el factor de zoom en el modo a 1, y haga clic en el botón Max bajo el título de velocidad para ajustar la velocidad más rápida de exploración. </li><li> Seleccione xy rápido para revisar la región fotoactivado. Compruebe que la región no es fotoactivado láser ablación. Para más información sobre la ablación con láser, por favor refiérase a la sección de discusión. </li><li> Repita los pasos anteriores de otros embriones. </li></ol> 4. Inmunodetección de uncaged fluoresceína dextrano (adaptado de la referencia. 16) <ol><li> Después de photoativation, coloque un filtro amarillo transparente frente a la fuente de luz blanca y eliminar manualmente cada embrión de baja fusión de agarosa utilizando pinzas afiladas. Coloque todos los embriones procedentes de una nueva placa de Petri que contiene un fresco X Danieau los medios de comunicación. Cubrir la placa de Petri con papel de aluminio para prevenir la exposición de los embriones a la luz. </li><li> Si es necesario, posterior a los embriones a la etapa deseada de desarrollo. Mientras tanto, prepare una solución de paraformaldehído al 4% (ver Preparación de las soluciones). Alícuota de 1,5 ml de paraformaldehído preparado en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Después de los embriones han llegado a la etapa de desarrollo de interés, una pipeta de los embriones en el tubo de microcentrífuga (desde el paso 4.2). Cubrir el tubo con papel de aluminio para prevenir la exposición a la luz. </li><li> Inclinar la cabeza del tubo de la noche a 4 ° C. Para el día siguiente preparar graduada de etanol (EtOH) soluciones en tampón fosfato salino (PBS) y ddH2O, el 30% EtOH: PBS, el 50% EtOH: PBS, el 70% de EtOH: ddH2O, y el 100% EtOH. </li><li> Al día siguiente, la toma de embriones a partir de 4 ° C. Retire la hoja de metal que cubre el tubo de aspiración y rápidamente el párrafoformaldehye (dejar atrás un pequeño volumen que es suficiente para cubrir los embriones). Pipetear 1,5 ml de 30% EtOH: PBS en el tubo. Vuelva a cubrir el tubo con papel de aluminio. Inclinar la cabeza del tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Repita el paso 4.5 con 50, 70 y 100% calificado soluciones EtOH. Después de que el 100% de EtOH lavar, enjuagar los embriones de nuevo en EtOH al 100% durante 10 minutos. </li><li> Después de los lavados, almacenar los embriones durante la noche a -20 ° C. Para el día siguiente preparar tampón fosfato entre (PBT, ver Preparación de las soluciones), 5 X buffer de bloqueo (ver el protocolo del fabricante para la preparación), el ácido maleico (protocolo de preparación se pueden encontrar en el protocolo de tampón de bloqueo), 10 mg / ml de proteinasa K, y una solución de 10 X anticuerpos (anti-fluoresceína-AP, ver Preparación de las soluciones). </li><li> También hay que preparar un 2% de suero de cordero (LS, ver Preparación de las soluciones) diluido en PBT. Almacenar los anticuerpos a 4 ° C durante la noche temblando en un nutator. El LS 2% pueden mantenerse a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente la toma de embriones a partir de -20 º C. Retire la hoja de metal que cubre el tubo y aspirar rápidamente el 100% EtOH. Añadir 1,5 ml de EtOH al 70%: ddH2O al tubo. Vuelva a cubrir el tubo con papel de aluminio. Inclinar la cabeza del tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Repita el paso 4.8 con 50 y el 30% clasificado soluciones EtOH, y el 100% PBT. Después de que el 100% PBT lavar, enjuagar los embriones 3 veces más en el 100% PBT durante 10 minutos. </li><li> Si los embriones son más de 24 horas, proteinasa K tratarlos. Si no, vaya al paso 4.13. Para ello, diluir el preparado de proteinasa K (paso 4.7) 1:1000 en PBT. Incubar los embriones en proteinasa K durante 10 minutos, o más si los embriones son mayores. Mantener los embriones cubiertos con papel de aluminio para prevenir la exposición a la luz. </li><li> Después de proteinasa K tratamiento, lavado de los embriones de 5 veces en PBT durante 10 minutos. Después de lavar, arreglar los embriones en paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente en un nutator. Después, inmediatamente lave los embriones de 5 veces en PBT durante 10 minutos. Mantener los embriones cubiertos con papel de aluminio para prevenir la exposición a la luz. </li><li> Hacer el amortiguador de bloqueo mediante la dilución de 5 de amortiguación X bloqueo en tampón ácido maleico a 1 X. Retirar los embriones de PBT y colocarlos en un buffer X de bloqueo. Cubrir los embriones con papel de aluminio y titubear a temperatura ambiente durante 5 a 6 horas. </li><li> Después de 5 a 6 horas de descarga bloquear el calor, los embriones a los 65 ° C durante 15 a 20 minutos. </li><li> Obtener la solución de anticuerpos y la LS 2% preparada el día anterior. Centrifugar la solución de anticuerpos a un máximo de rpm. Pasar la fase acuosa en el tubo de LS 2%. Invierta el tubo para mezclar. </li><li> La transferencia de los embriones de tampón de bloqueo a la mezcla de LS-anticuerpo. Mantener los embriones cubiertos con papel de aluminio para prevenir la exposición a la luz. Inclinar la cabeza a los embriones a 4 ° C durante la noche. </li><li> Al día siguiente, lave los embriones a temperatura ambiente 6 veces durante 15 minutos en PBT. Prepare AP buffer (ver Preparación de las soluciones). </li><li> Lavado de los embriones a temperatura ambiente 2 veces durante 10 minutos en un tampón de AP. Prepare NBT / BCIP solución en desarrollo (ver Preparación de las soluciones). </li><li> La transferencia de los embriones de NBT / BCIP. Permitir que la mancha se desarrollan en la oscuridad. </li><li> Detener el desarrollo de los embriones por lavado tres veces en PBT durante 5 minutos cada uno. </li><li> Para la adquisición de la imagen de montaje de los embriones en el 0,6% de agarosa de baja fusión o el 3% de metilcelulosa, y adquirir imágenes utilizando un microscopio compuesto invertida o vertical. </li><li> Fotoactivado muestras pueden ser almacenadas para su posterior análisis (tinción se mantiene estable) por deshidratación en un graduado de lavado EtOH. Siga los pasos 4.4 a 4.7 para la deshidratación de las muestras. </li></ol> 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Fotoactivación de jaulas con fluoresceína dextrano. (A, B) campo claro y fluorescencia de la imagen de un embrión de pez cebra vista lateral en la etapa de 13/14-somite antes de fotoactivación. (C, D) El embrión estaba en la etapa de fotoactivado the13/14-somite en uno de los somitas (flecha) con una longitud de onda de 740 nm, el tiempo de exploración de 31 segundos, y un láser de potencia media de 47 mW. Después de la activación, (d) de fluorescencia de la fluoresceína uncaged-dextrano se observa. Orientación: dorsal (derecha), ventral (izquierda). Barra de escala 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Inmunodetección de jaulas con fluoresceína dextrano. La figura 2 muestra la inmunotinción de uncaged fluoresceína dextrano en un 18/19 embrión de pez cebra HPF. En la etapa 10 somite una pequeña región del embrión se ha activado en el mesodermo de la placa lateral con los parámetros del láser mismo se indica en la Figura 1. Mediante el procedimiento de inmunodetección, la flecha identifica la región activa con la tinción de fondo mínimo. Orientación: dorsal (arriba), ventral (abajo). Barra de escala 100 micras.

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No hay conflictos de interés declarado.

<html> Este artículo describe un método versátil para la asignación de un solo destino celular basado en la fotoactivación de jaulas con fluoresceína dextrano. Uncaging de jaulas con fluoresceína dextrano en las células individuales se logra mediante la absorción de dos fotones de un láser de femtosegundo Mai Tai, junto con el microscopio Zeiss LSM 510 META confocal. Uncaged fluoresceína dextrano en las células fotoactivado es rápidamente visualizado mediante un procedimiento de inmunohistoquímica simple. En este protocolo la longitud de onda de absorción de dos fotones para la fotoactivación de la jaula con fluoresceína dextrano es de 740 nm. Esta longitud de onda se determinó experimentalmente por photoactivating enjaulados fluoresceína dextrano inyecta embriones de tipo salvaje. La longitud de onda de excitación láser se varió desde 600 hasta 800 nm, y la presencia o ausencia de fluoresceína fluorescencia después de la activación se determinó cualitativamente. Encontramos que 740 nm produce la mayor activación de la señal de fluoresceína siguientes. Lo ideal es 740 nm debe trabajar para todos los sistemas modelo, sin embargo, le recomendamos probar una amplia gama de longitudes de onda para determinar el óptimo de dos fotones de longitud de onda de excitación de la muestra. En jaulas con fluoresceína dextrano embriones de tipo salvaje se inyecta, para cada longitud de onda de excitación de dos fotones prueba también varía la potencia del láser promedio. Para una longitud de onda de excitación de 740 nm, un láser de potencia media de 47 mW produce una señal fuerte de fluoresceína en la región activa en comparación con el promedio más bajo poderes láser. Mayores potencias de láser promedio no producen señales más fuertes de fluoresceína, pero la ablación inducida del tejido. Puesto que los pulsos láser de femtosegundos son eficientes en la ablación de los tejidos biológicos 15, se recomienda la determinación de la media del umbral de potencia láser para la fotoactivación que evita la ablación del tejido. Absorción de dos fotones se produce dentro de un volumen pequeño de interacción. Para garantizar la correcta activación del enjaulados fluoresceína dextrano, la célula debe ser llevado a un enfoque correcto. En el protocolo anterior, las células GFP positivas fueron fotografiadas simultáneamente con luz blanca para confirmar el enfoque de la célula. Por lo tanto, la adquisición de la luz blanca, además de otros canales es aconsejable. Después de confirmar el enfoque celular, el protocolo sugiere aumento de la celda activa. Un factor de zoom de 50 a 70 se sugiere, sin embargo, este valor depende del tamaño de la celda seleccionada. Aumentar el zoom aislados de la celda activa de las células adyacentes, y los límites de la zona de exploración de dos fotones de activación. Lo ideal sería que el área de exploración debe cubrir un área grande de la célula. La detección de células activadas solo requiere que la tinción de fondo es mínimo. En el protocolo de inmunodetección por encima de ella es importante que la muestra está bloqueada en tampón de bloqueo durante 5 a 6 horas (paso 4,13). Cuando se desarrolla con NBT / BCIP, uncaged fluoresceína dextrano se hacen visibles en 10 a 20 minutos. Si la tinción de fondo es fuerte, se aconseja un tiempo más largo bloqueo y lavados adicionales para eliminar los anticuerpos (paso 4,17). Las figuras 1 y 2 proporcionan resultados representativos de la foto-y la inmunodetección. En la figura 1, los primeros 1 - 2 de células de tipo salvaje embriones fueron inyectados con la etapa enjaulados fluoresceína dextrano. Los embriones se plantearon a mediados somitogenesis y montado en agarosa de baja fusión en la orientación lateral. Figura 1 (a, b) representar claro y las imágenes fluorescentes del embrión antes de la fotoactivación. La evidencia de que el embrión se mantuvo uncaged se demuestra por la ausencia de fluorescencia de la fluoresceína en la Figura 1 (b). Una pequeña región dentro de un somite se activó con una longitud de onda de 740 nm durante 31 segundos utilizando un láser de potencia media de 47 mW, la Figura 1 (c, flecha). Después de la activación de dos fotones uncaging de fluoresceína-dextrano se produjo, como se muestra por la fluorescencia de la zona activa, la Figura 1 (d, flecha). La activación no fue acompañado por la ablación por láser, como el tejido somitic mantuvo intacta la figura, 1 (c). La figura 2 muestra la inmunodetección de uncaged fluoresceína dextrano. Una pequeña región en el mesodermo de la placa lateral de un embrión en su fase de 10 somitas se fotoactivado utilizando los parámetros del láser que se mencionan en la Figura 1. El embrión fue levantado y procesados ​​utilizando los pasos 4.1 a 4.20. La flecha en la Figura 2 localiza en la región activa, según lo indicado por la acumulación de precipitado de color azul. Sólo la ubicación activa se detecta claramente, sin interferir la tinción de fondo. Preparación de las soluciones: 1 X PBT (1 L) 100 ml 10 x PBS 2 g de BSA 10 ml de 20% de Tween 10 X PBS (1 L) 80 g de NaCl 2 g KCl 6,1 g de Na 2 HPO 4 1,9 g KH 2 PO 4 ddH2O a 1 L pH a 7.3 Paraformaldehído al 4% (160 ml) 32% de paraformaldehído (dos viales de 10 ml) 8 de 20 ml X PBS 132 ml ddH2O jove_content &quot;&gt; AP Buffer (50 ml) 1 ml de 5 M NaCl 2,5 ml de 1 M de MgCl2 5 ml de 1 M Tris pH 9,5 250 l de Tween 20% 41,25 mL ddH2O Solución de anticuerpos (para una muestra) 5,5 l de acetona en polvo 40 l PBT LS 0.8 l 0,1 l anti-fluoresceína anticuerpos AP 2% LS (360 l de una muestra) LS 7.2 l 100% 352,8 l PBT 1 X Danieau los medios de comunicación (1 l) ‡ 11,6 ml de 5 M NaCl 700 l 1 M KCl 400 l 1 M MgSO 4 600 l 1 M de Ca (NO 3) 2 5 ml de 1 M HEPES ddH2O a 1 L pH ajustar a 7,6 ‡ Danieau es una solución de sal ideales para la cría de embriones de pez cebra dechorionated. Otros medios de comunicación se pueden utilizar, siempre que sean isotónicas con la adecuada osmolaridad (~ 300 mOsm para el pez cebra) NBT de valores (1 ml) 50 mg nitro azul tetrazolio 0,7 ml de anhídrido dimetilformamida 0,3 ml ddH2O BCIP de valores (1 ml) 50 mg de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato 1 mL de anhídrido dimetilformamida NBT / BCIP solución de desarrollo 1 ml de buffer AP 4,5 l de archivo NBT 3,5 l de valores BCIP Acetona en polvo <ol><li> Seleccionar 20 peces adultos y congelarlos en nitrógeno líquido. </li><li> Moler el pescado congelado con un mortero hasta obtener un polvo. </li><li> Transferencia de la harina de pescado en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Llenar el tubo cónico con acetona al 100%. El tubo de vórtice. </li><li> Girar el tubo a un máximo de rpm durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar el sedimento otras 3 veces en acetona al 100% y el giro del tubo a un máximo de rpm durante 10 minutos. Por el último lavado el sobrenadante debe ser transparente. </li><li> Añadir 100% de acetona a la bolita de nuevo y dejar el tubo a temperatura ambiente. Las partículas más densas se instalará, mientras que las partículas más finas que permanecen en suspensión. </li><li> Decantar las partículas finas en un nuevo tubo. Alícuota de la solución de polvo en tubos separados y almacenarlos a -20 ° C. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> CMNB-jaula con fluoresceína SE </td><td> Invitrogen </td><td> C20050 </td></tr><tr><td> 10 kDa aminodextrano </td><td> Invitrogen </td><td> D1860 </td></tr><tr><td> Zeba Desalar spin columna </td><td> Atravesar </td><td> 89889 </td></tr><tr><td> Agarosa de bajo de fusión </td><td> Amresco </td><td> 0815-100G </td></tr><tr><td> Borato de sodio </td><td> Amresco </td><td> 1131117-100G </td></tr><tr><td> Tricaína metilsulfonato / MS222 </td><td> Research Organics </td><td> 1347A </td></tr><tr><td> Anti-fluoresceína-AP </td><td> Roche </td><td> 11376622 </td></tr><tr><td> Tampón de bloqueo </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 11 096 176 001 </td></tr><tr><td> Ácido maleico </td><td> Sigma </td><td> MO375-500G </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 15714 </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Sigma </td><td> I8377-250mg </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> Fischer Científico </td><td> PI-34040 </td></tr><tr><td> Microinyector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-2000 </td></tr><tr><td> Labtek cámaras cubreobjetos diapositivas </td><td> Nalge Nunc Internacional </td><td> 155380 </td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Invitrogen </td><td> AM2544 </td></tr><tr><td> Cordero de suero </td><td> Invitrogen </td><td> 16070096 </td></tr><tr><td> LSM 510 META NLO </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> 20X 0,8 NA Aire apocromáticos objetivo </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Filtro amarillo transparente </td><td> Casa del Teatro Inc. </td><td> Roscolux filtro de color hoja: 312 </td></tr></tbody></table>

single cell fate mapping in zebrafish

La capacidad de etiquetar diferencialmente las células individuales tiene implicaciones importantes en la biología del desarrollo. Por ejemplo, la determinación de cómo hematopoyéticas, linajes linfáticos y los vasos sanguíneos surgen en embriones en desarrollo requiere la asignación destino y el linaje de localización de las células precursoras no diferenciadas. Recientemente, las proteínas fotoactivables que incluyen: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, pKindling 8 y KikGR 9, 10 han recibido un gran interés como sondas de rastreo celular. El espectro de fluorescencia de estas proteínas fotosensibles se puede convertir fácilmente con excitación UV, lo que permite a una población de células que se distingue de las adyacentes. Sin embargo, el photoefficiency de la proteína activada puede limitar a largo plazo de células de seguimiento 11. Como una alternativa a las proteínas fotoactivables, enjaulados con fluoresceína dextrano ha sido ampliamente utilizado en sistemas modelo embrión 7, 12-14. Tradicionalmente, para desenjaular fluoresceína dextrano, excitación UV de una casa de la lámpara fluorescente o un láser UV solo fotón se ha utilizado, sin embargo, dichas fuentes límite de la resolución espacial de fotoactivación. Aquí se presenta un protocolo de mapa del destino, traza el linaje, y detectar solo las células marcadas. Las células individuales en embriones inyectados con fluoresceína enjaulado-dextrano se fotoactivado con pulsos láser en el infrarrojo cercano producido a partir de un láser de femtosegundo de titanio zafiro. Este láser es habitual en todos los microscopios confocal de dos fotones, como el microscopio LSM 510 META NLO utilizado en este trabajo. Dado que el tejido biológico es transparente a la radiación en el infrarrojo cercano, 15 de los pulsos del láser puede ser enfocado en lo profundo de las células del embrión sin uncaging por encima o por debajo del plano focal seleccionada. Por lo tanto, no lineal, la absorción de dos fotones es inducido sólo en el centro geométrico de desenjaular fluoresceína dextrano en una sola célula. Para detectar la celda que contiene uncaged fluoresceína dextrano, se describe un protocolo de inmunohistoquímica sencilla de 16 a visualizar rápidamente la celda activa. El protocolo de activación y detección presentados en este trabajo es versátil y puede aplicarse a cualquier modelo de sistema. Nota: Los reactivos utilizados en este protocolo se pueden encontrar en la tabla adjunta al final del artículo.

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Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K vistas.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Video: Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Investigación

Biología

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Un enfoque práctico de elaboración de mapas genéticos inducible destino: una guía visual para marcar y rastrear las células En Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Generación de Dispersed presomitic mesodermo Cultivos Celulares for Imaging del pez cebra Segmentación del Reloj en células individuales

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...