We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Tejido disección y fijación (60 min) <ol><li> Para el cerebro de Drosophila, coloque larvas 3º en una gota de 1x PBS (tampón fosfato salino). Elija gran 3º estadio las larvas que se arrastraba activamente de los viales o botellas que no son de hacinamiento. <ol><li> Utilice uno ultrafino par de pinzas para agarrar los ganchos de la boca y otro par de pinzas para agarrar 2/3 abajo de la longitud del cuerpo (Figura 1 A, B). Tire suavemente de los ganchos de la boca para exponer el cerebro, los ganglios ventral, las glándulas salivales y parte del tracto digestivo de las larvas. Utilice las pinzas para separar el cerebro y ganglios ventral (Figura 1 A, B) de los otros tejidos y colocarlos en una gota de 1x PBT (tampón fosfato salino con Tween) en una placa de Petri de plástico. </li></ol></li><li> Para disecciones testículo Nasonia, elegir varones pupas de 3 días de edad (cuerpos de color amarillo con los ojos rojos). Hombre Nasonia tiene pequeñas longitudes pad ala relativos a females durante la fase de pupa (Figura 1C). <ol><li> Sostenga la pupa en la parte superior del abdomen, cerca de la región torácica con un par de pinzas, y usando el otro par de pinzas, agarra la punta muy distal del abdomen y extraiga los testículos en forma de lágrima, (que estarán rodeados de grasa cuerpo que puede ser sacudido suavemente; Figura 1D). Separe las piezas exteriores de la carrocería de los testículos, lo que evitará aplastamiento adecuado, y el lugar en una gota de 1x PBT en una placa de Petri de plástico. </li></ol></li><li> Para cada diapositiva, diseccionar un total de cuatro o cinco muestras de tejido (es decir., Drosophila cerebros larvas o testículos Nasonia). NOTA: Más de cinco muestras dará lugar a núcleos de hacinamiento y cromosomas. </li><li> Opcionalmente, para lograr algo de separación de las cromátidas hermanas en euchromatic regiones de los cromosomas mitóticos, tratar el tejido con una solución hipotónica: transferir los cerebros de 1x PBT a una caída del 0,5% de citrato de sodio durante 5 a 10 (no más de 10) min. NOTA: La colchicina (un inhibidor mitótico) puede ser útil para aumentar el número de figuras mitóticas en metafase 11. Sin embargo, su uso no es necesario si se utilizan larvas sanas muy grande, e incluso deseable, ya que puede afectar negativamente a la resolución de cromosomas, la difusión y la morfología. </li><li> Coloque una gota (~ 20 l) de solución de fijación (2,5% de paraformaldehído en ácido acético 45%) sobre la superficie de un cubreobjetos tratados con Sigmacote limpio. NOTA: Asegúrese de solución fijadora nueva para cada día de uso. Soluciones para la adherencia que van desde 1,8 hasta 3,7% de paraformaldehído en ácido acético 45% producen los mejores resultados para los peces. El uso de tejidos distintos de cerebros o los testículos, o la adaptación de este protocolo para la inmuno-FISH puede requerir la experimentación con diferentes fijadores (para una lista de diferentes fijadores, ver 12). </li><li> Transferir cuidadosamente cada muestra de tejido del tampón de disección (1x PBT) en la gota de fijador con pinzas ultrafinas, minimizing la transferencia de la disección de búfer en la solución fijadora. Colocar las muestras de tejido para que se espacian uniformemente el uno del otro dentro de la gotita fijador. Incubar los tejidos en fijador durante 4 min a temperatura ambiente. </li><li> Con cuidado, coloque una cara diapositiva poli-lisina abajo sobre el tejido y la cubierta deslizante. No presione hacia abajo en este punto, sino que permiten que los dos para contactar ligeramente de modo que la hoja de la cubierta se pega en la parte inferior de la diapositiva. Invierta la diapositiva para que la hoja de la cubierta está en la cima. </li><li> Sandwich del deslizamiento diapositiva / tejido / cubierta dentro de un pedazo de papel doblado filtro. Sobre una superficie estable, con el pulgar, presione firmemente hacia abajo en la posición directamente por encima de la hoja de la cubierta. Tenga cuidado para evitar deslizamiento lateral de la hoja de la cubierta (esto hará que se corra del tejido). </li><li> Sumerja el portaobjetos / tejido / hoja de cubierta en nitrógeno líquido (véase aparato de la figura 1E, F), y deje reposar hasta que el nitrógeno se detiene en ebullición (ya es fine). Retire el portaobjetos y coloque inmediatamente la hoja de la cubierta con una hoja de afeitar nueva accionando una esquina de la hoja de la cubierta en una dirección ascendente (no rayar el tejido fijado con la hoja de afeitar). <ol><li> Pre-enfriamiento de la diapositiva / tejido / hoja de la cubierta en un bloque de hielo seco, la tapa arriba, durante 1-2 minutos antes de la inmersión en nitrógeno líquido ayudará a evitar que las diapositivas se agriete. </li></ol></li><li> Colocar inmediatamente el portaobjetos con el tejido en una jarra Coplin llena de etanol al 100% a temperatura ambiente y dejar reposar durante al menos 5 min (este tiempo puede ser más largo si es necesario). NOTA: etanol 100% frío también podría ser utilizado. </li><li> Retire la diapositiva con el tejido, absorber y expulsar el exceso de etanol con una Kimwipe (sin tocar el tejido fijado), y dejar el portaobjetos se seque al aire durante 1 hora. <ol><li> Vaya directamente al paso 2 o mantener diapositivas secas en el aire de baja humedad o en una cámara de desecación durante semanas a meses, incluso antes de realizar la hibridación. </li></ol></li></ol> Figura 1: (A) Un estadio Drosophila larva 3 rd (derecha), con posiciones indicadas para dónde agarrar los ganchos de la boca (indicado con *) y 2/3 del camino hacia abajo las larvas para diseccionar los cerebros; (Izquierda) un esquema de una larva una la misma etapa de desarrollo, que representa la posición relativa del cerebro dentro de la cabeza de las larvas. (B) El cerebro y los ganglios disecados ventral de una larva de Drosophila 3 rd instar (derecha) y un esquema de este tejido (izquierda). (C) 3 días de edad, pupa Nasonia en la etapa de ojo rojo cuerpo amarillo. (D) Un par testículos disecados de un viejo macho pupa Nasonia 3 día (derecha) con posiciones que indica por dónde agarrar la pupa en la parte posterior del abdomen (indicado con *) ya mitad de camino en el cuerpo; (Izquierda) esquemática macho y hembra fue depictingp pupas; pupas macho puede ser distinguido por las alas que no se extienden más allá del perfil sagital (flecha negro), en contraste con las hembras, que tienen alas que se extienden más allá del perfil; la posición relativa del par de testículo se muestra en la pupa masculina. (E) El aparato de una cadena de clips-y método (F) utilizados para sumergir diapositivas en un recipiente de nitrógeno líquido. Cuerdas paperclip múltiples pueden ser utilizados para la inmersión simultánea de múltiples diapositivas. 2. Hibridación in situ (30 min el día 1; 1 hora-2.5 horas durante largos sondas en el día 2) <ol><li> Añadir 1 l (100 ng) de cada sonda a 20 l de tampón de hibridación 1.1x. Sonda de pipeta / tampón de hibridación sobre la superficie del tejido fijo (evite tocar el tejido). </li><li> Con cuidado, coloque una hoja de cubierta directamente sobre el tampón de sonda / hibridación, asegurándose de que la hoja de la cubierta se centra directamente sobre el tejido. El tampón debe migrar a the borde exterior de la hoja de la cubierta, sin dejar burbujas de aire. NOTA: Las pequeñas burbujas que no entran en contacto con el tejido no plantean problemas para el procedimiento. Quite las burbujas grandes levantando cuidadosamente una esquina de la hoja de la cubierta y cuidadosamente caer de nuevo en la diapositiva. </li><li> Coloque el deslizamiento de diapositivas / tejido / cubierta en la superficie de un bloque pre-calentado a 95 ° C (tapa arriba). Cubra con una hoja grande de papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Deje que la diapositiva se incuba a 95 ° C durante 5 min. NOTA: un bloque de calor típico con agujeros para los tubos puede dar la vuelta para proporcionar una superficie plana sobre la que colocar la corredera / tejido / cubreobjetos. </li><li> Retire la tapa, dejar que se enfríe un poco hasta que esté caliente al tacto. Envuelva cuidadosamente un trozo de Parafilm extendía alrededor de la hoja de la cubierta para sellar el líquido debajo de ella. </li><li> Colocar el portaobjetos sellado dentro de una cámara de humedad y colocar la cámara en un incubador precalentado a 30 ° C. Se incuba a 30 ° C durante 4 horas a la noche.<ol><li> Crear una cámara de humedad a partir de una caja de propina vacía o contenedor Tupperware con tapa con Kimwipes humedecidas o toallas de papel colocadas en la parte inferior. NOTA: oligo sondas ADN de cadena sencilla se han diseñado para ser 28 a 33 bases para alcanzar una temperatura de fusión teórica (Tm) de 45 a 47 ° C. Estos rangos m de longitud y T reflejan el hecho de que muchas secuencias repetitivas que hemos estudiado son ricas en AT y por lo tanto tienen muy bajo contenido de GC. Sondas más largas probablemente tendrán valores de M T más altas; esto puede resultar en una mayor hibridación de fondo en la temperatura de hibridación estándar de 30 ° C. Por lo tanto, puede ser necesaria alguna solución de problemas con temperaturas de hibridación para lograr los mejores resultados. Para encontrar la mejor temperatura de hibridación, el aumento (o disminución) de la temperatura de 5 ° C, de forma incremental. </li></ol></li><li> Retire con cuidado el Parafilm de la diapositiva y luego retire con cuidado la hoja de la cubierta lentamente levantando una esquina. Washingtonsh el portaobjetos tres veces durante 15 minutos cada lavado en tampón SSC 0,1x. Tapar el frasco Coplin con papel de aluminio durante los lavados para minimizar la exposición de la luz. </li><li> Si no se utiliza una sonda biotinilada largo, continúe con el paso 2.8. <ol><li> Si se utiliza una sonda larga biotina, seque el área alrededor del tejido con un Kimwipe, teniendo cuidado de no tocar el propio tejido. Coloque 100 l de solución de bloqueo sobre el tejido y cubrir suavemente con un cubreobjetos, teniendo cuidado de evitar burbujas de captura. Envolver el portaobjetos sobre el cubreobjetos con Parafilm y lugar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos y borra todo el tejido con una Kimwipe. Pipetear 100 l de avidina-rodamina diluido 1: 1000 en SBT atención sobre el tejido y cubrir ligeramente con un cubreobjetos, tomando para evitar que queden atrapadas burbujas. Envolver el portaobjetos sobre el cubreobjetos con Parafilm y lugar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos y lavar la diapositiva 3 veces durante 5 minutos en cada una de 4x SSCT y después3 veces durante 5 minutos cada uno en SSC 0,1x. NOTA: Las diapositivas se puede lavar por períodos más largos de tiempo. </li></ol></li><li> Retire la corredera y borrar todo el tejido con una Kimwipe seco para eliminar el exceso de tampón (evite tocar el tejido). Coloque el lado del tejido de diapositivas en un lugar oscuro durante 10-15 minutos o hasta que la humedad se disipa por completo. </li><li> Pipetear 11 l de medio de montaje Vectashield (con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol-DAPI) sobre el tejido. Con cuidado, coloque un cubreobjetos limpio (no tratados con Sigmacote) directamente sobre el centro del medio de montaje y el tejido. El medio de montaje debe migrar lentamente hacia fuera, hacia los bordes de la hoja de la cubierta. NOTA: Si el medio de montaje no logra alcanzar el borde de la hoja de la cubierta en todos los lados, entonces un 2.1 l adicional de medio de montaje se puede aplicar a una posición en el borde de la hoja de la cubierta para rellenar el volumen necesario. En este caso, asegúrese de limpiar cualquier exceso de medio de la superficie de deslizamiento antesde sellado. </li><li> Selle los bordes de la hoja de la cubierta con esmalte de uñas. Evite pintar el esmalte de uñas sobre la muestra de tejido. </li><li> Colocar el portaobjetos en posición vertical en un lugar oscuro y dejar que el clavo seco polaco hasta que esté completamente duro (normalmente 30 minutos o más). En este punto, la imagen del tejido o almacenar a -20 ° C durante un máximo de 1 semana para imagen más tarde. </li></ol> Buffer / Solución Recetas 10x PBS <ul><li> 80 g de NaCl </li><li> 2,0 g KCl </li><li> 14,4 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g KH 2 PO 4 </li><li> pH a 7,4, H 2 O para 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml PBS 10x </li><li> 45 ml de H2O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g NaCl </li><li> 88,2 g de Citrato de Na </li><li> en 800 ml de H2O </li><li> pH a 7, H 2 O para 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml de 20x SSC </li><li> 799 ml de H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 0,1x SSC <ul><li> 5 ml de 20x SSC </li><li> 995 ml de H2O </li></ul> Mezcla de hibridación (20 l; modificado a partir de 11) <ul><li> 10 l de formamida </li><li> 4 l 50% de sulfato de dextrano </li><li> 2 l de 20x SSC </li><li> 4 l H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml de 20x SSC </li><li> 0,01 g Albúmina de suero bovino (BSA) </li><li> 10 l de Tween 20 </li><li> 7,9 ml de H2O </li></ul> Solución de bloqueo 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g BSA </li><li> 10 l de Tween 20 </li><li> 2 ml de 20x SSC </li><li> 8 ml de H2O </li></ul> Solución de fijación con paraformaldehído (1 ml) <ul><li> 393,75 l H2O (agregar agua primero) </li><li> 450 ácido acético glacial l </li><li> 156,25 l 16% de paraformaldehído </li></ul>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

ADN ISH se utiliza con frecuencia para mapear secuencias específicas a los cromosomas. Hemos descrito un método sencillo para el ADN ISH optimizado para alto número de copias, heterochromatic secuencias. En lugar de usar lavados en una solución de formamida, que es un requisito en otros protocolos de ISH de ADN existentes, ponemos diapositivas montado de tejidos directamente en un bloque de pre-calentada para desnaturalizar el ADN. Este método evita el uso de grandes cantidades de formamida. Un paso fundamental par...

ADN hibridación in situ (ISH ADN) es un método comúnmente utilizado para las secuencias de mapeo a regiones específicas de cromosomas. Las sondas a las regiones de copia única dentro de la eucromatina se pueden generar a través de un puñado de enfoques, incluyendo nick-traducción o extremo etiquetado de los productos de ADN largas de 1,2 y la incorporación de deoxygenin (DIG) nucleótidos, adscritos y su reconocimiento a través de una amplia variedad de anticuerpos de grupo-conjugado 1-3. La visualización de secuencias euchromatic en pocos o un solo número de copias requiere el uso de cualquiera de las sondas individuales, grandes con alta actividad específica o un cóctel de múltiples sondas, más pequeñas que mejoran colectivamente señal. En contraste, las secuencias altamente repetitivas que se encuentran en la heterocromatina, como ADN satélite, son blancos más fáciles para el ADN ISH porque normalmente existen como decenas de miles de repeticiones agrupadas en regiones cromosómicas individuales conocidos como bloques. Los elementos transponibles pueden ser tambiénque se encuentra en alto número de copias en distintos loci cromosómicos 2. En estos casos, las sondas individuales con baja actividad específica pueden etiquetar con eficacia heterochromatic secuencias debido a su hibridación en múltiples sitios. Las sondas a secuencias repetitivas pueden sintetizarse oligonucleótidos comercialmente como cortas (30-50 pb) y químicamente conjugados con cualquiera de los múltiples grupos fluorescentes diferentes. Mapeo secuencias repetitivas dentro de heterocromatina utilizando tecnologías de secuenciación del genoma es difícil debido a los problemas encontrados en los andamios de construcción dentro de los bloques de satélite altamente repetitivas 4-6,7. Actualmente, ISH se erige como la forma más efectiva de cartografía de estas secuencias a nivel sub-cromosoma. Esta estrategia es importante para el mapeo de un gran número de secuencias repetitivas que están siendo descubiertas por los estudios de secuenciación del genoma y transcriptoma en curso. La eficiencia y la facilidad de mapeo secuencias repetitivas en los cromosomas de diapositivas montadas serían greatly mejorada por un protocolo simplificado para el ADN ISH. Por ejemplo, los protocolos existentes para el ADN ISH implican múltiples lavados de tejidos hibridados en solución de formamida 2,8, añadiendo así sustancialmente el tiempo requerido para las secuencias de cartografía y también la producción de grandes cantidades de residuos químicos para este reactivo costoso. Aquí se describe un método de ADN ISH revisado que evita la necesidad de lavados de formamida y utiliza equipos y reactivos de laboratorio básico. Este método fue diseñado originalmente para la rápida detección de las secuencias de ADN altamente repetitivas en las regiones heterocromáticas de neuroblastos de larvas de Drosophila mediante el uso de oligos sintetizados comercialmente que se conjugan con los tintes de fluorescencia. Sin embargo, este método también funciona para el mapeo de secuencias repetitivas mediante el uso de sondas más grandes sintetizados a través de otros medios de 9,10 y a través de múltiples diferentes tipos de tejidos y de cromosomas. Además, este método se puede utilizar para mapear secuencias euchromatic mediante el uso de más largo o multíparale, sondas cortas dentro de la secuencia euchromatic de interés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:285px;"></td>
			<td style="width:257px;">Company</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Materials&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ultrafine tweezers (5 gauge)</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sigmacote</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Filter paper (75-150mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin wax paper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat block with thermometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dry incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Razor blades</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coplin jars (with slide grooves)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aluminum foil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nail polish (clear or colored)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-20 &#956;L micropipette and plastic tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">20-25 standard metal paperclips linked to form a chain</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td>Company/Notes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">16% EM grade paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">100% Ethanol, chemical grade</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)</td>
			<td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)</td>
			<td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hybridization buffer</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">0.1X SSC (Saline-sodium citrate)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Blocking solution</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

ADN hibridación in situ (ISH ADN) es un método comúnmente utilizado para las secuencias de mapeo a regiones específicas de cromosomas. Este enfoque es particularmente eficaz en la cartografía de secuencias altamente repetitivas a heterochromatic regiones, donde los enfoques computacionales enfrentan desafíos prohibitivos. Aquí se describe un protocolo simplificado para ADN ISH que elude lavados de formamida que son medidas estándar en otros protocolos de ADN ISH. El protocolo se ha optimizado para la hibridación con sondas de ADN monocatenario cortos que llevan colorantes fluorescentes, que marcan efectivamente secuencias repetitivas de ADN dentro de las regiones cromosómicas heterocromatínicas a través de un número de diferentes tipos de tejidos de insectos. Sin embargo, las solicitudes podrán hacerse extensivas a utilizar con sondas de mayor tamaño y la visualización de las secuencias de ADN de copia única (no repetitiva). Demostramos este método mediante la asignación de varios diferentes secuencias repetitivas a los cromosomas de Drosophila melanogaster aplastadas células neuronales y Nasoniavitripennis espermatocitos. Mostramos los patrones de hibridación de ambas sondas pequeñas, sintetizados en el mercado y para una sonda grande para la comparación. Este procedimiento utiliza insumos de laboratorio sencillas y reactivos, y es ideal para los investigadores que tienen poca experiencia con la realización de ADN ISH.

Para demostrar este método, hibridizada un conjunto de pequeñas oligos sintetizados comercialmente que se han modificado químicamente con conjugados fluorescentes (Figura 2) y una sonda biotinilada más larga (realizada a través de traducción nick de un producto de PCR; Figura 2B), a los cromosomas de varios tejidos diferentes tipos (ver Tabla 1). Las secuencias diana incluyen repeticiones satélite ubicadas en pericentromeric regiones (heterocromáticas) de los cr...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

17.9K vistas.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Un método simple para determinar el genotipo exacto

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Investigación

Biología

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

Un alto rendimiento In situ Método de hibridación para caracterizar los patrones de expresión de ARNm en el ratón Fetal del tracto urogenital inferior

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

De alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

ADN-ARN combinado fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridación para el molusco gasterópodo<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...