Name: simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
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We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Tejido disección y fijación (60 min) <ol><li> Para el cerebro de Drosophila, coloque larvas 3º en una gota de 1x PBS (tampón fosfato salino). Elija gran 3º estadio las larvas que se arrastraba activamente de los viales o botellas que no son de hacinamiento. <ol><li> Utilice uno ultrafino par de pinzas para agarrar los ganchos de la boca y otro par de pinzas para agarrar 2/3 abajo de la longitud del cuerpo (Figura 1 A, B). Tire suavemente de los ganchos de la boca para exponer el cerebro, los ganglios ventral, las glándulas salivales y parte del tracto digestivo de las larvas. Utilice las pinzas para separar el cerebro y ganglios ventral (Figura 1 A, B) de los otros tejidos y colocarlos en una gota de 1x PBT (tampón fosfato salino con Tween) en una placa de Petri de plástico. </li></ol></li><li> Para disecciones testículo Nasonia, elegir varones pupas de 3 días de edad (cuerpos de color amarillo con los ojos rojos). Hombre Nasonia tiene pequeñas longitudes pad ala relativos a females durante la fase de pupa (Figura 1C). <ol><li> Sostenga la pupa en la parte superior del abdomen, cerca de la región torácica con un par de pinzas, y usando el otro par de pinzas, agarra la punta muy distal del abdomen y extraiga los testículos en forma de lágrima, (que estarán rodeados de grasa cuerpo que puede ser sacudido suavemente; Figura 1D). Separe las piezas exteriores de la carrocería de los testículos, lo que evitará aplastamiento adecuado, y el lugar en una gota de 1x PBT en una placa de Petri de plástico. </li></ol></li><li> Para cada diapositiva, diseccionar un total de cuatro o cinco muestras de tejido (es decir., Drosophila cerebros larvas o testículos Nasonia). NOTA: Más de cinco muestras dará lugar a núcleos de hacinamiento y cromosomas. </li><li> Opcionalmente, para lograr algo de separación de las cromátidas hermanas en euchromatic regiones de los cromosomas mitóticos, tratar el tejido con una solución hipotónica: transferir los cerebros de 1x PBT a una caída del 0,5% de citrato de sodio durante 5 a 10 (no más de 10) min. NOTA: La colchicina (un inhibidor mitótico) puede ser útil para aumentar el número de figuras mitóticas en metafase 11. Sin embargo, su uso no es necesario si se utilizan larvas sanas muy grande, e incluso deseable, ya que puede afectar negativamente a la resolución de cromosomas, la difusión y la morfología. </li><li> Coloque una gota (~ 20 l) de solución de fijación (2,5% de paraformaldehído en ácido acético 45%) sobre la superficie de un cubreobjetos tratados con Sigmacote limpio. NOTA: Asegúrese de solución fijadora nueva para cada día de uso. Soluciones para la adherencia que van desde 1,8 hasta 3,7% de paraformaldehído en ácido acético 45% producen los mejores resultados para los peces. El uso de tejidos distintos de cerebros o los testículos, o la adaptación de este protocolo para la inmuno-FISH puede requerir la experimentación con diferentes fijadores (para una lista de diferentes fijadores, ver 12). </li><li> Transferir cuidadosamente cada muestra de tejido del tampón de disección (1x PBT) en la gota de fijador con pinzas ultrafinas, minimizing la transferencia de la disección de búfer en la solución fijadora. Colocar las muestras de tejido para que se espacian uniformemente el uno del otro dentro de la gotita fijador. Incubar los tejidos en fijador durante 4 min a temperatura ambiente. </li><li> Con cuidado, coloque una cara diapositiva poli-lisina abajo sobre el tejido y la cubierta deslizante. No presione hacia abajo en este punto, sino que permiten que los dos para contactar ligeramente de modo que la hoja de la cubierta se pega en la parte inferior de la diapositiva. Invierta la diapositiva para que la hoja de la cubierta está en la cima. </li><li> Sandwich del deslizamiento diapositiva / tejido / cubierta dentro de un pedazo de papel doblado filtro. Sobre una superficie estable, con el pulgar, presione firmemente hacia abajo en la posición directamente por encima de la hoja de la cubierta. Tenga cuidado para evitar deslizamiento lateral de la hoja de la cubierta (esto hará que se corra del tejido). </li><li> Sumerja el portaobjetos / tejido / hoja de cubierta en nitrógeno líquido (véase aparato de la figura 1E, F), y deje reposar hasta que el nitrógeno se detiene en ebullición (ya es fine). Retire el portaobjetos y coloque inmediatamente la hoja de la cubierta con una hoja de afeitar nueva accionando una esquina de la hoja de la cubierta en una dirección ascendente (no rayar el tejido fijado con la hoja de afeitar). <ol><li> Pre-enfriamiento de la diapositiva / tejido / hoja de la cubierta en un bloque de hielo seco, la tapa arriba, durante 1-2 minutos antes de la inmersión en nitrógeno líquido ayudará a evitar que las diapositivas se agriete. </li></ol></li><li> Colocar inmediatamente el portaobjetos con el tejido en una jarra Coplin llena de etanol al 100% a temperatura ambiente y dejar reposar durante al menos 5 min (este tiempo puede ser más largo si es necesario). NOTA: etanol 100% frío también podría ser utilizado. </li><li> Retire la diapositiva con el tejido, absorber y expulsar el exceso de etanol con una Kimwipe (sin tocar el tejido fijado), y dejar el portaobjetos se seque al aire durante 1 hora. <ol><li> Vaya directamente al paso 2 o mantener diapositivas secas en el aire de baja humedad o en una cámara de desecación durante semanas a meses, incluso antes de realizar la hibridación. </li></ol></li></ol> Figura 1: (A) Un estadio Drosophila larva 3 rd (derecha), con posiciones indicadas para dónde agarrar los ganchos de la boca (indicado con *) y 2/3 del camino hacia abajo las larvas para diseccionar los cerebros; (Izquierda) un esquema de una larva una la misma etapa de desarrollo, que representa la posición relativa del cerebro dentro de la cabeza de las larvas. (B) El cerebro y los ganglios disecados ventral de una larva de Drosophila 3 rd instar (derecha) y un esquema de este tejido (izquierda). (C) 3 días de edad, pupa Nasonia en la etapa de ojo rojo cuerpo amarillo. (D) Un par testículos disecados de un viejo macho pupa Nasonia 3 día (derecha) con posiciones que indica por dónde agarrar la pupa en la parte posterior del abdomen (indicado con *) ya mitad de camino en el cuerpo; (Izquierda) esquemática macho y hembra fue depictingp pupas; pupas macho puede ser distinguido por las alas que no se extienden más allá del perfil sagital (flecha negro), en contraste con las hembras, que tienen alas que se extienden más allá del perfil; la posición relativa del par de testículo se muestra en la pupa masculina. (E) El aparato de una cadena de clips-y método (F) utilizados para sumergir diapositivas en un recipiente de nitrógeno líquido. Cuerdas paperclip múltiples pueden ser utilizados para la inmersión simultánea de múltiples diapositivas. 2. Hibridación in situ (30 min el día 1; 1 hora-2.5 horas durante largos sondas en el día 2) <ol><li> Añadir 1 l (100 ng) de cada sonda a 20 l de tampón de hibridación 1.1x. Sonda de pipeta / tampón de hibridación sobre la superficie del tejido fijo (evite tocar el tejido). </li><li> Con cuidado, coloque una hoja de cubierta directamente sobre el tampón de sonda / hibridación, asegurándose de que la hoja de la cubierta se centra directamente sobre el tejido. El tampón debe migrar a the borde exterior de la hoja de la cubierta, sin dejar burbujas de aire. NOTA: Las pequeñas burbujas que no entran en contacto con el tejido no plantean problemas para el procedimiento. Quite las burbujas grandes levantando cuidadosamente una esquina de la hoja de la cubierta y cuidadosamente caer de nuevo en la diapositiva. </li><li> Coloque el deslizamiento de diapositivas / tejido / cubierta en la superficie de un bloque pre-calentado a 95 ° C (tapa arriba). Cubra con una hoja grande de papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Deje que la diapositiva se incuba a 95 ° C durante 5 min. NOTA: un bloque de calor típico con agujeros para los tubos puede dar la vuelta para proporcionar una superficie plana sobre la que colocar la corredera / tejido / cubreobjetos. </li><li> Retire la tapa, dejar que se enfríe un poco hasta que esté caliente al tacto. Envuelva cuidadosamente un trozo de Parafilm extendía alrededor de la hoja de la cubierta para sellar el líquido debajo de ella. </li><li> Colocar el portaobjetos sellado dentro de una cámara de humedad y colocar la cámara en un incubador precalentado a 30 ° C. Se incuba a 30 ° C durante 4 horas a la noche.<ol><li> Crear una cámara de humedad a partir de una caja de propina vacía o contenedor Tupperware con tapa con Kimwipes humedecidas o toallas de papel colocadas en la parte inferior. NOTA: oligo sondas ADN de cadena sencilla se han diseñado para ser 28 a 33 bases para alcanzar una temperatura de fusión teórica (Tm) de 45 a 47 ° C. Estos rangos m de longitud y T reflejan el hecho de que muchas secuencias repetitivas que hemos estudiado son ricas en AT y por lo tanto tienen muy bajo contenido de GC. Sondas más largas probablemente tendrán valores de M T más altas; esto puede resultar en una mayor hibridación de fondo en la temperatura de hibridación estándar de 30 ° C. Por lo tanto, puede ser necesaria alguna solución de problemas con temperaturas de hibridación para lograr los mejores resultados. Para encontrar la mejor temperatura de hibridación, el aumento (o disminución) de la temperatura de 5 ° C, de forma incremental. </li></ol></li><li> Retire con cuidado el Parafilm de la diapositiva y luego retire con cuidado la hoja de la cubierta lentamente levantando una esquina. Washingtonsh el portaobjetos tres veces durante 15 minutos cada lavado en tampón SSC 0,1x. Tapar el frasco Coplin con papel de aluminio durante los lavados para minimizar la exposición de la luz. </li><li> Si no se utiliza una sonda biotinilada largo, continúe con el paso 2.8. <ol><li> Si se utiliza una sonda larga biotina, seque el área alrededor del tejido con un Kimwipe, teniendo cuidado de no tocar el propio tejido. Coloque 100 l de solución de bloqueo sobre el tejido y cubrir suavemente con un cubreobjetos, teniendo cuidado de evitar burbujas de captura. Envolver el portaobjetos sobre el cubreobjetos con Parafilm y lugar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos y borra todo el tejido con una Kimwipe. Pipetear 100 l de avidina-rodamina diluido 1: 1000 en SBT atención sobre el tejido y cubrir ligeramente con un cubreobjetos, tomando para evitar que queden atrapadas burbujas. Envolver el portaobjetos sobre el cubreobjetos con Parafilm y lugar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos y lavar la diapositiva 3 veces durante 5 minutos en cada una de 4x SSCT y después3 veces durante 5 minutos cada uno en SSC 0,1x. NOTA: Las diapositivas se puede lavar por períodos más largos de tiempo. </li></ol></li><li> Retire la corredera y borrar todo el tejido con una Kimwipe seco para eliminar el exceso de tampón (evite tocar el tejido). Coloque el lado del tejido de diapositivas en un lugar oscuro durante 10-15 minutos o hasta que la humedad se disipa por completo. </li><li> Pipetear 11 l de medio de montaje Vectashield (con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol-DAPI) sobre el tejido. Con cuidado, coloque un cubreobjetos limpio (no tratados con Sigmacote) directamente sobre el centro del medio de montaje y el tejido. El medio de montaje debe migrar lentamente hacia fuera, hacia los bordes de la hoja de la cubierta. NOTA: Si el medio de montaje no logra alcanzar el borde de la hoja de la cubierta en todos los lados, entonces un 2.1 l adicional de medio de montaje se puede aplicar a una posición en el borde de la hoja de la cubierta para rellenar el volumen necesario. En este caso, asegúrese de limpiar cualquier exceso de medio de la superficie de deslizamiento antesde sellado. </li><li> Selle los bordes de la hoja de la cubierta con esmalte de uñas. Evite pintar el esmalte de uñas sobre la muestra de tejido. </li><li> Colocar el portaobjetos en posición vertical en un lugar oscuro y dejar que el clavo seco polaco hasta que esté completamente duro (normalmente 30 minutos o más). En este punto, la imagen del tejido o almacenar a -20 ° C durante un máximo de 1 semana para imagen más tarde. </li></ol> Buffer / Solución Recetas 10x PBS <ul><li> 80 g de NaCl </li><li> 2,0 g KCl </li><li> 14,4 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g KH 2 PO 4 </li><li> pH a 7,4, H 2 O para 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml PBS 10x </li><li> 45 ml de H2O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g NaCl </li><li> 88,2 g de Citrato de Na </li><li> en 800 ml de H2O </li><li> pH a 7, H 2 O para 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml de 20x SSC </li><li> 799 ml de H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 0,1x SSC <ul><li> 5 ml de 20x SSC </li><li> 995 ml de H2O </li></ul> Mezcla de hibridación (20 l; modificado a partir de 11) <ul><li> 10 l de formamida </li><li> 4 l 50% de sulfato de dextrano </li><li> 2 l de 20x SSC </li><li> 4 l H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml de 20x SSC </li><li> 0,01 g Albúmina de suero bovino (BSA) </li><li> 10 l de Tween 20 </li><li> 7,9 ml de H2O </li></ul> Solución de bloqueo 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g BSA </li><li> 10 l de Tween 20 </li><li> 2 ml de 20x SSC </li><li> 8 ml de H2O </li></ul> Solución de fijación con paraformaldehído (1 ml) <ul><li> 393,75 l H2O (agregar agua primero) </li><li> 450 ácido acético glacial l </li><li> 156,25 l 16% de paraformaldehído </li></ul>

<ol>
	<li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li><li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila.">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li><li>Pardue, M. 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The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

ADN ISH se utiliza con frecuencia para mapear secuencias específicas a los cromosomas. Hemos descrito un método sencillo para el ADN ISH optimizado para alto número de copias, heterochromatic secuencias. En lugar de usar lavados en una solución de formamida, que es un requisito en otros protocolos de ISH de ADN existentes, ponemos diapositivas montado de tejidos directamente en un bloque de pre-calentada para desnaturalizar el ADN. Este método evita el uso de grandes cantidades de formamida. Un paso fundamental par...

ADN hibridación in situ (ISH ADN) es un método comúnmente utilizado para las secuencias de mapeo a regiones específicas de cromosomas. Las sondas a las regiones de copia única dentro de la eucromatina se pueden generar a través de un puñado de enfoques, incluyendo nick-traducción o extremo etiquetado de los productos de ADN largas de 1,2 y la incorporación de deoxygenin (DIG) nucleótidos, adscritos y su reconocimiento a través de una amplia variedad de anticuerpos de grupo-conjugado 1-3. La visualización de secuencias euchromatic en pocos o un solo número de copias requiere el uso de cualquiera de las sondas individuales, grandes con alta actividad específica o un cóctel de múltiples sondas, más pequeñas que mejoran colectivamente señal. En contraste, las secuencias altamente repetitivas que se encuentran en la heterocromatina, como ADN satélite, son blancos más fáciles para el ADN ISH porque normalmente existen como decenas de miles de repeticiones agrupadas en regiones cromosómicas individuales conocidos como bloques. Los elementos transponibles pueden ser tambiénque se encuentra en alto número de copias en distintos loci cromosómicos 2. En estos casos, las sondas individuales con baja actividad específica pueden etiquetar con eficacia heterochromatic secuencias debido a su hibridación en múltiples sitios. Las sondas a secuencias repetitivas pueden sintetizarse oligonucleótidos comercialmente como cortas (30-50 pb) y químicamente conjugados con cualquiera de los múltiples grupos fluorescentes diferentes. Mapeo secuencias repetitivas dentro de heterocromatina utilizando tecnologías de secuenciación del genoma es difícil debido a los problemas encontrados en los andamios de construcción dentro de los bloques de satélite altamente repetitivas 4-6,7. Actualmente, ISH se erige como la forma más efectiva de cartografía de estas secuencias a nivel sub-cromosoma. Esta estrategia es importante para el mapeo de un gran número de secuencias repetitivas que están siendo descubiertas por los estudios de secuenciación del genoma y transcriptoma en curso. La eficiencia y la facilidad de mapeo secuencias repetitivas en los cromosomas de diapositivas montadas serían greatly mejorada por un protocolo simplificado para el ADN ISH. Por ejemplo, los protocolos existentes para el ADN ISH implican múltiples lavados de tejidos hibridados en solución de formamida 2,8, añadiendo así sustancialmente el tiempo requerido para las secuencias de cartografía y también la producción de grandes cantidades de residuos químicos para este reactivo costoso. Aquí se describe un método de ADN ISH revisado que evita la necesidad de lavados de formamida y utiliza equipos y reactivos de laboratorio básico. Este método fue diseñado originalmente para la rápida detección de las secuencias de ADN altamente repetitivas en las regiones heterocromáticas de neuroblastos de larvas de Drosophila mediante el uso de oligos sintetizados comercialmente que se conjugan con los tintes de fluorescencia. Sin embargo, este método también funciona para el mapeo de secuencias repetitivas mediante el uso de sondas más grandes sintetizados a través de otros medios de 9,10 y a través de múltiples diferentes tipos de tejidos y de cromosomas. Además, este método se puede utilizar para mapear secuencias euchromatic mediante el uso de más largo o multíparale, sondas cortas dentro de la secuencia euchromatic de interés.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafine tweezers (5 gauge)</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm cover slips</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr><td>Paraffin wax paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block with thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidity chamber</td><td></td><td></td><td>empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td></td><td></td><td>with slide grooves</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microfuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td>clear or colored</td></tr><tr><td>P20 micropipette and plastic tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paperclips</td><td></td><td></td><td>20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>16% EM grade paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Reagents</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, chemical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td></tr><tr><td>Long biotinylated probe</td><td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>for detection of long biotinylated probe</td></tr><tr><td>Hybridization buffer</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate + Tween</td></tr><tr><td>0.1x SSC</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>SSC, bovine serum albumin, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>phosphate-buffered saline + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>Hypotonic solution</td><td></td><td></td><td>0.5% sodium citrate in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

ADN hibridación in situ (ISH ADN) es un método comúnmente utilizado para las secuencias de mapeo a regiones específicas de cromosomas. Este enfoque es particularmente eficaz en la cartografía de secuencias altamente repetitivas a heterochromatic regiones, donde los enfoques computacionales enfrentan desafíos prohibitivos. Aquí se describe un protocolo simplificado para ADN ISH que elude lavados de formamida que son medidas estándar en otros protocolos de ADN ISH. El protocolo se ha optimizado para la hibridación con sondas de ADN monocatenario cortos que llevan colorantes fluorescentes, que marcan efectivamente secuencias repetitivas de ADN dentro de las regiones cromosómicas heterocromatínicas a través de un número de diferentes tipos de tejidos de insectos. Sin embargo, las solicitudes podrán hacerse extensivas a utilizar con sondas de mayor tamaño y la visualización de las secuencias de ADN de copia única (no repetitiva). Demostramos este método mediante la asignación de varios diferentes secuencias repetitivas a los cromosomas de Drosophila melanogaster aplastadas células neuronales y Nasoniavitripennis espermatocitos. Mostramos los patrones de hibridación de ambas sondas pequeñas, sintetizados en el mercado y para una sonda grande para la comparación. Este procedimiento utiliza insumos de laboratorio sencillas y reactivos, y es ideal para los investigadores que tienen poca experiencia con la realización de ADN ISH.

Para demostrar este método, hibridizada un conjunto de pequeñas oligos sintetizados comercialmente que se han modificado químicamente con conjugados fluorescentes (Figura 2) y una sonda biotinilada más larga (realizada a través de traducción nick de un producto de PCR; Figura 2B), a los cromosomas de varios tejidos diferentes tipos (ver Tabla 1). Las secuencias diana incluyen repeticiones satélite ubicadas en pericentromeric regiones (heterocromáticas) de los cr...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

18.1K vistas.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Video: Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Investigación

Genética

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene expression, cell identity and differentiation. Many approaches developed to study the 3D architecture of the genome can be divided into two complementary categories: chromosome conformation capture based technologies (C-technologies) and imaging. While the former is based on capturing the chromosome conformation and proximal DNA interactions in a population of fixed cells, the latter, based on DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) on 3D-preserved nuclei, allows contemporary visualization of multiple loci at a single cell level (multicolor), examining their interactions and distribution within the nucleus (3D multicolor DNA FISH). The technique of 3D multicolor DNA FISH has a limitation of visualizing only a few predetermined loci, not permitting a comprehensive analysis of the nuclear architecture. However, given the robustness of its results, 3D multicolor DNA FISH in combination with 3D-microscopy and image reconstruction is a possible method to validate C-technology based results and to unambiguously study the position and organization of specific loci at a single cell level. Here, we propose a step by step method of 3D multicolor DNA FISH suitable for a wide range of human primary cells and discuss all the practical actions, crucial steps, notions of 3D imaging and data analysis needed to obtained a successful and informative 3D multicolor DNA FISH within different biological contexts.

3D multicolor DNA FISH represents a tool to visualize multiple genomic loci within 3D preserved nuclei, unambiguously defining their reciprocal interactions and localization within the nuclear space at a single cell level. Here, a step by step protocol is described for a wide spectrum of human primary cells.

Herramienta 3D Multicolor DNA FISH para estudiar la arquitectura nuclear en células primarias humanas

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Biología

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Preparación de los cromosomas politénicos de Drosophila Calabazas para el Etiquetado de anticuerpos

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

De alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robusto PESCADO ADN 3D utilizando sondas marcadas directamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.

Hibridación fluorescente in situ en preparaciones de halo de ADN para revelar cromosomas completos, telómeros y loci de genes

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

HCR-DNA FISH: A Fluorescence In Situ Hybridization Technique to Detect Viral DNA in Infected Cells

Source: Wei Liu&#160;et al., <a href="https://www.jove.com/v/58950"> Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection</a>, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions were subjected to in situ hybridization chain reaction to detect MCPyV specific genomes. Further, the DNA-HCR technique was combined with FISH to visualize the MCPyV DNA in infected human skin cells.

HCR-DNA FISH: Una técnica de hibridación fluorescente in situ para detectar ADN viral en células infectadas

Source: Wei Liu&#160;et al.,  Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions ...

Método simple de ADN de fluorescencia

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