We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Tissue Dissection e Fixation (60 min) <ol><li> Per cervelli Drosophila, 3 ° posto instar larve in una goccia di 1x PBS (tampone fosfato salino). Scegli grande 3 ° instar larve che sono attivamente strisciando da fiale o bottiglie che non sono sovraffollate. <ol><li> Utilizzare uno ultrafine paio pinzette per afferrare i ganci bocca e un altro paio pinzette per afferrare 2/3 per tutta la lunghezza del corpo (figura 1A, B). Tirare delicatamente i ganci bocca per esporre il cervello, gangli ventrale, ghiandole salivari e parte del tratto digerente larvale. Utilizzare le pinzette per separare il cervello e gangli ventrale (Figura 1A, B) dalle altre tessuti e posto in una goccia di 1x PBT (tampone fosfato salino con Tween) su un piatto di plastica Petri. </li></ol></li><li> Per Nasonia dissezioni testicolo, scegliere maschio pupe di 3 giorni di età (corpi giallo con gli occhi rossi). Maschio Nasonia hanno piccole lunghezze pad ala relative a females durante la fase di pupa (Figura 1C). <ol><li> Tenere la pupa in alto dell&#39;addome vicino alla regione toracica con una coppia pinzetta, e con l&#39;altra coppia pinzetta, afferrare la punta molto distale dell&#39;addome e tirare fuori i testicoli tear-forma-drop (saranno circondati da grasso corpo che può essere scosso delicatamente; Figura 1D). Staccare tutte le parti del corpo esterno dei testicoli, che impediscono una corretta schiacciamento, e posto in una goccia di 1x PBT su un piatto di plastica Petri. </li></ol></li><li> Per ogni diapositiva, sezionare un totale di quattro o cinque campioni di tessuto (es., Drosophila cervello larvali o testicoli Nasonia). NOTA: Più di cinque campioni porteranno a nuclei sovraffollate e cromosomi. </li><li> Facoltativamente, per raggiungere una certa separazione dei cromatidi fratelli nelle regioni eucromatiche di cromosomi mitotici, trattare il tessuto con una soluzione ipotonica: trasferire cervelli da 1x PBT a un calo dello 0,5% di sodio citrato per 5-10 (non più di 10) min. NOTA: Colchicina (un inibitore mitotico) può essere utile per aumentare il numero di figure mitotiche in metafase 11. Tuttavia, il suo utilizzo non è necessaria se si utilizzano molto grande larve sane, e anche indesiderabile perché può influenzare negativamente la risoluzione dei cromosomi, la diffusione e la morfologia. </li><li> Inserire una goccia (~ 20 microlitri) di soluzione fissativo (2,5% paraformaldeide in 45% di acido acetico) sulla superficie di un vetrino Sigmacote trattati pulita. NOTA: Preparare la soluzione fissativa fresca per ogni giorno di utilizzo. Soluzioni fissativo che vanno 1,8-3,7% paraformaldeide nel 45% di acido acetico per ottenere i migliori risultati per i pesci. Utilizzando tessuti diversi cervelli o testicoli, o adattare questo protocollo per immuno-FISH può richiedere la sperimentazione di diversi fissativi (per un elenco di diversi fissativi, vedi 12). </li><li> Trasferire accuratamente ciascun campione di tessuto dal buffer dissezione (1x PBT) nella goccia di fissativo con le pinzette ultrafini, Minimizing trasferimento di dissezione tampone nella soluzione fissativo. Posizionare i campioni di tessuto in modo che siano uniformemente distanziati l&#39;uno dall&#39;altro entro la goccia fissativo. Incubare i tessuti in fissativo per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare con cura una diapositiva faccia poli-lisina rivestite giù sul slittamento dei tessuti e la copertura. Non premere a questo punto, ma invece permettono ai due di contattare leggermente in modo che la polizza di copertura attacca sulla parte inferiore della diapositiva. Invertire la diapositiva in modo che il vetrino è in cima. </li><li> Panino lo slittamento scorrevole / tessuti / copertura all&#39;interno di un pezzo di carta piegato filtro. Su una superficie stabile, con il pollice, premere con fermezza verso il basso sulla posizione direttamente sopra il vetrino. Fare attenzione a non scorrimento laterale del vetrino (ciò causerà macchie del tessuto). </li><li> Immergere il vetrino / tessuti / fodera in azoto liquido (vedi apparecchio in figura 1E, F), e lasciate riposare fino a quando il Azoto ferma bollente (è più fine). Rimuovere il vetrino e immediatamente scattare fuori il vetrino con una lametta fresca sfogliando un angolo del vetrino verso l&#39;alto (evitare di graffiare il tessuto fissato con la lama di rasoio). <ol><li> Pre-raffreddamento della diapositiva / tessuti / copertura di slittamento su un blocco di ghiaccio secco, copertura scivolare fino, per 1-2 minuti prima sommergendo in azoto liquido contribuisce a prevenire le diapositive di cracking. </li></ol></li><li> Posizionare immediatamente il vetrino con il tessuto in una vaschetta Coplin piena di etanolo al 100% a temperatura ambiente e lasciare riposare per almeno 5 minuti (questo tempo può essere più lungo, se necessario). NOTA: Cold 100% etanolo potrebbe anche essere utilizzato. </li><li> Rimuovere il vetrino con il tessuto, liberano dal etanolo in eccesso con un Kimwipe (senza toccare il tessuto fisso), e lasciare il vetrino asciugare per 1 ora. <ol><li> Passare direttamente al punto 2 o mantenere le diapositive a secco in aria bassa umidità o in una camera di essiccazione per settimane anche mesi prima di eseguire l&#39;ibridazione. </li></ol></li></ol> Figura 1: (A) A 3 ° instar Drosophila larva (a destra), con le posizioni indicate per cui per afferrare i ganci bocca (indicato con *) e 2/3 fino in fondo le larve di sezionare il cervello; (Sinistra) uno schema di una larva una stessa fase di sviluppo, raffigurante la posizione relativa del cervello nella testa larvale. (B) Il cervello e gangli ventrale sezionato da un 3 ° instar Drosophila larva (a destra) e uno schema di questo tessuti (a sinistra). (C) 3-giorni-old pupa Nasonia allo stadio giallo occhi corpo-rossi. (D) Una coppia di testicoli sezionato da un vecchio pupa maschio Nasonia 3 giorni (a destra) con le posizioni che indica dove per afferrare la pupa al posteriore dell&#39;addome (indicato con *) ea metà strada sul corpo; (Sinistra) schematico raffigurante maschio e femmina erap pupe; pupe maschio può essere distinto da ali che non si estendono oltre il profilo sagittale (freccia nera), a differenza di femmine che hanno ali che si estendono oltre il profilo; la posizione relativa della coppia testis è mostrato in pupa maschile. (E) Apparecchiatura-una serie di graffette-e metodo (F) utilizzate per immergere i vetrini in un serbatoio di azoto liquido. Stringhe graffetta multipli possono essere utilizzati per immersione simultanea di più diapositive. 2. ibridazione in situ (30 min al giorno 1; 1 h-2,5 ore per lunghi sonde-giorno 2) <ol><li> Aggiungere 1 ml (100 ng) di ciascuna sonda a 20 ml di buffer di 1.1x ibridazione. Pipettare Sonda / tampone di ibridazione sulla superficie del tessuto fissa (evitare di toccare il tessuto). </li><li> Posizionare con cura un vetrino direttamente sul tampone di sonde / ibridazione, facendo in modo che la polizza di copertura è centrata direttamente sopra il tessuto. Il buffer dovrebbe migrare a thdi e bordo esterno del vetrino, senza lasciare bolle d&#39;aria. NOTA: Le piccole bolle che non contattano il tessuto non pongono problemi alla procedura. Rimuovere grandi bolle sollevando attentamente un angolo del vetrino e con attenzione cadere indietro sul vetrino. </li><li> Posizionare il vetrino slittamento / tessuto / copertura sulla superficie di un blocco di pre-riscaldato a 95 ° C (coperchio scivolare). Coprire con un grosso pezzo di foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce. Sia la diapositiva incubare a 95 ° C per 5 min. NOTA: Un blocco tipico calore con fori per tubi può essere capovolto per fornire una superficie piana su cui posizionare il vetrino / tessuti / copertura di slittamento. </li><li> Rimuovere il vetrino, lasciandolo raffreddare leggermente finché è caldo al tatto. Avvolgere attenzione un pezzo di Parafilm allungato intorno vetrino per sigillare il liquido sottostante. </li><li> Posizionare il vetrino sigillato all&#39;interno di una camera di umidità e posizionare la camera in un incubatore preriscaldato a 30 ° C. Incubare a 30 ° C per 4 ore a tutta la notte.<ol><li> Creare una camera umida da una scatola di punta vuota o contenitori Tupperware con coperchio con Kimwipes inumidite o tovaglioli di carta posti sul fondo. NOTA: Le sonde oligo DNA a singolo filamento sono stati progettati per essere 28-33 basi per raggiungere una temperatura di fusione teorica (T m) di 45-47 ° C. Questi lunghezza e T m intervalli riflettono il fatto che molte sequenze ripetitive che abbiamo studiato sono AT-ricco e quindi hanno bassissimo contenuto GC. Sonde più lunghe probabilmente hanno valori più elevati m T; ciò può comportare superiore sfondo ibridazione alla temperatura di ibridazione standard 30 ° C. Così, alcuni di risoluzione dei problemi con le temperature di ibridazione può essere richiesto per ottenere i migliori risultati. Per trovare la migliore temperatura di ibridazione, aumento (o diminuzione) la temperatura di 5 ° C, in modo incrementale. </li></ol></li><li> Rimuovere con attenzione il Parafilm dalla diapositiva e poi rimuovere con attenzione il vetrino lentamente sollevando un angolo. Wash il vetrino tre volte per 15 minuti ogni lavaggio in tampone SSC 0.1x. Coprire la vaschetta Coplin con un foglio di alluminio durante i lavaggi per ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Se non si usa una lunga sonda biotinilata, passare al punto 2.8. <ol><li> Se si utilizza una sonda lunga biotinilato, asciugare la zona attorno il tessuto con un Kimwipe, facendo attenzione a non toccare il tessuto stesso. Mettere 100 ml di soluzione bloccante sopra il tessuto e coprire delicatamente con un coprioggetto, avendo cura di evitare bolle di cattura. Avvolgere il vetrino su vetrino con Parafilm e posto a 37 ° C per 30 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il vetrino e asciugare intorno il tessuto con un Kimwipe. Dispensare 100 l di rodamina-avidina diluito 1: 1000 in SBT su tessuto e coprire delicatamente con un coprioggetto, avendo cura di evitare di intrappolare bolle. Avvolgere il vetrino su vetrino con Parafilm e posto a 37 ° C per 30 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il vetrino e lavare il vetrino 3 volte per 5 minuti ciascuno in 4x SSCT e poi3 volte per 5 minuti ciascuno in 0.1x SSC. NOTA: diapositive possono essere lavati per periodi di tempo più lunghi. </li></ol></li><li> Rimuovere il vetrino e asciugare intorno il tessuto con un Kimwipe asciutto per rimuovere il tampone in eccesso (evitare di toccare il tessuto). Posizionare il lato tessuto diapositiva in un luogo buio per 10-15 minuti o fino a quando l&#39;umidità si dissolve completamente. </li><li> Dispensare 11 ml di mezzo di montaggio Vectashield (con 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole-DAPI) sul tessuto. Posizionare accuratamente un coprioggetto pulito (non trattato con Sigmacote) direttamente sopra il centro del mezzo e tessuti di montaggio. Il mezzo di montaggio dovrebbe migrare lentamente verso l&#39;esterno verso i bordi del vetrino. NOTA: Se il mezzo di montaggio non riesce a raggiungere il bordo del vetrino su tutti i lati, poi un ulteriore 1-2 ml di mezzo di fissaggio può essere applicato a una posizione sul bordo del vetrino per riempire il volume necessario. In questo caso, assicurarsi di asciugare ogni eccesso di terreno dalla superficie di scorrimento primatenuta. </li><li> Sigillare i bordi del vetrino con smalto. Evitare la pittura lo smalto sul campione di tessuto. </li><li> Posizionare il vetrino in posizione verticale in un luogo buio e lasciare il chiodo smalto asciutto fino a completa dura (di solito 30 minuti o più). A questo punto, il tessuto immagine o conservare a -20 ° C per 1 settimana per l&#39;imaging tardi. </li></ol> Buffer / Soluzione Ricette 10x PBS <ul><li> 80 g NaCl </li><li> 2,0 g KCl </li><li> 14,4 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g KH 2 PO 4 </li><li> pH a 7,4, H 2 O a 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml 10x PBS </li><li> 45 ml H 2 O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g NaCl </li><li> 88.2 g Na citrato </li><li> in 800 ml H 2 O </li><li> pH 7, H 2 O a 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 0.1x SSC <ul><li> 5 ml 20x SSC </li><li> 995 ml H 2 O </li></ul> Mix di ibridazione (20 ml; modificato da 11) <ul><li> 10 microlitri formammide </li><li> 4 ml 50% destrano solfato </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 4 microlitri H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 0,01 g albumina sierica bovina (BSA) </li><li> 10 microlitri Tween 20 </li><li> 7,9 ml H 2 O </li></ul> Soluzione Blocco 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g BSA </li><li> 10 microlitri Tween 20 </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 8 ml H 2 O </li></ul> Soluzione fissativa con paraformaldeide (1 ml) <ul><li> 393,75 ml H 2 O (aggiungere acqua prima) </li><li> 450 ml di acido acetico glaciale </li><li> 156.25 microlitri 16% paraformaldeide </li></ul>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

ISH DNA è spesso utilizzato per mappare le sequenze specifiche per i cromosomi. Abbiamo descritto un metodo semplice per ISH DNA ottimizzato per alto numero di copie, sequenze eterocromatiche. Invece di utilizzare lavaggi in una soluzione di formammide, che è un requisito in altri protocolli ISH DNA esistenti, poniamo vetrini montati tissutale direttamente su un blocco di pre-riscaldata per denaturare il DNA. Questo metodo aggira l&#39;uso di grandi quantità di formammide. Un passo fondamentale per la produzione di s...

DNA ibridazione in situ (ISH DNA) è un metodo comunemente utilizzato per le sequenze di mappatura a specifiche regioni cromosomiche. Sonde alle regioni a copia singola all&#39;interno euchromatin possono essere generati attraverso una manciata di approcci, tra cui nick-traduzione o end-etichettatura dei prodotti lunghi di DNA 1,2 e l&#39;incorporazione di deoxygenin (DIG) nucleotidi -attached e il loro riconoscimento attraverso una grande varietà di anticorpi gruppo-coniugato 1-3. Visualizzazione di sequenze eucromatiche in pochi o solo numero copia richiede l&#39;uso di singole, grandi sonde ad alta attività specifica o un cocktail di più, sonde minori che aumentano insieme il segnale. Al contrario, le sequenze altamente ripetitive trovano in heterochromatin, come DNA satellite, sono bersagli facili per ISH DNA perché normalmente esistono come decine di migliaia di ripetizioni raggruppati in regioni cromosomiche singole note come blocchi. Elementi trasponibili possono anche esseretrovata ad alti numeri di copia presso distinto cromosomica loci 2. In questi casi, singole sonde con bassa attività specifica può effettivamente etichettare sequenze eterocromatiche a causa della loro ibridazione in più siti. Sonde a sequenze ripetitive possono essere sintetizzati oligonucleotidi commercialmente come brevi (30-50 bp) e coniugati chimicamente con qualsiasi più gruppi fluorescenti differenti. Mappatura sequenze ripetitive all&#39;interno heterochromatin utilizzando le tecnologie di sequenziamento del genoma-è difficile a causa di problemi incontrati in impalcature edili all&#39;interno di blocchi satellitari altamente ripetitive 4-6,7. Attualmente, ISH si pone come il modo più efficace di mappare queste sequenze a livello sub-cromosoma. Questa strategia è importante per la mappatura gran numero di sequenze ripetitive che vengono scoperte da studi del genoma e del trascrittoma di sequenziamento in corso. L&#39;efficienza e la facilità di mappatura sequenze ripetute sui cromosomi montati scorrevoli sarebbero Greatly rafforzata da un protocollo semplificato per ISH DNA. Per esempio, i protocolli esistenti per ISH DNA coinvolgono diversi lavaggi di tessuti ibridizzati in soluzione formammide 2,8, aggiungendo così sostanzialmente il tempo necessario per le sequenze di mappatura e produrre anche grandi quantità di rifiuti chimici per questa costosa reagente. Qui si descrive un metodo di revisione ISH DNA che aggira la necessità di lavaggi formammide e utilizza attrezzature di laboratorio di base e reagenti. Questo metodo è stato originariamente progettato per la rapida mappatura altamente ripetitive sequenze di DNA in regioni eterocromatiche di neuroblasti larvali Drosophila utilizzando oligonucleotidi sintetizzati in commercio che coniugate con coloranti fluorescenti. Tuttavia, questo metodo funziona anche per la mappatura sequenze ripetute utilizzando sonde grandi sintetizzati attraverso altri mezzi e 9,10 per diversi tipi di tessuto e cromosomi diversi. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per mappare le sequenze eucromatiche utilizzando più o multiple sonde brevi all&#39;interno della sequenza euchromatic di interesse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:285px;"></td>
			<td style="width:257px;">Company</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Materials&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ultrafine tweezers (5 gauge)</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sigmacote</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Filter paper (75-150mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin wax paper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat block with thermometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dry incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Razor blades</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coplin jars (with slide grooves)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aluminum foil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nail polish (clear or colored)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-20 &#956;L micropipette and plastic tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">20-25 standard metal paperclips linked to form a chain</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td>Company/Notes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">16% EM grade paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">100% Ethanol, chemical grade</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)</td>
			<td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)</td>
			<td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hybridization buffer</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">0.1X SSC (Saline-sodium citrate)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Blocking solution</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

DNA ibridazione in situ (ISH DNA) è un metodo comunemente utilizzato per le sequenze di mappatura a specifiche regioni cromosomiche. Questo approccio è particolarmente efficace per la mappatura delle sequenze altamente ripetitive alle regioni eterocromatiche, dove approcci computazionali affrontare sfide proibitive. Qui si descrive un protocollo semplificato per ISH DNA che aggira lavaggi formammide che sono passi standard in altri protocolli ISH DNA. Il nostro protocollo è ottimizzato per l&#39;ibridazione con brevi singole sonde filamento di DNA che portano coloranti fluorescenti, che segnano in modo efficace le sequenze di DNA ripetute all&#39;interno di regioni cromosomiche eterocromatiche tutta una serie di diversi tipi di tessuto insetto. Tuttavia, le applicazioni possono essere estese da usare con sonde più grandi e la visualizzazione di sequenze singola copia (non ripetitivi) DNA. Dimostriamo questo metodo mappando diverse sequenze ripetitive diversi di cromosomi schiacciate da Drosophila melanogaster cellule neurali e Nasoniavitripennis spermatociti. Mostriamo modelli di ibridazione sia per le piccole, le sonde sintetizzati commercialmente e per una sonda più grande per il confronto. Questa procedura utilizza semplici forniture di laboratorio e reagenti, ed è ideale per gli investigatori che hanno poca esperienza con l&#39;esecuzione di ISH DNA.

Per illustrare questo metodo, si ibridati una serie di piccoli oligonucleotidi sintetizzati in commercio che sono stati modificati chimicamente con coniugati fluorescenti (Figura 2) e una sonda più biotinilato (fatta attraverso la traduzione nick di un prodotto di PCR; Figura 2B), ai cromosomi da diversi tessuti differenti tipi (vedi tabella 1). Le sequenze bersaglio inclusi ripetizioni satelliti situati in pericentromeriche (eterocromatiche) regioni dei cromosomi mito...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Metodo semplice per DNA fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione di cromosomi Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

17.9K Views.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Ricerca

Biologia

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescenza In situ</emIbridazione> (FISH) Protocollo di sperma umano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione per tessuti renali fissati in formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA combinato fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per studiare inattivazione del cromosoma X nelle cellule staminali embrionali di topo differenziata Femminile

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A monte intero<em&gt; In Situ</em&gt; Metodo ibridazione per la molluschi gasteropodi<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...