Name: simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
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We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Tissue Dissection e Fixation (60 min) <ol><li> Per cervelli Drosophila, 3 ° posto instar larve in una goccia di 1x PBS (tampone fosfato salino). Scegli grande 3 ° instar larve che sono attivamente strisciando da fiale o bottiglie che non sono sovraffollate. <ol><li> Utilizzare uno ultrafine paio pinzette per afferrare i ganci bocca e un altro paio pinzette per afferrare 2/3 per tutta la lunghezza del corpo (figura 1A, B). Tirare delicatamente i ganci bocca per esporre il cervello, gangli ventrale, ghiandole salivari e parte del tratto digerente larvale. Utilizzare le pinzette per separare il cervello e gangli ventrale (Figura 1A, B) dalle altre tessuti e posto in una goccia di 1x PBT (tampone fosfato salino con Tween) su un piatto di plastica Petri. </li></ol></li><li> Per Nasonia dissezioni testicolo, scegliere maschio pupe di 3 giorni di età (corpi giallo con gli occhi rossi). Maschio Nasonia hanno piccole lunghezze pad ala relative a females durante la fase di pupa (Figura 1C). <ol><li> Tenere la pupa in alto dell&#39;addome vicino alla regione toracica con una coppia pinzetta, e con l&#39;altra coppia pinzetta, afferrare la punta molto distale dell&#39;addome e tirare fuori i testicoli tear-forma-drop (saranno circondati da grasso corpo che può essere scosso delicatamente; Figura 1D). Staccare tutte le parti del corpo esterno dei testicoli, che impediscono una corretta schiacciamento, e posto in una goccia di 1x PBT su un piatto di plastica Petri. </li></ol></li><li> Per ogni diapositiva, sezionare un totale di quattro o cinque campioni di tessuto (es., Drosophila cervello larvali o testicoli Nasonia). NOTA: Più di cinque campioni porteranno a nuclei sovraffollate e cromosomi. </li><li> Facoltativamente, per raggiungere una certa separazione dei cromatidi fratelli nelle regioni eucromatiche di cromosomi mitotici, trattare il tessuto con una soluzione ipotonica: trasferire cervelli da 1x PBT a un calo dello 0,5% di sodio citrato per 5-10 (non più di 10) min. NOTA: Colchicina (un inibitore mitotico) può essere utile per aumentare il numero di figure mitotiche in metafase 11. Tuttavia, il suo utilizzo non è necessaria se si utilizzano molto grande larve sane, e anche indesiderabile perché può influenzare negativamente la risoluzione dei cromosomi, la diffusione e la morfologia. </li><li> Inserire una goccia (~ 20 microlitri) di soluzione fissativo (2,5% paraformaldeide in 45% di acido acetico) sulla superficie di un vetrino Sigmacote trattati pulita. NOTA: Preparare la soluzione fissativa fresca per ogni giorno di utilizzo. Soluzioni fissativo che vanno 1,8-3,7% paraformaldeide nel 45% di acido acetico per ottenere i migliori risultati per i pesci. Utilizzando tessuti diversi cervelli o testicoli, o adattare questo protocollo per immuno-FISH può richiedere la sperimentazione di diversi fissativi (per un elenco di diversi fissativi, vedi 12). </li><li> Trasferire accuratamente ciascun campione di tessuto dal buffer dissezione (1x PBT) nella goccia di fissativo con le pinzette ultrafini, Minimizing trasferimento di dissezione tampone nella soluzione fissativo. Posizionare i campioni di tessuto in modo che siano uniformemente distanziati l&#39;uno dall&#39;altro entro la goccia fissativo. Incubare i tessuti in fissativo per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare con cura una diapositiva faccia poli-lisina rivestite giù sul slittamento dei tessuti e la copertura. Non premere a questo punto, ma invece permettono ai due di contattare leggermente in modo che la polizza di copertura attacca sulla parte inferiore della diapositiva. Invertire la diapositiva in modo che il vetrino è in cima. </li><li> Panino lo slittamento scorrevole / tessuti / copertura all&#39;interno di un pezzo di carta piegato filtro. Su una superficie stabile, con il pollice, premere con fermezza verso il basso sulla posizione direttamente sopra il vetrino. Fare attenzione a non scorrimento laterale del vetrino (ciò causerà macchie del tessuto). </li><li> Immergere il vetrino / tessuti / fodera in azoto liquido (vedi apparecchio in figura 1E, F), e lasciate riposare fino a quando il Azoto ferma bollente (è più fine). Rimuovere il vetrino e immediatamente scattare fuori il vetrino con una lametta fresca sfogliando un angolo del vetrino verso l&#39;alto (evitare di graffiare il tessuto fissato con la lama di rasoio). <ol><li> Pre-raffreddamento della diapositiva / tessuti / copertura di slittamento su un blocco di ghiaccio secco, copertura scivolare fino, per 1-2 minuti prima sommergendo in azoto liquido contribuisce a prevenire le diapositive di cracking. </li></ol></li><li> Posizionare immediatamente il vetrino con il tessuto in una vaschetta Coplin piena di etanolo al 100% a temperatura ambiente e lasciare riposare per almeno 5 minuti (questo tempo può essere più lungo, se necessario). NOTA: Cold 100% etanolo potrebbe anche essere utilizzato. </li><li> Rimuovere il vetrino con il tessuto, liberano dal etanolo in eccesso con un Kimwipe (senza toccare il tessuto fisso), e lasciare il vetrino asciugare per 1 ora. <ol><li> Passare direttamente al punto 2 o mantenere le diapositive a secco in aria bassa umidità o in una camera di essiccazione per settimane anche mesi prima di eseguire l&#39;ibridazione. </li></ol></li></ol> Figura 1: (A) A 3 ° instar Drosophila larva (a destra), con le posizioni indicate per cui per afferrare i ganci bocca (indicato con *) e 2/3 fino in fondo le larve di sezionare il cervello; (Sinistra) uno schema di una larva una stessa fase di sviluppo, raffigurante la posizione relativa del cervello nella testa larvale. (B) Il cervello e gangli ventrale sezionato da un 3 ° instar Drosophila larva (a destra) e uno schema di questo tessuti (a sinistra). (C) 3-giorni-old pupa Nasonia allo stadio giallo occhi corpo-rossi. (D) Una coppia di testicoli sezionato da un vecchio pupa maschio Nasonia 3 giorni (a destra) con le posizioni che indica dove per afferrare la pupa al posteriore dell&#39;addome (indicato con *) ea metà strada sul corpo; (Sinistra) schematico raffigurante maschio e femmina erap pupe; pupe maschio può essere distinto da ali che non si estendono oltre il profilo sagittale (freccia nera), a differenza di femmine che hanno ali che si estendono oltre il profilo; la posizione relativa della coppia testis è mostrato in pupa maschile. (E) Apparecchiatura-una serie di graffette-e metodo (F) utilizzate per immergere i vetrini in un serbatoio di azoto liquido. Stringhe graffetta multipli possono essere utilizzati per immersione simultanea di più diapositive. 2. ibridazione in situ (30 min al giorno 1; 1 h-2,5 ore per lunghi sonde-giorno 2) <ol><li> Aggiungere 1 ml (100 ng) di ciascuna sonda a 20 ml di buffer di 1.1x ibridazione. Pipettare Sonda / tampone di ibridazione sulla superficie del tessuto fissa (evitare di toccare il tessuto). </li><li> Posizionare con cura un vetrino direttamente sul tampone di sonde / ibridazione, facendo in modo che la polizza di copertura è centrata direttamente sopra il tessuto. Il buffer dovrebbe migrare a thdi e bordo esterno del vetrino, senza lasciare bolle d&#39;aria. NOTA: Le piccole bolle che non contattano il tessuto non pongono problemi alla procedura. Rimuovere grandi bolle sollevando attentamente un angolo del vetrino e con attenzione cadere indietro sul vetrino. </li><li> Posizionare il vetrino slittamento / tessuto / copertura sulla superficie di un blocco di pre-riscaldato a 95 ° C (coperchio scivolare). Coprire con un grosso pezzo di foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce. Sia la diapositiva incubare a 95 ° C per 5 min. NOTA: Un blocco tipico calore con fori per tubi può essere capovolto per fornire una superficie piana su cui posizionare il vetrino / tessuti / copertura di slittamento. </li><li> Rimuovere il vetrino, lasciandolo raffreddare leggermente finché è caldo al tatto. Avvolgere attenzione un pezzo di Parafilm allungato intorno vetrino per sigillare il liquido sottostante. </li><li> Posizionare il vetrino sigillato all&#39;interno di una camera di umidità e posizionare la camera in un incubatore preriscaldato a 30 ° C. Incubare a 30 ° C per 4 ore a tutta la notte.<ol><li> Creare una camera umida da una scatola di punta vuota o contenitori Tupperware con coperchio con Kimwipes inumidite o tovaglioli di carta posti sul fondo. NOTA: Le sonde oligo DNA a singolo filamento sono stati progettati per essere 28-33 basi per raggiungere una temperatura di fusione teorica (T m) di 45-47 ° C. Questi lunghezza e T m intervalli riflettono il fatto che molte sequenze ripetitive che abbiamo studiato sono AT-ricco e quindi hanno bassissimo contenuto GC. Sonde più lunghe probabilmente hanno valori più elevati m T; ciò può comportare superiore sfondo ibridazione alla temperatura di ibridazione standard 30 ° C. Così, alcuni di risoluzione dei problemi con le temperature di ibridazione può essere richiesto per ottenere i migliori risultati. Per trovare la migliore temperatura di ibridazione, aumento (o diminuzione) la temperatura di 5 ° C, in modo incrementale. </li></ol></li><li> Rimuovere con attenzione il Parafilm dalla diapositiva e poi rimuovere con attenzione il vetrino lentamente sollevando un angolo. Wash il vetrino tre volte per 15 minuti ogni lavaggio in tampone SSC 0.1x. Coprire la vaschetta Coplin con un foglio di alluminio durante i lavaggi per ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Se non si usa una lunga sonda biotinilata, passare al punto 2.8. <ol><li> Se si utilizza una sonda lunga biotinilato, asciugare la zona attorno il tessuto con un Kimwipe, facendo attenzione a non toccare il tessuto stesso. Mettere 100 ml di soluzione bloccante sopra il tessuto e coprire delicatamente con un coprioggetto, avendo cura di evitare bolle di cattura. Avvolgere il vetrino su vetrino con Parafilm e posto a 37 ° C per 30 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il vetrino e asciugare intorno il tessuto con un Kimwipe. Dispensare 100 l di rodamina-avidina diluito 1: 1000 in SBT su tessuto e coprire delicatamente con un coprioggetto, avendo cura di evitare di intrappolare bolle. Avvolgere il vetrino su vetrino con Parafilm e posto a 37 ° C per 30 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il vetrino e lavare il vetrino 3 volte per 5 minuti ciascuno in 4x SSCT e poi3 volte per 5 minuti ciascuno in 0.1x SSC. NOTA: diapositive possono essere lavati per periodi di tempo più lunghi. </li></ol></li><li> Rimuovere il vetrino e asciugare intorno il tessuto con un Kimwipe asciutto per rimuovere il tampone in eccesso (evitare di toccare il tessuto). Posizionare il lato tessuto diapositiva in un luogo buio per 10-15 minuti o fino a quando l&#39;umidità si dissolve completamente. </li><li> Dispensare 11 ml di mezzo di montaggio Vectashield (con 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole-DAPI) sul tessuto. Posizionare accuratamente un coprioggetto pulito (non trattato con Sigmacote) direttamente sopra il centro del mezzo e tessuti di montaggio. Il mezzo di montaggio dovrebbe migrare lentamente verso l&#39;esterno verso i bordi del vetrino. NOTA: Se il mezzo di montaggio non riesce a raggiungere il bordo del vetrino su tutti i lati, poi un ulteriore 1-2 ml di mezzo di fissaggio può essere applicato a una posizione sul bordo del vetrino per riempire il volume necessario. In questo caso, assicurarsi di asciugare ogni eccesso di terreno dalla superficie di scorrimento primatenuta. </li><li> Sigillare i bordi del vetrino con smalto. Evitare la pittura lo smalto sul campione di tessuto. </li><li> Posizionare il vetrino in posizione verticale in un luogo buio e lasciare il chiodo smalto asciutto fino a completa dura (di solito 30 minuti o più). A questo punto, il tessuto immagine o conservare a -20 ° C per 1 settimana per l&#39;imaging tardi. </li></ol> Buffer / Soluzione Ricette 10x PBS <ul><li> 80 g NaCl </li><li> 2,0 g KCl </li><li> 14,4 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g KH 2 PO 4 </li><li> pH a 7,4, H 2 O a 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml 10x PBS </li><li> 45 ml H 2 O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g NaCl </li><li> 88.2 g Na citrato </li><li> in 800 ml H 2 O </li><li> pH 7, H 2 O a 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 0.1x SSC <ul><li> 5 ml 20x SSC </li><li> 995 ml H 2 O </li></ul> Mix di ibridazione (20 ml; modificato da 11) <ul><li> 10 microlitri formammide </li><li> 4 ml 50% destrano solfato </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 4 microlitri H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 0,01 g albumina sierica bovina (BSA) </li><li> 10 microlitri Tween 20 </li><li> 7,9 ml H 2 O </li></ul> Soluzione Blocco 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g BSA </li><li> 10 microlitri Tween 20 </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 8 ml H 2 O </li></ul> Soluzione fissativa con paraformaldeide (1 ml) <ul><li> 393,75 ml H 2 O (aggiungere acqua prima) </li><li> 450 ml di acido acetico glaciale </li><li> 156.25 microlitri 16% paraformaldeide </li></ul>

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	<li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li><li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila.">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li><li>Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+polytene+chromosomes+in+Drosophila+using+digoxigenin-labeled+probes.">In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).</li><li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatic+sequences+in+a+Drosophila+whole-genome+shotgun+assembly.">Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly.</a> Genome Biology. 3 (12), (2002).</li><li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+finishing+and+mapping+of+Drosophila+melanogaster+heterochromatin.">Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin.</a> Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).</li><li>Treangen, T. J., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+DNA+and+next-generation+sequencing:+computational+challenges+and+solutions.">Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+pericentric+heterochromatin+by+comparative+genomic+hybridization+analysis+and+chromosome+deletions+in+Drosophila+melanogaster.">Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).</li><li>Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+of+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+larval+brain.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+Y-linked+genes+to+the+dot+chromosome+in+Drosophila+pseudoobscura.">Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura.</a> Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).</li><li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila.">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).</li><li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+l(1)zw10+gene+product,+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation,+is+redistributed+at+anaphase+onset.">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li><li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes.">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li><li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSR+(paternal+sex+ratio)+chromosomes:+the+ultimate+selfish+genetic+elements.">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

ISH DNA è spesso utilizzato per mappare le sequenze specifiche per i cromosomi. Abbiamo descritto un metodo semplice per ISH DNA ottimizzato per alto numero di copie, sequenze eterocromatiche. Invece di utilizzare lavaggi in una soluzione di formammide, che è un requisito in altri protocolli ISH DNA esistenti, poniamo vetrini montati tissutale direttamente su un blocco di pre-riscaldata per denaturare il DNA. Questo metodo aggira l&#39;uso di grandi quantità di formammide. Un passo fondamentale per la produzione di segnali di ibridazione nitide è quello di utilizzare la soluzione di fissaggio appena fatto; mancato di farlo (o fare nuova soluzione con paraformaldeide che è stato aperto per più di un mese) può diminuire la risoluzione del segnale. Una limitazione di questo metodo è che, come per altri protocolli ISH DNA, la temperatura di ibridazione può richiedere ottimizzazione per eliminare ibridazione spurio a sequenze off bersaglio. Questo protocollo è, sonde ssDNA sensibili-brevi coniugati con un solo fluoropHore per molecola in grado di rilevare blocchi di ripetizioni con un numero di copia da ripetere anche relativamente basse (ad esempio, ~ 700 Rsp ripete; Figura 2C). Segnali ai blocchi satellitari con meno ripetizioni possono essere visualizzati con brevi sonde ssDNA utilizzando una fotocamera digitale ad alta sensibilità. Sebbene non illustrato, questo metodo è efficace anche per mappare sequenze non ripetitive in euchromatin 10. Utilizzando lunghi, sonde biotinilate offre una maggiore flessibilità nella rilevazione sequenze numeriche copia bassi come il segnale può facilmente essere amplificato da ripetuti trattamenti biotinilato anti-avidina e rodamina-avidina 9. Per visualizzare le sequenze a copia singola, più sonde che misurano la sequenza può essere necessario. In alternativa, cromosomi artificiali batterici (BAC) contenente la sequenza di interesse possono essere etichettati attraverso la traduzione nick o innesco casuale per l&#39;utilizzo come sonda per le sequenze non ripetitive 10. Per mappare le sequenze su una bella scala, sonde di targeting different ripete (ognuno con diversi fluorofori) possono essere utilizzati contemporaneamente per ottenere la posizione di sequenze bersaglio rispetto ad altre ripetizioni e punti di riferimento strutturali sui cromosomi. Mentre usiamo due sonde qui (Figura 2A, B, D), il numero di sonde può essere facilmente aumentata a tre 10 o più, a seconda del numero di diversi filtri disponibili microscopio a fluorescenza. Questo protocollo può essere esteso ad altri tessuti, abbiamo verificato che il protocollo funziona bene su politenici zucche cromosoma dalle ghiandole salivari. È concepibile che questo metodo sia accoppiato con immuno-colorazione delle proteine ​​della cromatina; tuttavia è consigliabile immuno-colorazione eseguita come primo passo e seguita da re-fissazione con paraformaldeide prima ISH DNA per prevenire la perdita anticorpo durante ISH DNA.

DNA ibridazione in situ (ISH DNA) è un metodo comunemente utilizzato per le sequenze di mappatura a specifiche regioni cromosomiche. Sonde alle regioni a copia singola all&#39;interno euchromatin possono essere generati attraverso una manciata di approcci, tra cui nick-traduzione o end-etichettatura dei prodotti lunghi di DNA 1,2 e l&#39;incorporazione di deoxygenin (DIG) nucleotidi -attached e il loro riconoscimento attraverso una grande varietà di anticorpi gruppo-coniugato 1-3. Visualizzazione di sequenze eucromatiche in pochi o solo numero copia richiede l&#39;uso di singole, grandi sonde ad alta attività specifica o un cocktail di più, sonde minori che aumentano insieme il segnale. Al contrario, le sequenze altamente ripetitive trovano in heterochromatin, come DNA satellite, sono bersagli facili per ISH DNA perché normalmente esistono come decine di migliaia di ripetizioni raggruppati in regioni cromosomiche singole note come blocchi. Elementi trasponibili possono anche esseretrovata ad alti numeri di copia presso distinto cromosomica loci 2. In questi casi, singole sonde con bassa attività specifica può effettivamente etichettare sequenze eterocromatiche a causa della loro ibridazione in più siti. Sonde a sequenze ripetitive possono essere sintetizzati oligonucleotidi commercialmente come brevi (30-50 bp) e coniugati chimicamente con qualsiasi più gruppi fluorescenti differenti. Mappatura sequenze ripetitive all&#39;interno heterochromatin utilizzando le tecnologie di sequenziamento del genoma-è difficile a causa di problemi incontrati in impalcature edili all&#39;interno di blocchi satellitari altamente ripetitive 4-6,7. Attualmente, ISH si pone come il modo più efficace di mappare queste sequenze a livello sub-cromosoma. Questa strategia è importante per la mappatura gran numero di sequenze ripetitive che vengono scoperte da studi del genoma e del trascrittoma di sequenziamento in corso. L&#39;efficienza e la facilità di mappatura sequenze ripetute sui cromosomi montati scorrevoli sarebbero Greatly rafforzata da un protocollo semplificato per ISH DNA. Per esempio, i protocolli esistenti per ISH DNA coinvolgono diversi lavaggi di tessuti ibridizzati in soluzione formammide 2,8, aggiungendo così sostanzialmente il tempo necessario per le sequenze di mappatura e produrre anche grandi quantità di rifiuti chimici per questa costosa reagente. Qui si descrive un metodo di revisione ISH DNA che aggira la necessità di lavaggi formammide e utilizza attrezzature di laboratorio di base e reagenti. Questo metodo è stato originariamente progettato per la rapida mappatura altamente ripetitive sequenze di DNA in regioni eterocromatiche di neuroblasti larvali Drosophila utilizzando oligonucleotidi sintetizzati in commercio che coniugate con coloranti fluorescenti. Tuttavia, questo metodo funziona anche per la mappatura sequenze ripetute utilizzando sonde grandi sintetizzati attraverso altri mezzi e 9,10 per diversi tipi di tessuto e cromosomi diversi. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per mappare le sequenze eucromatiche utilizzando più o multiple sonde brevi all&#39;interno della sequenza euchromatic di interesse.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafine tweezers (5 gauge)</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm cover slips</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr><td>Paraffin wax paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block with thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidity chamber</td><td></td><td></td><td>empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td></td><td></td><td>with slide grooves</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microfuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td>clear or colored</td></tr><tr><td>P20 micropipette and plastic tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paperclips</td><td></td><td></td><td>20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>16% EM grade paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Reagents</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, chemical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td></tr><tr><td>Long biotinylated probe</td><td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>for detection of long biotinylated probe</td></tr><tr><td>Hybridization buffer</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate + Tween</td></tr><tr><td>0.1x SSC</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>SSC, bovine serum albumin, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>phosphate-buffered saline + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>Hypotonic solution</td><td></td><td></td><td>0.5% sodium citrate in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

DNA ibridazione in situ (ISH DNA) è un metodo comunemente utilizzato per le sequenze di mappatura a specifiche regioni cromosomiche. Questo approccio è particolarmente efficace per la mappatura delle sequenze altamente ripetitive alle regioni eterocromatiche, dove approcci computazionali affrontare sfide proibitive. Qui si descrive un protocollo semplificato per ISH DNA che aggira lavaggi formammide che sono passi standard in altri protocolli ISH DNA. Il nostro protocollo è ottimizzato per l&#39;ibridazione con brevi singole sonde filamento di DNA che portano coloranti fluorescenti, che segnano in modo efficace le sequenze di DNA ripetute all&#39;interno di regioni cromosomiche eterocromatiche tutta una serie di diversi tipi di tessuto insetto. Tuttavia, le applicazioni possono essere estese da usare con sonde più grandi e la visualizzazione di sequenze singola copia (non ripetitivi) DNA. Dimostriamo questo metodo mappando diverse sequenze ripetitive diversi di cromosomi schiacciate da Drosophila melanogaster cellule neurali e Nasoniavitripennis spermatociti. Mostriamo modelli di ibridazione sia per le piccole, le sonde sintetizzati commercialmente e per una sonda più grande per il confronto. Questa procedura utilizza semplici forniture di laboratorio e reagenti, ed è ideale per gli investigatori che hanno poca esperienza con l&#39;esecuzione di ISH DNA.

Per illustrare questo metodo, si ibridati una serie di piccoli oligonucleotidi sintetizzati in commercio che sono stati modificati chimicamente con coniugati fluorescenti (Figura 2) e una sonda più biotinilato (fatta attraverso la traduzione nick di un prodotto di PCR; Figura 2B), ai cromosomi da diversi tessuti differenti tipi (vedi tabella 1). Le sequenze bersaglio inclusi ripetizioni satelliti situati in pericentromeriche (eterocromatiche) regioni dei cromosomi mitotici di D. melanogaster neuroblasti larvali (Figura 2A-C), e cromosomi meiotici da N. pupa vitripennis testicoli (Figura 2D). Le ibridazioni in ognuno di questi casi hanno rivelato modelli bande discrete a regioni sub-cromosomiche. Un punto degno di nota è che la sonda per la D. melanogaster 359 bp repeat satellite riconosce sia un grande blocco multi-pair megabase sulla X, ed ​​una regione molto più piccola sul cromosoma 3(Figura 2A). Una sonda più contro il satellite Responder rileva anche blocchi di ripetizione, comprensivi di numeri di ripetizione di copie relativamente bassi (~ 700 copie; Figura 2b). Così, questo metodo consente la visualizzazione di piccoli blocchi satellitari. Per aiutare a rivelare struttura cromosomica e aiuto nell&#39;identificazione cromosoma, può essere utile per trattare i cromosomi con una soluzione ipotonica (descritta nel passaggio 1.5). I tessuti in figura pannelli 2B e 2C sono stati trattati con una soluzione ipotonica per 5 e 10 minuti, rispettivamente. Nota la separazione dei cromatidi fratelli è maggiore con il trattamento più lungo (Figura 2C). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52288/52288fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: DNA ibridazione in situ per (A) cromosomi neuroblasti larvali da D. melanogaster /D. simulans ibridi, (B) e (C) cromosomi neuroblasti larvali da D. melanogaster trattati con soluzione ipotonica (vedi Dissection e Fixation punto 1); (D) cromosomi meiotici dal tessuto testicolare pupa del gioiello vespa Nasonia vitripennis. In (A), le frecce verdi indicano piccole regioni del satellite AATAT sul D. simulans 4 ° cromosoma, mentre i punti di freccia verde per AATAT sul D. melanogaster cromosoma X. Freccia rossa evidenzia una piccola regione di 359 bp satellite sulla D. melanogaster 3 ° cromosoma, mentre la freccia rossa indica 359 sequenze bp sulla X. Tutti i satelliti in (A) sono stati ibridati con brevi, oligo fluorescente. In (B), il segnale verde corrisponde al satellite AAGAG (oligo sintetizzato) e il segnale rosso è il 120 bp Responder satellitare (una sonda biotinilata; contrassegnaticon le frecce rosse). (C) Lo stesso satellitare Responder con un oligo breve fluorescente (frecce rosse). In (D), la freccia rossa indica un satellite che si trova unicamente sul cromosoma paterno rapporto tra i sessi (PSR), che è un non-essenziale, B cromosoma soprannumerario trovato in popolazioni naturali di N. vitripennis 13, mentre la freccia verde indica un satellite su uno dei cromosomi normali; questa ibridazione è stata effettuata utilizzando brevi, oligo fluorescente. Tutte le sonde sono dettagliate nella Tabella 1. Bar Scala a pannello (A) è di 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52288/52288fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome Probe </td><td> Sonda </td><td> Oligo </td><td><strong&gt; Label </td></tr><tr><td> Satellitare AAGAG </td><td> Oligo </td><td> (AAGAG) 7 </td><td> 5 &#39;6-FAM (fluoresceina) </td></tr><tr><td> Satellitare AATAT </td><td> Oligo </td><td> (AATAT) 6 </td><td> 5&#39;-Cy3 </td></tr><tr><td> 359-bp satellitare </td><td> Oligo </td><td> TTT TCC AAA TTT CGG TCA TCA AAT AAT CAT </td><td> 5&#39;-Alexa555 </td></tr><tr><td> Satellitare PSR </td><td> Oligo </td><td> TGT AAC TGG AAA AGG AAA ATG TAT TAT TGA </td><td> 5&#39;-Alexa555 </td></tr><tr><td> Nasonia autosome satellitare </td><td> Oligo </td><td> AAT TTT GTG AAT TTT GGT GTC TCC ATC </td><td> 5&#39;-Alexa633 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Responder </td><td rowspan="2"> PCR </td><td> F-5 &#39;GGA AAA TCA CCC ATT TTG ATC GC </td><td rowspan="2"> Biotin-14-dATP </td></tr><tr><td> R-5 &#39;CCG AAT TCA AGT ACC AGA C </td></tr></tbody></table>Tabella 1: Sonda tipi utilizzati in Figura 2.

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Metodo semplice per DNA fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione di cromosomi Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

18.1K Views.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Ricerca

Genetica

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; su cromosomi mitotici di zanzare

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Immunologia e infezioni

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Preparazione dei cromosomi di Drosophila Zucche politene per l&#39;etichettatura di anticorpi

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Biologia

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Biologia dello sviluppo

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.

Ibridazione fluorescenza in situ su preparati di alone di DNA per rivelare interi cromosomi, telomeri e loci genici

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

HCR-DNA FISH: A Fluorescence In Situ Hybridization Technique to Detect Viral DNA in Infected Cells

Source: Wei Liu&#160;et al., <a href="https://www.jove.com/v/58950"> Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection</a>, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions were subjected to in situ hybridization chain reaction to detect MCPyV specific genomes. Further, the DNA-HCR technique was combined with FISH to visualize the MCPyV DNA in infected human skin cells.

HCR-DNA FISH: Una tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare il DNA virale nelle cellule infette

Source: Wei Liu&#160;et al.,  Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions ...

Metodo semplice per DNA fluorescenza

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Fluorescente

Preparazione dei cromosomi di Drosophila Zucche politene per l'etichettatura di anticorpi

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

Ibridazione fluorescenza in situ su preparati di alone di DNA per rivelare interi cromosomi, telomeri e loci genici

HCR-DNA FISH: Una tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare il DNA virale nelle cellule infette