Este protocolo se puede utilizar para evaluar las uniones al nucleoesqueleto en lugar de utilizar la secuenciación DamID, y es un ensayo de una sola célula. La principal ventaja de usar este método es que es rentable y de fácil acceso. Puede resaltar diferencias funcionales entre genes y cromosomas que normalmente no ocurren con otras técnicas de visualización.
Las organizaciones espaciales y funcionales dentro del genoma en las células tratadas de cáncer y progeria y las diferencias genómicas de comportamiento en las células senescentes se pueden evaluar utilizando este protocolo. Este método se puede aplicar a cualquier tipo de célula o tejido a lo largo de la vida y de cualquier enfermedad. También se puede utilizar en organismos modelo donde hay sondas disponibles.
Para comenzar, prepare 500 mililitros de ácido clorhídrico al 10% y viértalo en un vaso de precipitados grande. Deje caer los portaobjetos de microscopio individualmente en el ácido e incubarlos durante una hora a temperatura ambiente en un agitador ajustado a dos G.Decantar el ácido del vaso de precipitados y lavar los portaobjetos 10 veces en agua del grifo. Luego otras 10 veces en agua desionizada.
Enjuague los portaobjetos en metanol dos veces y manténgalos en metanol hasta la esterilización. Coloque los portaobjetos sobre una toalla de papel para que se sequen y envuélvalos en papel de aluminio para su esterilización en un autoclave u horno caliente. Cultive células en el medio apropiado con suero durante al menos 48 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que se alcance una confluencia del 60 al 70%.
Recolecte cada tipo de célula y cuente las células con un hemocitómetro. Sembrar una vez 10 a las cinco celdas en 10 mililitros de medio por portaobjetos. Retire de la incubadora la placa de cultivo que contiene los portaobjetos y las células adheridas.
Deseche el medio y etiquete las diapositivas con un lápiz. Luego colóquelos en un frasco de coplin que contenga 50 mililitros de tampón citoesqueleto helado. Incubar el frasco durante 15 minutos en hielo o a cuatro grados centígrados.
Deseche el tampón del citoesqueleto y enjuague rápidamente los portaobjetos en 50 mililitros de tampón de halo de ADN de una sola vez tres veces sumergiéndolos en un frasco de coplin con el tampón. Transfiera los portaobjetos a un frasco de coplin que contenga 50 mililitros de tampón de extracción e incube durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Luego, incube consecutivamente las diapositivas en 50 mililitros de 10 veces, cinco veces, dos veces y una vez tampón de halo de ADN durante un minuto cada una.
Cuando termine, sumerja las diapositivas a través de una serie secuencial de etanol de 10, 30, 70 y 95% de etanol. Tome las diapositivas a través de una serie secuencial de etanol de 50 mililitros de 70, 90 y 100% de etanol durante cinco minutos cada una. Sécalos al aire en un plato de calentamiento.
Luego hornee en un horno de 70 grados centígrados durante cinco minutos. Desnaturalice los portaobjetos colocándolos en una solución de SSC al 70% dos veces durante dos minutos a 70 grados centígrados. Coloque los portaobjetos desnaturalizados en 50 mililitros de etanol helado al 70% durante cinco minutos.
Luego muévalos a través de una serie de etanol de 90, 95 y 100% a temperatura ambiente durante cinco minutos cada uno. Cuando termine, seque al aire las diapositivas en una placa de calentamiento. Desnaturalice las sondas de ADN a 75 grados centígrados durante 10 minutos en un bloque caliente o baño de agua.
Luego incubarlos a 37 grados centígrados durante 30 minutos antes de pipetear 10 microlitros en el portaobjetos apropiado. Superponga la sonda con un cubreobjetos de 21 por 21 milímetros y séllela con cemento de goma. Incubar los portaobjetos durante un mínimo de 18 horas a 37 grados centígrados en una cámara de hibridación humidificada.
Después de la incubación, retire con cuidado el cemento de goma con fórceps. Luego incubar los portaobjetos en 50 mililitros de formamida al 50% dos veces la solución SSC a pH siete que se ha precalentado a 45 grados centígrados durante tres incubaciones de cinco minutos. A continuación, coloque los portaobjetos en 50 mililitros de 0,1 veces la solución SSC que se ha precalentado a 60 grados centígrados, pero se coloca en un baño de agua de 45 grados centígrados.
Incubar durante cinco minutos y reemplazar el tampón dos veces para incubaciones de cinco minutos. Coloque los portaobjetos en un frasco de coplin que contenga 50 mililitros de solución cuatro veces SSC a temperatura ambiente e incube durante 15 minutos con tres cambios de tampón. Para evitar la unión de anticuerpos no específicos, aplique 100 microlitros de solución de SSC al 4% BSA cuatro veces a cada portaobjetos y superpóngalo con un trozo de película de parafina.
Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego incubar los portaobjetos con 100 microlitros de estreptavidina Cy3 diluidos uno en 200 durante una hora a temperatura ambiente para detectar la sonda etiquetada. Coloque los portaobjetos en un frasco de coplin que contenga 50 mililitros de solución cuatro veces SSC a temperatura ambiente e incube durante 15 minutos con tres cambios de tampón.
Monte las guías en 20 microlitros de una solución de montaje que contiene DAPI y superponga con un cubreobjetos de 22 por 50 milímetros. Visualice los halos de ADN y los territorios cromosómicos utilizando un microscopio de epifluorescencia con un objetivo de aceite 100X. La preparación del halo de ADN permite ver el borde de un núcleo residual, el ADN que queda dentro del núcleo residual y el ADN no unido que se ha enrollado en el área circundante.
Los halos de ADN de fibroblastos dérmicos humanos proliferantes se crearon a partir de células con BRDU incorporada y posteriormente se tiñeron con anticuerpos anti-BRDU. Las células proliferantes fueron positivas para BRDU y anti-pKi-67. Este protocolo se utilizó para visualizar territorios cromosómicos dentro de los halos de ADN.
Los cromosomas individuales se marcaron con sondas específicas de pintura de cromosomas de brazo entero para los cromosomas 1, 13, 17 y 18. Anti-pKi-67 se utilizó para marcar células en proliferación y su ausencia dentro del mismo cultivo. Aquí se muestran preparaciones de halo de ADN con telómeros en verde.
Es posible observar la proporción de telómeros en el halo de ADN, particularmente en la imagen del experimento dos. El porcentaje medio de telómeros fue de aproximadamente el 17% en las células quiescentes. Se detectaron diferencias en la unión cromosómica en fibroblastos de control primario y en células enfermas con síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford típico y atípico, que expresan una isoforma Sun1 diferente y ninguna mutación de Lamin A.
Los cromosomas uno y 13 muestran diferencias estadísticamente significativas en su unión dentro de los núcleos residuales en comparación con los halos de ADN controlados. La posición de todo el territorio cromosómico se correlacionó con el núcleo residual y el halo de ADN. Al intentar este protocolo, asegúrese de que las células se siembran con la densidad correcta y se extraen en el momento adecuado.
Después de este procedimiento, se puede realizar inmunofluorescencia indirecta y ARN FISH.
