We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Die Gewebe Dissection und Fixation (60 min) <ol><li> Für Drosophila Gehirn legen 3. Larvenstadium in einem Tropfen 1x PBS (phosphatgepufferte Salzlösung). Wählen Sie große 3. Larvenstadium, die aktiv kriechen aus Ampullen oder Flaschen, die nicht überfüllt sind. <ol><li> Verwenden Sie einen ultrafeinen Pinzettenpaar zu halten den Mund Haken und andere Pinzettenpaar zu greifen zwei Drittel über die gesamte Länge des Körpers (1A, B) zu greifen. Ziehen Sie vorsichtig an den Mund Haken, um das Gehirn, ventralen Ganglien, Speicheldrüsen und ein Teil der Larvenverdauungstrakt aus. Mit der Pinzette, um das Gehirn und ventralen ganglia trennen (1A, B) von den anderen Geweben und in einem Tröpfchen 1x PBT (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Tween) auf einer Kunststoff-Petriplatte. </li></ol></li><li> Für Nasonia Hoden Dissektionen, wählen Männchen 3 Tage alten Puppen (gelber Körper mit roten Augen). Männlich Nasonia haben kleine Flügelblocklängen in Bezug auf females im Puppenstadium (1C). <ol><li> Halten Sie die Puppe an der Spitze des Bauches in der Nähe des Brustbereich mit einer Pinzette Paar, und mit dem anderen Paar Pinzette, greifen die sehr distalen Spitze des Bauches, und ziehen Sie die tropfenförmigen Hoden (sie werden von Fett umgeben sein Körper, die leicht geschüttelt werden kann weg; 1D). Trennen Sie alle Karosserieaußenteile aus den Hoden, die richtige Quetschen, und in einem Tropfen 1x PBT auf einer Kunststoffpetrischale verhindert. </li></ol></li><li> Für jede Folie, sezieren insgesamt vier oder fünf Gewebeproben (dh., Drosophila Larven Gehirn oder Nasonia Hoden). HINWEIS: Mehr als fünf Proben werden überfüllt Kerne und Chromosomen führen. </li><li> Optional, einige Trennung von Schwesterchromatiden in euchromatischen Regionen der mitotischen Chromosomen erreichen, behandeln das Gewebe mit einer hypotonischen Lösung: Transfer Gehirne von 1x PBT einem Rückgang von 0,5% Natriumcitrat 5-10 (nicht mehr als 10) min. HINWEIS: Colchicin (a Mitoseinhibitor) kann hilfreich für die Erhöhung der Anzahl von Mitosen auf Metaphase 11 sein. Jedoch ist seine Verwendung nicht erforderlich, wenn sehr große gesunde Larven werden verwendet, und sogar unerwünscht, da sie sich negativ auf das Chromosom Auflösung, Ausbreiten und Morphologie. </li><li> Platzieren eines Tröpfchens (~ 20 &amp; mgr; l) der Fixierungslösung (2,5% Paraformaldehyd in 45% Essigsäure) auf die Oberfläche einer sauberen Sigmacote behandelten Deckgläschen. HINWEIS: Stellen Sie Fixierlösung frisch für jeden Tag der Nutzung. Fixative Lösungen, die 1,8 bis 3,7% Paraformaldehyd in 45% Essigsäure die besten Ergebnisse für die Fische. Die Verwendung anderer als Verstand oder Hoden Gewebe oder Anpassung dieses Protokoll für Immuno-FISH kann verlangen, das Experimentieren mit verschiedenen Fixiermitteln (für eine Liste von verschiedenen Fixiermittel, siehe 12). </li><li> Jede Gewebeprobe aus dem Seziersaal Puffers (1x PBT) vorsichtig in die Fixierungstropfens über mit ultrafeinen Pinzette, minimizing die Übertragung von Sezieren Puffer in die Fixierlösung. Positionieren der Gewebeproben, so dass sie gleichmäßig voneinander im Fixiermittel Tröpfchen beabstandet. Das Gewebe in Fixativ Inkubieren für 4 min bei Raumtemperatur. </li><li> Vorsichtig ein Poly-Lysin-beschichteten Objektträger nach unten, auf das Gewebe und Deckglas. Nicht nach unten drücken zu diesem Zeitpunkt nicht, sondern ermöglichen die beiden auf die leichte Schulter zu kontaktieren, damit das Deckglas klebt an der Unterseite des Schlittens. Kehren Sie die Rutsche so dass das Deckglas nach oben zeigt. </li><li> Sandwich die Folie / Gewebe / Deckglas in einem gefalteten Stück Filterpapier. Auf eine stabile Oberfläche, mit dem Daumen drücken ganz fest gerade nach unten auf die Position direkt über dem Deckglas. Achten Sie darauf, seitliche Verrutschen des Deckglases (dies führt dazu, dass ein Verschmieren des Gewebes). </li><li> Tauchen Sie den Schiebe / Gewebe / Deckglas in flüssigen Stickstoff (siehe Gerät in 1E, F), und stehen lassen, bis die Stickstoff stoppt Kochen (mehr ist fin). Entfernen Sie die Folie und sofort abknicken das Deckglas mit einer frischen Rasierklinge über einen Schiebe Ecke des Deckglas nach oben (nicht zerkratzt fixiertem Gewebe mit der Rasierklinge). <ol><li> Vorkühlung des Schiebe- / Gewebe / Deckglas auf einem Block von Trockeneis, Abdeckung nach oben rutschen, für 1-2 Minuten vor dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff wird verhindert, dass die Folien vor dem Knacken. </li></ol></li><li> Sofort den Objektträger mit Gewebe in eine Coplin-Gefäß mit 100% Ethanol bei Raumtemperatur gefüllt und lassen Sie stehen für mindestens 5 min (diese Zeit kann länger sein, wenn erforderlich). HINWEIS: kaltem 100% Ethanol ebenfalls verwendet werden könnten. </li><li> Entfernen Sie die Folie mit dem Gewebe, Docht überschüssige Ethanol mit einem Kimwipe (ohne Berührung der festen Gewebe), und lassen Sie die Folie an der Luft trocknen für 1 Stunde. <ol><li> Gehen Sie direkt zu Schritt 2 oder Folien halten trocken in geringer Luftfeuchtigkeit Luft oder in einer Trocknungskammer für Wochen, sogar Monate vor der Durchführung der Hybridisierung. </li></ol></li></ol> Abbildung 1: (A) A 3. Larvenstadium Drosophila Larve (rechts), mit Positionen, wo die Mundhaken greifen angezeigt (gekennzeichnet mit *) und 2/3 der Weg nach unten die Larven Gehirn sezieren; (Links) eine schematische Darstellung einer Larve eine der gleichen Entwicklungsstufe, der Darstellung der relativen Position des Gehirns im Larvenkopf. (B) Das Gehirn und ventralen Ganglien von einem 3. Larvenstadium Drosophila Larve (rechts) und eine schematische Darstellung dieses seziert Gewebe (links). (C) 3 Tage alten Nasonia Puppe an der Gelbkörper-Rote-Augen-Bühne. (D) Ein Paar Hoden von einem 3 Tage alten Nasonia männlichen Puppe (rechts) seziert mit Positionen anzeigt, wo die Puppe greifen am hinteren Teil des Abdomens (bezeichnet mit einem *) und in der Mitte auf dem Körper; (Links) Schema, männlich und weiblich warp Puppen; männliche Puppen durch Flügel, die nicht an der sagittalen Profil (schwarzer Pfeil) erstrecken, im Gegensatz zu den Weibchen, die Flügel, die hinter dem Profil erstrecken unterschieden werden; die relative Position des Hodens Paar wird im männlichen Puppe (E) Das Gerät-ein String von Büroklammern-und (F) Verfahren verwendet werden, um Folien in einem Behälter mit flüssigem Stickstoff getaucht gezeigt.. Mehrere Büroklammer-Strings können zur gleichzeitigen Eintauchen der mehrere Folien verwendet werden. 2. In situ-Hybridisierung (30 min am Tag 1; 1 h &amp; ndash; 2,5 h bei langen Sonden-am Tag 2) <ol><li> 1 ul (100 ng) jeder Sonde zu 20 ul 1,1x Hybridisierungspuffer. Pipettensonde / Hybridisierungspuffer auf die Oberfläche der festen Gewebe (berühren Sie nicht die Gewebe). </li><li> Vorsichtig ein Deckglas direkt auf die Sonde / Hybridisierungspuffer, um sicherzustellen, dass das Deckglas wird direkt über das Gewebe zentriert. Der Puffer sollte die Migration zu thE äußeren Rand des Deckglases, so dass keine Luftblasen. HINWEIS: Kleine Blasen, die nicht in Verbindung treten Gewebe keine Probleme mit dem Verfahren stellen. Entfernen Sie große Blasen durch vorsichtiges Anheben einer Ecke des Deckglases und sorgfältig fallen sie zurück auf die Folie. </li><li> Legen Sie das Dia / Gewebe / Deckglas auf die Oberfläche eines Blocks zu 95 ° C vorgewärmt (Deckglas nach oben). Deckel mit einem großen Stück Alufolie auf Belichtung zu verhindern. Lassen der Schieber Inkubieren bei 95 ° C für 5 min. HINWEIS: Eine typische Wärmeblock mit Bohrungen für Rohre können umgedreht werden, um eine ebene Fläche, auf der die Folie / Gewebe / Deckglas legen werden. </li><li> Entfernen Sie die Folie und lassen ihn etwas abkühlen lassen, bis es warm anfühlen wird. Ein Stück Parafilm gestreckt sorgfältig einzuwickeln um das Deckglas, um die Flüssigkeit unter ihm zu versiegeln. </li><li> Das verschlossene Rutsche in einer feuchten Kammer und legen Sie die Kammer in einem Inkubator auf 30 ° C vorgewärmt. Inkubiere bei 30 ° C für 4 h bis über Nacht.<ol><li> Erstellen Sie eine Feuchtigkeitskammer von einer leeren Spitze Box oder Deckeltupperdose mit angefeuchteten Kimwipes oder Papiertücher an der Unterseite angebracht. HINWEIS: Einzelstrang-DNA-Oligo-Sonden wurden für 28-33 Basen, um eine theoretische Schmelztemperatur (T m) von 45-47 ° C zu erreichen. Diese Länge und T m Bereiche spiegeln die Tatsache wider, dass viele repetitive Sequenzen, die wir studiert haben, sind AT-reichen und damit sehr niedrige GC-Gehalt. Längere Sonden werden wahrscheinlich höhere T m -Werte; Diese können erhöhte Hintergrund-Hybridisierung auf dem Standard-Hybridisierungstemperatur von 30 ° C führen. So können einige Fehlersuche mit Hybridisierungstemperaturen erforderlich, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Um die beste Hybridisierungstemperatur, Zunahme (oder Abnahme) die Temperatur um 5 ° C zu finden, inkrementell. </li></ol></li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Parafilm von der Folie und dann vorsichtig die Deckglas durch langsames Anheben einer Ecke. Wash der Schlitten drei Mal für je 15 min in 0,1 × SSC Waschpuffer. Decken Sie die Coplin-Gefäß mit Aluminiumfolie in den Waschanlagen, um Belichtung zu minimieren. </li><li> Wenn nicht mit einem langen biotinylierte Sonde, fahren Sie mit Schritt 2.8. <ol><li> Wenn Sie eine lange biotinylierte Sonde, trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einer Kimwipe, man aufpassen, das Gewebe selbst nicht zu berühren. Zeigen 100 l Blocking-Lösung über das Gewebe und die Abdeckung vorsichtig mit einem Deckglas, wobei darauf zu Fangblasen zu vermeiden. Wickeln Sie die Folie über das Deckglas mit Parafilm und bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und tupfen um das Gewebe mit einer Kimwipe. Je 100 &amp; mgr; l von Rhodamin-Avidin, 1: 1000 in SBT über das Gewebe und die Abdeckung vorsichtig mit einem Deckglas, wobei darauf zu achten Fangblasen. Wickeln Sie die Folie über das Deckglas mit Parafilm und bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und waschen Sie die Folie 3 Mal für jeweils 5 min in 4x SSCT- und dann3-mal für jeweils 5 min in 0,1 x SSC. HINWEIS: Folien können für längere Zeiträume gewaschen werden. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Folie und tupfen um das Gewebe mit einem trockenen Kimwipe um überschüssige Puffer zu entfernen (berühren Sie nicht die Gewebe). Stellen Sie den Schiebegewebeseite nach oben an einem dunklen Ort für 10-15 Minuten oder bis die Feuchtigkeit vollständig verflüchtigt. </li><li> Pipette 11 ul Vectashield Befestigungsmediums (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol-DAPI) auf das Gewebe. Vorsichtig ein sauberes Deckglas (nicht mit Sigmacote behandelt) direkt über der Mitte des Montagemedium und Gewebe. Die Einschlussmittel sollte langsam nach außen zu den Kanten des Deckglases zu migrieren. HINWEIS: Wenn die Montagemedium ausfällt, um die Kante des Deckglases an allen Seiten zu erreichen, wird eine zusätzliche 1-2 ul Befestigungsmedium kann mit einer Position am Rand des Deckglases aufgebracht, um in der benötigten Volumen füllen. In diesem Fall müssen Sie wischen Sie überschüssiges Medium aus der Gleitfläche vorAbdichtung. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit Nagellack. Vermeiden Sie die Malerei der Nagellack über die Gewebeprobe. </li><li> Den Objektträger aufrecht an einem dunklen Ort und lassen Sie den trockenen Nagellack bis zur vollständigen Fest (in der Regel 30 Minuten oder mehr). An dieser Stelle Bild das Gewebe oder bei -20 ° C für bis zu 1 Woche für die spätere Bildgebung. </li></ol> Buffer / Lösung Rezepte 10x PBS <ul><li> 80 g NaCl </li><li> 2,0 g KCl </li><li> 14,4 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g KH 2 PO 4 </li><li> pH auf 7,4, H 2 O auf 1 l </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml 10x PBS </li><li> 45 ml H 2 O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g NaCl </li><li> 88,2 g Na-Citrat </li><li> in 800 ml H 2 O </li><li> pH-Wert auf 7, H 2 O auf 1 l </li></ul> 4x SSCT- <ul><li> 200 ml 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 0,1x SSC <ul><li> 5 ml 20x SSC </li><li> 995 ml H 2 O </li></ul> Hybridisierungsmischung (20 &amp; mgr; l; ab 11 modifiziert) <ul><li> 10 ul Formamid </li><li> 4 ul 50% Dextransulfat </li><li> 2 ul 20x SSC </li><li> 4 &amp; mgr; l H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 0,01 g Rinderserumalbumin (BSA) </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 7,9 ml H 2 O </li></ul> Blockierungslösung 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g BSA </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 8 ml H 2 O </li></ul> Fixierlösung mit Paraformaldehyd (1 ml) <ul><li> 393,75 ul H 2 O (Wasser hinzufügen zuerst) </li><li> 450 ul Eisessig </li><li> 156,25 &amp; mgr; l 16% igem Paraformaldehyd </li></ul>

<ol>
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H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSR+(paternal+sex+ratio)+chromosomes:+the+ultimate+selfish+genetic+elements.">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

DNA ISH wird häufig verwendet, um spezifische Sequenzen auf Chromosomen kartieren. Wir haben ein einfaches Verfahren zur DNA ISH für hohe Kopienzahl, hetero Sequenzen optimiert beschrieben. Anstatt mit Waschungen in einem Formamid-Lösung, die eine Anforderung in anderen vorhandenen DNA ISH Protokolle ist, legen wir gewebe Dias direkt auf einen vorgeheizten Block an DNA zu denaturieren. Dieses Verfahren umgeht die Verwendung von großen Mengen an Formamid. Ein wichtiger Schritt für die Herstellung von klaren Hybridis...

DNA in situ Hybridisierung (ISH DNA) ist ein häufig verwendetes Verfahren zum Abbilden von Sequenzen an spezifischen Chromosomenregionen. Sonden an einzelne Kopie Regionen innerhalb Euchromatin kann durch eine Handvoll von Ansätzen, darunter Nick-Translation oder Endmarkierung langer DNA-Produkte 1,2 und den Einbau von deoxygenin (DIG) -attached Nukleotide und ihre Anerkennung durch eine Vielzahl von erzeugt werden Gruppe-konjugierte Antikörper 1-3. Visualisierung der euchromatischen Sequenzen in wenigen oder einzelnen Kopienzahl erfordert die Verwendung von entweder einzelne große Sonden mit hoher spezifischer Aktivität oder einen Cocktail aus mehreren, kleineren Sonden, die gemeinsam zu verbessern Signal. Im Gegensatz dazu hoch repetitive Sequenzen in heterochromatin gefunden, wie Satelliten-DNAs, sind leichter Ziele für DNA ISH weil sie existieren normalerweise als zehn bis Tausende von Wiederholungen im einzelnen Chromosomenregionen als Blöcke bekannt geclustert. Transposons können auchbei hohen Kopienzahlen an bestimmten chromosomalen Loci 2 gefunden. In diesen Fällen können einzelne Sonden mit geringer spezifischer Aktivität effektiv beschriften hetero Sequenzen aufgrund ihrer Hybridisierung an mehreren Standorten. Sonden an repetitive Sequenzen können im Handel als kurze Oligonukleotide (30-50 bp) synthetisiert und mit einer der mehreren verschiedenen fluoreszierenden Gruppen chemisch konjugiert. Mapping repetitiven Sequenzen im Heterochromatin durch Verwendung genom Sequenziertechnologien ist schwierig aufgrund der Herausforderungen im Gebäude Gerüste in stark repetitiven Satelliten Blöcke 4-6,7 gestoßen. Derzeit steht ISH als die effektivste Möglichkeit, die Zuordnung dieser Sequenzen am Unterchromosomenebene. Diese Strategie ist wichtig für die Zuordnung einer großen Anzahl von repetitiven Sequenzen, die von laufenden Genom und Transkriptom-Sequenzierung Studien aufgedeckt werden. Die Effizienz und einfache Zuordnung repetitiven Sequenzen auf Objektträger angebrachten Chromosomen würde gre werdenatly durch ein vereinfachtes Protokoll für DNA ISH verbessert. So können bereits vorhandene Protokolle für DNA ISH beinhalten mehrere Wäschen hybridisiert Gewebe in Formamid-Lösung 2,8, somit im wesentlichen auf die erforderliche Zeit für die Zuordnung von Sequenzen hinzufügen und auch große Mengen chemischen Abfalls für diese teuren Reagenz. Hier beschreiben wir eine geänderte DNA ISH Verfahren, das die Notwendigkeit für Formamid Wäschen umgeht und setzt grundlegende Laborgeräten und Reagenzien. Dieses Verfahren wurde ursprünglich für die rasche Kartierung hoch repetitive DNA-Sequenzen in heterochromatischen Regionen Drosophila Larvenneuroblasten mit handels synthetisierte Oligonukleotide, die mit Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert sind entworfen. Allerdings funktioniert diese Methode auch für die Abbildung repetitiven Sequenzen durch den Einsatz größerer Sonden durch andere Mittel 9,10 und über mehrere verschiedene Gewebe und Chromosomentypen synthetisiert. Zusätzlich kann dieses Verfahren verwendet werden, um euchromatic Sequenzen mithilfe länger oder multip abzubildenle, kurze Sonden innerhalb der euchromatischen Sequenz von Interesse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:285px;"></td>
			<td style="width:257px;">Company</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Materials&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ultrafine tweezers (5 gauge)</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sigmacote</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Filter paper (75-150mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin wax paper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat block with thermometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dry incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Razor blades</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coplin jars (with slide grooves)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aluminum foil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nail polish (clear or colored)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-20 &#956;L micropipette and plastic tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">20-25 standard metal paperclips linked to form a chain</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td>Company/Notes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">16% EM grade paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">100% Ethanol, chemical grade</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)</td>
			<td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)</td>
			<td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hybridization buffer</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">0.1X SSC (Saline-sodium citrate)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Blocking solution</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

DNA in situ Hybridisierung (ISH DNA) ist ein häufig verwendetes Verfahren zum Abbilden von Sequenzen an spezifischen Chromosomenregionen. Dieser Ansatz ist besonders effektiv bei der Kartierung hoch repetitive Sequenzen an heterochromatischen Regionen, in denen Rechenansätze gegen prohibitiv Herausforderungen. Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für DNA ISH, die Formamid wäscht die Standardschritte in anderen DNA ISH Protokolle umgeht. Unser Protokoll zur Hybridisierung mit kurzen Einzelstrang-DNA-Sonden, die Fluoreszenzfarbstoffe, die effektiv zu markieren repetitive DNA-Sequenzen in hetero chromosomalen Regionen in einer Anzahl verschiedener Insektengewebetypen durch optimiert. Jedoch können Anwendungen erweitert werden, um mit größeren Sonden und Visualisierung von Einzelkopie (nicht-wiederkehrende) DNA-Sequenzen zu verwenden. Wir zeigen, diese Methode durch die Abbildung verschiedene repetitive Sequenzen zu gequetscht Chromosomen von Drosophila melanogaster Nervenzellen und Nasoniavitripennis Spermatozyten. Wir zeigen Hybridisierungsmuster für beide klein, kommerziell synthetisiert Sonden und für eine größere Sonde zum Vergleich. Bei diesem Verfahren wird einfach Laborbedarf und Reagenzien, und ist ideal für Ermittler, die wenig Erfahrung mit der Durchführung DNA ISH haben.

Um dieses Verfahren zu demonstrieren, hybridisierten wir eine Reihe von kleinen kommerziell synthetisiert Oligos, die chemisch mit Fluoreszenz-Konjugate (Abbildung 2) und einem längeren biotinylierte Sonde verändert wurden (durch Nick-Translation eines PCR-Produktes hergestellt; 2B), um die Chromosomen aus verschiedenen Gewebe Typen (siehe Tabelle 1). Die Zielsequenzen enthalten Satelliten-Wiederholungen in pericentromeric (Heterochromatin) Regionen der mitotischen Ch...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

18.0K Aufrufe.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Serie: Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Forschung

Biologie

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung für Formalin fixiert Nierengewebe

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Eine ganze Berg<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierungsverfahren für die Gastropod Mollusc<em&gt; Spitzschlammschnecke</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...