We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

1. Cryo-titular de Preparación y Mantenimiento NOTA: La estación de bombeo seco, que consiste en una estación de bombeo turbo y uno o más controladores de la etapa de frío, se utiliza principalmente para tres propósitos: a) Se trata de un lugar seguro para guardar los titulares crio cuando no se están utilizando. La forma correcta de almacenar los titulares es dejarlos en la estación al vacío. b) Para evaporar la escarcha y humedad acumulación que se produce cuando el nitrógeno líquido se retira del dewar y la punta del soporte de crio está expuesto; esto se logra con el ciclo de calentamiento. c) Para regenerar el desecante de zeolita, y para lograr un alto vacío en los termos cryoholder. Esto es necesario para mantener una temperatura constante cuando se hace microscopía electrónica de crio. <ol><li> Ciclo de calentamiento. <ol><li> Insertar el soporte crio en uno de los puertos de bombeo de la estación de bombeo. Conecte uno de los tubos de evacuación a la salida de metal debajo de la válvula de vacío del titular. Hacerasegurarse de que todas las válvulas en la estación (V1, V2, y V3) y en el soporte de crio están cerrados. </li><li> Encienda el controlador de fase fría y conéctelo al titular a través del cable de control. Encienda el interruptor de alimentación de la estación de bombeo turbo. </li><li> Inicie la opción de ciclo de calentamiento en el controlador de fase fría. Cuando el vacío en la estación de bombeo turbo lee 10 -3 Torr o mejor, abrir la válvula V2 mariposa, espere hasta que el vacío se estabiliza, y abra la válvula V1 mariposa. </li><li> Ejecute el ciclo de calentamiento para alrededor de 30 minutos hasta que la temperatura en el soporte es estable por encima de 20 ° C. Cerrar V1 y, a continuación, detener el ciclo. </li></ol></li><li> Ciclo de zeolita. Ejecute el ciclo de Zeolita Entre 4 horas y O / N Antes de que un cryoEM período de sesiones, y una vez por semana si no se utiliza. <ol><li> Iniciar la opción de ciclo de zeolita y seleccionar el tiempo necesario para alcanzar un buen vacío, en el intervalo de 1-2 x 10 -4 Torr, y por lo tanto a largo tiempo de retención. Cuando el vacío alcanza el 10 -3Torr, abra la válvula de evacuación Dewar, V3. La estación de bombeo entonces evacuar la línea para el titular; espere hasta que el vacío se estabilice. </li><li> Abra la válvula de la titular de la crio. Cuando se complete el ciclo, cierre las válvulas en el orden inverso en que fueron abiertos, la válvula en el soporte, entonces V3, V2, y finalmente V1. Apague la estación de bombeo turbo y el controlador de fase fría, y desconecte el titular de la crio desde el controlador de fase fría y la estación de bombeo turbo. </li></ol></li></ol> 2. preparación de la cuadrícula <ol><li> Limpieza. NOTA: Al utilizar rejillas perforadas comerciales, se recomienda limpiar antes de su uso, con el fin de eliminar cualquier polímero residual que se utilizó en el proceso de fabricación. Haga esto en una placa de Petri de vidrio con 5 capas de papel de filtro establecidos en la parte inferior. <ol><li> Coloque las rejillas en el papel de filtro con el lado de carbono holey hacia arriba. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, mojar el papel con varias gotas of cloroformo alrededor de las rejillas hasta que acaba de empezar flotante. </li><li> Cubra la placa de Petri con la tapa ligeramente abierta en una campana extractora O / N. </li></ol></li><li> NOTA: el soporte de carbono fina (pasos 2.2 a 2.3) se puede omitir como la capa de hielo puede formarse directamente a través de los pequeños orificios en la rejilla de carbono holey. <ol><li> Con un par de pinzas, escindir un pedazo de mica para exponer dos nuevas superficies. Coloque las nuevas superficies expuestas de mica boca arriba en un trozo de papel blanco en una placa de Petri. </li><li> Coloque la placa de Petri en la campana de un evaporador de carbono. Iniciar la secuencia de bomba hasta que el vacío es inferior a 2 x 10 -6 Torr. Para evaporar cualquier impureza en la superficie de la barra de carbón, realizar una pre-evaporación con el plato Petri cubierta. Luego transmitirá la campana y retire la cubierta de la placa de Petri. </li><li> Realizar la secuencia de la bomba hacia abajo hasta que el vacío es inferior a 10 -6 Torr y la capa de mica con una capa delgada (~ 5 nm) de carbono. Utilice protección para los ojos durante carbonoevaporación. Supervisar el espesor de la película de carbono por la oscuridad resultante en el papel que había sido colocado bajo las láminas de mica. </li></ol></li><li> Transferir el fina de carbono a la TEM cuadrícula. <ol><li> Cortar una pieza de 0,5 x 1 cm de mica recubierta y flotar el carbono fuera sobre la superficie plana de agua filtrada y desionizada. Utilice papel lente óptica para conseguir una superficie de agua plana. Usando las pinzas, coloque la cara de carbono holey de la red en contacto con la superficie superior de la capa de carbón flotante y recogerlo. </li><li> Repita los pasos 2.3.1 y 2.3.2 hasta que se preparó un número suficiente de rejillas. </li></ol></li><li> Descarga luminiscente. NOTA: La descarga luminiscente convierte la capa de recubrimiento de carbono naturalmente hidrófoba de las rejillas en hidrófila. Este paso es opcional. <ol><li> Coloque las rejillas con la cara de carbono hasta en un portaobjetos de vidrio 7,5 x 2,5 cm cubierto con Parafilm. Colócalo en la cámara de los equipos de descarga luminiscente y cerrar la cámara. </li><li> Bombala campana de vidrio y de descarga luminosa de 20 segundos a 25 mA y 7 x 10 -2 mbar. NOTA: Durante este tiempo un resplandor púrpura luz se hace visible. Retire la placa de vidrio con las rejillas y usarlos dentro de 1 hora, de lo contrario, tendrán que ser dado de alta de nuevo resplandor. </li></ol></li></ol> 3. Muestra Plunge-congelación NOTA: Utilice gafas de seguridad y calzado adecuado cuando se utiliza este instrumento para proteger contra las salpicaduras de nitrógeno y etano líquidos. <ol><li> Encienda el aparato de inmersión congelación. Llenar el depósito del humidificador con agua destilada. Ajuste la temperatura deseada, la humedad relativa y las condiciones de hundimiento para el tiempo de transferencia, la fuerza Blot y tiempo de adsorción (22 ° C, 95%, 2 seg, 2 y 40 segundos en el ejemplo presentado aquí). Coloque el nuevo filtro de papel secante. </li><li> Enfriar el recipiente de etano por llenar el depósito exterior con nitrógeno líquido hasta que se logre la estabilidad (aproximadamente 10 min). Una vez que el nitrógeno líquido se detiene boiling, coloque la punta del tubo que viene del tanque de etano en la cámara interior y abrir la válvula lentamente. Licuar el etano en la cámara interior y llenarlo hasta 1 mm de la parte superior. Evite congelar el etano. PRECAUCIÓN: etano es extremadamente inflamable y explosivo. </li><li> Asegúrese de que las pinzas están alineados dentro del aparato de congelación profunda. </li><li> Encienda la humedad. Cargar una rejilla sobre las pinzas, y cargar 3-5 l de la muestra en la superficie del carbón (lado opaco) de la red llena de agujeros. Espere a que la muestra para adsorber a la red y realizar la transferencia de lograr una capa líquida delgada. </li><li> Flash congelar la rejilla al sumergirse en el etano líquido. Retire el conjunto de pinzas de la red desde el etano líquido que sostiene las pinzas de manera constante, y transferirlo a la cámara exterior con nitrógeno líquido. Transferir la cuadrícula a un cuadro de cuadrícula pequeña inmerso en el nitrógeno líquido. Asegúrese de mantener la muestra vitrificada en nitrógeno líquido todo el tiempo durante la transferencia con el tanque de almacenamientoo para el soporte de crio. NOTA: cajas de la red se pueden almacenar en una gran capacidad (35-50 L) Dewar de nitrógeno líquido durante al menos 1 año. Para el almacenamiento conveniente que pueden ser colocados en un tubo Falcon de 50 ml con dos agujeros perforados en la parte superior y una línea de pesca unido a su tapa que se puede sacar de la boca de la dewar. </li></ol> 4. Transferir el Cryo-red para el TEM <ol><li> Inserte el soporte de la crio en la estación de trabajo crio-transferencia. Tenga cuidado de no dañar la punta del soporte durante la inserción. Verificar la presencia de pequeñas fibras y el polvo en la varilla y la junta tórica del titular crio usando una lupa, si hay alguna quitar con papel para lentes ópticos. </li><li> Llenar el dewar del titular de la crio y el recipiente de estación de trabajo con nitrógeno líquido. Evite derramar el nitrógeno líquido utilizando el embudo atrapado que viene con la estación de trabajo. </li><li> Conectar el soporte de crio al controlador etapa fría para controlar la temperatura, y seguir añadiendo nitrógeno líquido y #160; hasta que la temperatura se estabilice en torno a -194 ° C. Asegúrese de que el nivel de nitrógeno líquido es bajo el nivel de la junta de vacío tanto en la estación de trabajo y el vaso Dewar titular crio. Pre-enfriar las pinzas de rejilla, el cono de fijación y el extremo romo de la herramienta de anillo clip en la estación de trabajo. También pre-enfriar un conjunto de grandes pinzas y un destornillador en otro Dewar llena con nitrógeno líquido. </li><li> Transfiera rápidamente el cuadro de rejilla crio que contiene las rejillas hidratados congelados al nitrógeno líquido en la estación de trabajo utilizando las grandes pinzas. Abra el cuadro de rejilla crio con el destornillador, tome la rejilla hidratado congelado y colocarlo en la ranura soporte de muestra. </li><li> Coloque el anillo del clip en la parte superior de la parrilla y presione suavemente con el extremo romo de la herramienta clip de anillo hasta que se encaje firmemente en su lugar. Cierre la crio-obturador. Retire la caja de herramientas y la crio rejilla de la estación de trabajo. </li><li> Mover toda la estación de trabajo con soporte y red para la consola microscopio con el fin de mini-mizar el tiempo de transferencia de la red en aire de la habitación. </li><li> Rematar la TEM anti-contaminador con nitrógeno líquido, que había sido previamente llenada y enfriado durante al menos 20 min. Pre-inclinar la platina del microscopio a -60 °. NOTA: Esto minimizará la pérdida de nitrógeno líquido como el soporte se inserta en la esclusa de aire. </li><li> Comienza el ciclo de cámara de aire pre-bomba en el microscopio. Asegúrese de que la válvula para el cañón de electrones se cierra (especialmente si se trata de un TEM FEG). Espere a que la secuencia de la esclusa de aire pre-bomba para terminar (unos 2 minutos) antes de insertar el soporte crio. NOTA: Esto se indica con la luz roja en el escenario que se extingue. </li><li> Inserte el soporte en la esclusa de aire y girar 90 ° hacia la derecha; conecte el cable de frío controlador etapa a la titular de la crio para controlar la temperatura. Esperar otra vez hasta que se extinga la luz roja y girar tanto el escenario como el soporte de nuevo en la posición de 0 ° a insertar el soporte en hi del TEMla columna de vacío gh. </li><li> Asegúrese de que la temperatura nunca sube por encima de -160 ° C para evitar la formación de cristales de hielo. </li><li> Vuelva a llenar el termo del titular crio. Espere 15 a 45 minutos hasta que el titular haya equilibrado térmicamente y el vacío TEM se ha recuperado antes de grabar las imágenes. </li><li> Si se detecta de propagación del nitrógeno líquido, cambiar la altura de llenado de nitrógeno líquido, o tocar suavemente el origen burbujeo con un hisopo de algodón. </li></ol> 5. Las dosis bajas de Recolección de Datos NOTA: La técnica de recolección de datos en dosis bajas se utiliza para minimizar el daño de la radiación de electrones de la muestra mediante la limitación de la exposición a 20 electrones / a 2. Esto se logra por la alternancia entre tres configuraciones: &quot;Buscar&quot;, con bajo aumento (~ 5.000x) y amplio campo de visión, &quot;foco&quot;, con gran aumento (~ 150,000X) y pequeño campo de visión, y la &quot;exposición&quot;, con el Magni final deseadoficación y que contiene el área de interés para ser registrados. En blanco la viga en entre los modos. <ol><li> Configuración del Programa Las dosis bajas de TEM y <ol><li> Repliegue la crio-obturador y abrir las válvulas de columna. </li><li> Centre el escenario y establecer la altura eucéntrica (Z) con el wobbler alfa para el rock el escenario ± 15 °. Ajuste la posición Z hasta que no haya movimiento apreciable, mientras que el escenario está oscilando. Activar el programa de dosis baja y seleccione el detector para cada modo. </li><li> En el modo de exposición encontrar un área de la cuadrícula que no tiene carbono, ajustar la iluminación mediante la selección de la apertura del condensador y la mancha tamaño óptimo de modo que el área a ser grabada está totalmente iluminada. Asegúrese de difundir el haz en la dirección overcondensation. </li><li> En modo de búsqueda, encontrar un pequeño rasgo que será fácilmente identificable a mayor aumento. En el modo de exposición, centrar esta función con el joystick (el controlador etapa xy). Comience a menor magnificación si la hazañaUre no está en el campo de visión. </li><li> En el modo de búsqueda, llevar esta función para el centro del campo con las dosis bajas xy controles de desplazamiento de imagen. Ir a modo de exposición y mover la característica a lo largo de la inclinación del eje utilizando la palanca de mando hasta que esté fuera de la zona a grabar (0,5-3 micras). Ir a modo de enfocar y centrar la función utilizando los controles de desplazamiento de imagen xy. Comience con un aumento de más baja si la función no está en el campo de visión. </li><li> Mantenga el haz centrado en todo momento. </li></ol></li><li> Recolección de Datos <ol><li> Repliegue la crio-obturador y abrir las válvulas de columna. Active el programa de dosis baja. </li><li> En modo de búsqueda, identificar una cuadrícula que contiene, hielo homogénea delgada. </li><li> Seleccionar un agujero adecuado y colocarlo en el centro del campo. Cambiar al modo de enfocar y enfocar la imagen. Entonces underfocus la imagen entre 0,5 a 4,5 micras. </li><li> Cambie a modo de exposición y grabar la imagen. </li><li> Cambiar al modo de búsqueda y repita los pasos 5.2.3-5.2.4.Mover a través de la cuadrícula evitando pre-exposición de buenos agujeros que va a grabar. </li><li> Termine la cuadrícula y pasar a otra buena. </li><li> Vuelva a ajustar la altura (Z) y continuar la recopilación de datos. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

TEM seguido de SPA ha contribuido muchas estructuras 3D macromoleculares, acercándose a 2.000 entradas en el EMDB a mediados de 2014. En general, para una macromolécula dada, una estructura 3D de baja resolución se determina primero a partir de datos NS, que puede ser seguida por una de mayor estructura resolución cryoEM 3D. El alto contraste de los límites moleculares proporcionadas por NS, que facilita la primera reconstrucción 3D, es posteriormente refinado por cryoEM con su capacidad para mapear la estructura interna de la macromolécula en su estado completamente hidratado, y la posibilidad de alcanzar una resolución mucho mayor. Otra ventaja de cryoEM es la eliminación del estrés deshidratación que podría resultar en el colapso de la macromolécula. Además, existe la posibilidad de omitir el soporte de carbono, lo que elimina los efectos de absorción posible de la superficie y muestra la conformación que adopta la macromolécula en solución. Tinción Cryo-negativo, una combinación de cryoEM y NS, ofrece un alto contraste en una totalmente hydespécimen nominal y también puede conducir a la reconstrucción 3D usando SPA, sin embargo, ha sido utilizada con menos frecuencia, con menos de 10 entradas EMDB, en parte porque la propia mancha puede interferir con la integridad de la macromolécula 31. Otras dos técnicas TEM conducentes a la reconstrucción 3D son cristalografía de electrones 2D y tomografía electrónica. Cristalografía de electrones 2D requiere un cristal plano o tubular; difracción de electrones del cristal se utiliza para la reconstrucción 3D que podría dar lugar a la resolución atómica 32. En la tomografía de electrones de las muestras fijadas vitrificados o Tradicionalmente, un componente macromolécula o sub-celular se hace girar dentro de la TEM para la reconstrucción tomográfica posterior 33, con la ventaja de que los objetos singulares pueden ser reconstruidos; Sin embargo en la actualidad esta técnica tiene un límite de resolución que van de 40 a 20 Å 34,35. Entre todas estas técnicas moleculares TEM, SPA de NS y cryoEM datos ha sido el más ampliamenteutilizado. El protocolo se ilustra aquí se dedica a la obtención de imágenes cryoEM adecuados para el análisis de SPA; sin embargo, la mayor parte del protocolo es aplicable también a cryoEM de 2D cristales y muestras tomográficas. Una sesión cryoEM éxito depende del éxito combinado de muchos pasos críticos; aspectos importantes a tener en cuenta, la explicación de los artefactos cryoEM comunes y cómo evitarlos se describen en los siguientes párrafos. Esta sección también describe las directrices de recopilación de datos para obtener reconstrucciones en 3D de alta calidad utilizando el método de SPA. Evitar la transición a cristalino hielo. Un aspecto central es que la muestra necesita para mantenerse en el estado vítreo desde el momento de la crio-TEM hundiendo largo de observación. Así, después de sumergirse la muestra en etano líquido todas las etapas posteriores se realizan en nitrógeno líquido (-196 ° C) o helio líquido (-269 ° C) temperaturas. El calentamiento por encima de -135 ° C transforma el agua vítrea enal agua cristalina; entonces reordenamientos macromoleculares pueden tener lugar y los cristales de agua dominar la imagen (Figura 3); la muestra debe ser desechada. Accidental muestra de calentamiento podría ocurrir si la crio-hundimiento, la transferencia de la red congelado entre contenedores (incluso si está protegido por un gridBOX), y / o crio inserción soporte en el TEM son demasiado lentos, o si las pinzas de manipulación fueron insuficientemente pre- enfriado. Deterioro de vacío significativo en el TEM en la crio-transferencia (aire entrante las trampas muestra fría más caliente) también puede calentar la muestra. Finalmente, el exceso de irradiación de la muestra podría resultar también en la transición a cristalino hielo. Reducir al mínimo la contaminación de hielo. Dado el volumen de muestra pequeño (3-5 l) aplicada a la rejilla de TEM, la evaporación se podía concentrar los componentes del tampón (sales, detergentes) y por lo tanto afectar la integridad macromolecular incluyendo la pérdida de estado multimérico. Una alta humedad relativa (RH) microambiente o cámara eludirs este problema. Alternativamente crio-hundimiento se puede hacer en una habitación fría del medio ambiente suficientemente ventilado. Después de RH crio-hundiendo debe ser lo más bajo posible para evitar la contaminación de hielo, o la condensación de la humedad ambiental en el crio-rejilla, ya que la crio-rejilla sí mismo actúa como una trampa de frío. Contaminación del hielo consiste en partículas con alto contraste y sin subestructura con tamaños que oscilan entre ~ 5 nm y varias micras que interfieren con o incluso bloquean totalmente la imagen. Evite las corrientes de aire, hablar / respirar hacia la crio-red durante la transferencia de aire, y reducir la humedad relativa ambiente. Abrir los recipientes de nitrógeno líquido con agua condensada (visible en forma de partículas en suspensión blancos) también deben ser desechados. Maximizar orientaciones macromoleculares / puntos de vista. Para el apoyo de la muestra, una decisión que debe tomarse es entre las redes verdaderamente holey y fina de carbono sobre rejillas holey. Esto depende de (i) la forma en la muestra se extiende sobre película de carbón frente a los agujeros de carbono, (ii) conce muestra disponiblentration, como agujeros desnudas pueden requerir una concentración más alta que 100X soporte de carbono para una densidad de partícula similar en la imagen (de ~ 0,02 a 2 M), y (iii) cómo aleatoria es la distribución de orientaciones macromolécula. Tenga en cuenta que descarga luminiscente, que hace que el hidrófila de carbono, tendrá un efecto importante en los tres aspectos y que esto será dependiendo de la muestra. En cuanto a la orientación de la macromolécula, mientras que una visión recurrente es deseable para la determinación estructural inicial de la reconstrucción cónica azar, aleatoriedad de puntos de vista macromoleculares es deseable cuando se refina la reconstrucción 3D a resoluciones más altas. En nuestro ejemplo, RyR1 interactúa con el carbono con el fin favorito &quot;cuádruple &#39;(Figura 2D) y requiere rejillas perforadas para la aleatoriedad de las orientaciones y mayor resolución 36. Maximizar SNR. La mejor estrategia para aumentar la SNR es para reducir las fuentes de ruido de fondo. Excesiva de hieloespesor y (si la hay) de espesor de película de carbono más allá de lo que se necesita para apoyar e integrar la proteína añadirá ruido extra. Por lo tanto el espesor del hielo se debe reducir a la mínima necesaria mediante el control de secante tiempo, la presión, RH, y la calidad del papel de filtro. Para el soporte de carbono, un (~ 5 nm) de película fina de carbono se acoda sobre la película de carbono holey más grueso: el carbono holey gruesa proporciona la resistencia mecánica mientras que la muestra se forma la imagen sobre el agujero de carbono cubierto delgada. Por otro lado, tenga en cuenta que el hielo extremadamente delgada y / o de carbono puede resultar en un soporte fácil de romper que puede convertirse en una web (Figura 3D). Para maximizar la SNR, cualquiera de los componentes de amortiguamiento innecesarias deben ser evitados. Para las proteínas de membrana, el detergente tiene un peaje significativo en contraste (véase la Figura 2D, panel derecho). Además mediante la reducción de la tensión superficial del detergente cambia la forma en la que la muestra se extienda sobre el soporte. Algunas proteínas de membrana requieren la presencia de lípidos, además de detergent, lo que reduce aún más el contraste. Para superar esta La muestra puede ser diluida en un tampón con concentración de detergente inferior y sin lípido justo antes de la crio-37 hundiendo. Nuevos detergentes alternativos 16 y el uso de nanodiscos 38 para estabilizar el componente de dominio transmembrana parecen ser los enfoques eficaces para proteínas de membrana de formación de imágenes por cryoEM. Luchar por imágenes de alta calidad y se preparan para la corrección del FTL. Especímenes vitrificados requieren altos valores de desenfoque para generar suficientes imagen (fase) de contraste en el que el CTF, la función que relaciona la intensidad de la frecuencia, tiene varias transiciones cero, momento en el que no hay información. Mientras corrección CTF no es necesario para la reconstrucción 3D de baja resolución, para aspirar a una resolución más alta, para recuperar una representación exacta del objeto 3D, las imágenes con diferentes defoci necesario recopilar de manera que la corrección CTF computacional se puede hacer.Determinación CTF y la corrección se incluye en los principales paquetes de software SPA 4-7; detalles se pueden encontrar en otro lugar 39. Para la corrección óptima CTF, utilizar una gama de defoci. Una buena estrategia es alternar entre 3-4 valores de desenfoque. Los valores dependen del tamaño de la macromolécula (tamaños más grandes requieren menos desenfoque), el espesor del hielo / carbono (muestra más delgado requiere menos desenfoque), y la tensión (voltaje inferior requiere menos desenfoque). Para 200 kV, una buena gama de partida de los valores es de 2,5, 3, 3,5 y 4 micras desenfoque. El CTF se manifiesta como anillos de alta y baja intensidad alterna (Thon suena 40) en el espacio de representación recíproca, el espectro de potencia. Viendo el espectro de potencia permitirá conocer el potencial de resolución; la frecuencia de la mayor cantidad de anillo visible Thon es el más cercano una estimación a priori de la resolución alcanzable. El espectro de potencia se debe revisar periódicamente, y astigmatismo (no circular) anillos Thon (Figura 3C) debe ser corregido con la astigmador objetivo. Anillos Thon deben ser visibles por lo menos hasta la resolución deseada. Un conjunto de datos cryoEM obtenidos utilizando este protocolo puede ser procesado directamente por SPA a fin de generar una reconstrucción 3D. Incluso con una muestra ideal, la calidad de la reconstrucción 3D dependerá del rendimiento y especificaciones del equipo de TEM, y en el procesamiento de imágenes. Con las continuas mejoras en ambos frentes, y con mención especial a los detectores de electrones directas desarrolladas recientemente, la posibilidad de obtener reconstrucciones en 3D a resolución atómica de manera más consistente está más cerca de lo que ha sido nunca.

El objetivo de cryoEM es obtener imágenes microscópicas de electrones de macromoléculas en su estado hidratado nativo. En virtud de la incorporación de la macromolécula en agua vitrificada, una muestra congelada-hidratado se puede introducir y visualizar en el instrumento TEM directamente. La vitrificación, logrado por el flash de congelación (10.000 ° C / seg), se congela la muestra sin cristalización del agua y asegura que los reordenamientos moleculares durante la congelación son insignificantes. El exceso de dispersión de electrones de la muestra con respecto al tampón circundante ofrece una pequeña pero suficiente contraste para ver la macromolécula en ausencia de cualquier mancha 1. Procesamiento de imagen computarizada puede entonces ser usado para recrear la estructura 3D de la macromolécula. Macromoléculas grandes en el rango de ~ 500 kDa de múltiples muestras MDa son ideales para cryoEM (que representan más del 80% de la Microscopía Electrónica de Data Bank (EMDB) entradas); estos incluyen proteínas, complejos de proteínas, proteína-ácido nucleico complexes, y proteínas de membrana incorporadas en una bicapa. Estas macromoléculas son menos propensos a ser cristalizado (con menos del 2% en las entradas de la base de datos PDB), sin embargo, a menudo es el caso que las piezas más pequeñas resueltos por cristalografía de rayos X o RMN se pueden acoplar en el sobre 3D creado por cryoEM. Por otro lado, algunas de las estructuras más grandes que resuelve cryoEM son identificables dentro de la célula completa por sección delgada TEM 2. Por lo tanto, cryoEM salva efectivamente el tamaño y la resolución brecha entre las estructuras subcelulares y atómicas. CryoEM refleja mejor estructura nativa de la macromolécula que el método más clásico de tinción negativa (NS), donde la macromolécula es deshidratada y rodeado por una capa de tinción de metal pesado mediante el cual la región de la exclusión mancha crea una imagen fuertemente contrastado &quot;negativo&quot; 3. En ambos casos, el haz de electrones produce imágenes en 2D de proyección de las macromoléculas, llamados partículas, donde la shape depende de la orientación de la macromolécula con respecto al haz de electrones. Muchas partículas, al menos ~ 1000 y sin límite superior, se pueden analizar en el equipo con el &quot;análisis sola partícula &#39;(SPA) de software para aumentar la relación señal a ruido (SNR), aunque de promedio, y para encontrar los parámetros de orientación espacial de la partícula necesaria para recrear la estructura 3D de la macromolécula por volver proyección 4-7. NS, con mayor SNR, se utiliza para la caracterización preliminar de la muestra y para generar una reconstrucción de novo 3D; su resolución rara vez supera los 20 Å, que se impone por la deshidratación y el tamaño del grano del metal pesado. En general, para la determinación estructural cryoEM 3D, una reconstrucción 3D de baja resolución que se obtenga de NS y luego cryoEM se utiliza para refinar esta baja resolución mapa inicial para estudiar más a fondo la macromolécula en su estado hidratado nativo, para ver su estructura interna, y para aumentar su resolución. Note que si el modelo NS fue distorsionada (el ejemplo más común es el aplanamiento resultante de la deshidratación 8) y las partículas cryoEM tenido baja SNR, a continuación, la distorsión podría llevar en el modelo cryoEM (el artefacto modelo de sesgo, que es común en baja SNR conjuntos de datos 9). Distorsión estructural daría lugar a falta de coincidencia entre el NS y partículas primas cryoEM y entre las partículas cryoEM primas y proyecciones correspondientes del modelo 3D ortogonal a la dirección de aplanamiento. Modelo sesgo puede resolver por sí mismo como el modelo 3D se somete a ciclos de perfeccionamiento sucesivas. En caso de que no se produzca, que se detecta como la falta de correspondencia entre las partículas cryoEM primas y proyecciones correspondientes del modelo 3D, a continuación, un modelo de novo debería construirse a partir de los datos cryoEM. Un buen enfoque podría ser utilizar el algoritmo de la reconstitución angular 10, que puede producir varias posibles volúmenes 3D y, a continuación, utilizar el modelo NS 3D para seleccionar el mejor modelo posible cryoEMque se perfeccionarán 11. Una mejor estrategia es aumentar la SNR del conjunto de datos cryoEM (ver sección dedicada en la Discusión). La calidad bioquímica de la macromolécula purificada tiene una mayor influencia en el resultado final. La macromolécula, purificada a partir de tejido o expresado en sistemas heterólogos, debe tener un alto grado de pureza y ser estructuralmente intacto. Se tampoco debe formar agregados ni debe desglosar. Para definir una conformación particular, las condiciones de preparación deben promover un estado conformacional uniforme. Para estudiar complejos, lo óptimo es que su k D está en el rango nM, de lo contrario fijadores han sido utilizados con éxito para estabilizar interacciones de afinidad inferiores 12,13. Imágenes cryoEM no procesados ​​proporcionan información valiosa sobre las dimensiones, esquema general, estado de agregación / multimerización, la homogeneidad y la estructura interna de la macromolecule. Sin embargo, el potencial de la técnica está muy mejorada con procesamiento de imágenes. Una estructura 3D revela arquitectura general de la macromolécula, la ubicación 3D de ligandos y subunidades, cambios conformacionales, y permite el acoplamiento de las estructuras atómicas determinadas por cristalografía de rayos X o RMN. La cantidad de información de una reconstrucción en 3D aumenta por etapas como la resolución se incrementa: en general 15-20 Å de resolución permite acoplamiento inequívoca de estructuras atómicas, a los 9-10 Å hélices alfa son visibles como barras, a las 5 Å es posible discernir láminas beta, y en resoluciones de 3,5 Å y mejor es posible construir un modelo atómico 14. La posibilidad de obtener imágenes informativas y una reconstrucción en 3D usando SPA de cantidades relativamente pequeñas de muestra hacer cryoEM una técnica atractiva, como 5/3 l de al menos 0,05 mg / ml son suficientes para preparar una rejilla TEM. Los requisitos mínimos instrumentalespara cryoEM son un crio-émbolo de fabricación casera o comercial, un microscopio electrónico con ultra alto vacío, medios de grabación de imagen y kit de dosis baja, un crio-titular con su estación de bombeo, un aparato de descarga de gas, y un evaporador. Las características no esenciales, pero aún más deseables en el TEM son cámara CCD (presente en todos los TEM modernos) o un detector de electrones directa, cañón de emisión de campo (FEG), filtrado de energía y alto rendimiento del software de recogida de datos. Este software, en principio, permite la recolección de decenas de miles de partículas en una sola sesión cryoEM 15, sin embargo, las crecientes necesidades de almacenamiento de datos y la posterior necesidad de tiempo de post-procesamiento de supervisión que deben tomarse en consideración. FEG combinado con función de transferencia de contraste (CTF) de corrección subyace en la mayoría de las reconstrucciones en 3D que alcanzaron suficiente resolución para visualizar las hélices alfa. En ese momento, el nivel de resolución también es muestra de dependientes: alcanzar el 10 Å de resolución es menos común para las proteínas de membrana, mientras que sialto grado de simetría está presente, entonces resolución atómica es más alcanzable. El reciente desarrollo de detectores de electrones directos ha permitido a resolución atómica incluso para macromoléculas con bajo (4x) o no simetría, donde la calidad de los mapas de densidad de electrones cryoEM coincide con éstos derivan de los datos de difracción de rayos x 16,17. Ejemplos prácticos que ilustran las capacidades de la técnica se proporcionan aquí cuatro tipos importantes de macromoléculas donde cryoEM tiene un papel principal Continua en su determinación estructural. (I) Con su simetría icosaédrica que aumenta el conjunto de datos en un 60 veces y su gran tamaño que permite fiel y alineación reproducible, las estructuras de varios virus icosaédricos han resuelto con la resolución casi atómica por cryoEM seguido de SPA 18. Mostramos un ejemplo de una clase de virus icosaédricos, los virus adeno-asociados (AAV), para el que cerca de las estructuras atómicas por cryoEM y por cryoEM HY / x-rayExisten métodos brid 19,20. (Ii) macromoléculas con estructura helicoidal incluyen los microtúbulos, filamentos y virus. Sus unidades repetitivas a lo largo del eje de la hélice pueden ser analizados por una versión más compleja de SPA adaptada a la geometría helicoidal 21. En el ejemplo que mostramos virus del mosaico del tabaco (TMV), un virus ARN que se ha resuelto con la resolución atómica por cryoEM 22. (Iii) las proteínas solubles grandes se han estudiado ampliamente. Entre ellas, las macromoléculas que forman cilindros multímeras simétricas constituyen una arquitectura que se repite a menudo resuelto en resolución subnanometer 23,24. Aquí te mostramos imágenes de KLH, un transportador de oxígeno de invertebrados, donde un modelo molecular híbrido fue creado a partir de / x-ray cryoEM métodos cristalografía híbridos 25. (Iv) proteínas de membrana son una clase importante de proteínas; que constituyen aproximadamente un tercio de las proteínas codificadas por el genoma humano, sin embargo, son difíciles de caracterizar estructuralmente debido a complejidades asociadas con trestabilización de dominio ansmembrane 26, constituyendo menos del 1,5% de las estructuras resueltas por cualquier técnica estructural combinado. El papel de la reconstrucción cryoEM y 3D en su determinación estructural se ejemplifica con el receptor de rianodina (RyR), un gran eucariótica de Ca2 + intracelular canal importante en la contracción muscular y la señalización cerebro. Las estructuras más altas resolución cryoEM hasta la fecha, con una resolución de 10 Å, revelan la estructura secundaria 27.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="661">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:243px;">Ethane</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">371745</td>
			<td style="width:167px;">99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:243px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27135</td>
			<td style="width:167px;">99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5326</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mica sheets, 1 x 4 cm</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Graphite rods, presharpened size 1/8&#8221; dia x 2 &#188;&#8221; long tip 0.039&#8221; dia neck type</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">70220-45</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">350 ml cryo-dewars</td>
			<td style="width:132px;">Pope</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8600</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids&#160; Quantifoil</td>
			<td style="width:132px;">Quantifoil</td>
			<td style="width:119px;">Q10525</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids C-Flat</td>
			<td style="width:132px;">Protochips</td>
			<td style="width:119px;">CF-1.2/1.3-4C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Glow discharge device</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Model E7620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Turbo pumping station</td>
			<td style="width:132px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;">Model 655</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Carbon evaporator</td>
			<td style="width:132px;">Denton Vaccum</td>
			<td style="width:119px;">Model 502B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Freeze plunger</td>
			<td style="width:132px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/ctf</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software EMAN</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:243px;">Image Processing software Spider</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software Freealign&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">3D visualization software Chimera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Native Keyhole Limpet Hemocyanin</td>
			<td style="width:132px;">Biosyn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts of cryo-electron microscopy: a primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3d reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Ejecución cuidadosa de todos los pasos del protocolo descritos en la Figura 1 permite la visualización de hidratadas macromoléculas congelados, no manchada. Resultados para cuatro muestras representativas con diferentes características estructurales se muestran. Sus imágenes microscópicas obtenidas por los métodos de NS y cryoEM se comparan (Figura 2). Imágenes (i) NS de AAV5 revelan partículas similares al virus de alrededor de 130 Å de diámetro. La coexistencia de estructuras de llenos y vacíos corresponde a roto (que permiten la entrada de manchas) y cápsides estructuralmente intactas, respectivamente. CryoEM muestra estructuras uniformemente vacías; de hecho, estas partículas virales no contienen material genético 28. NS muestra partículas redondas predominantes mientras cryoEM muestra partículas mayoría hexagonales, lo que refleja su forma icosaédrica. (Ii) Las imágenes de los helicoidales TMV mostrar barras de diámetro 180 Å y longitud variable, a menudo más de 0,1 micras, con una repetición helicoidal de 23 Å visible tantoen NS y en cryoEM. El canal central 40 Å se llena de manchas en las imágenes de NS y vacío en las imágenes cryoEM. (Iii) Nativo KLH, un didecamer de 8 MDa, reúne en barricas característicos de 350 Å de diámetro y 400 de longitud Å. NS y cryoEM revelan KLH de vistas laterales rectangulares y circulares de fin de vistas. Ambas técnicas revelan seis estrías perpendiculares al eje de simetría y las unidades morfológicas igualmente espaciados dentro de cada nivel. CryoEM revela una estructura interior vacío. (Iv) receptor de rianodina, un gran canal intracelular tetramérica de 2,26 MDa, se ve como un cuadrado de 275 x 275 Å 2. Características de la superficie intrincados, tales como una cruz central y una depresión central se manifiestan como la acumulación de la mancha por NS, y como regiones de densidad más baja por cryoEM. Mientras NS muestra contraste similar en los cuatro muestras analizadas, la comparación de los paneles cryoEM expone la SNR inferior (contraste) de RyR1 debido a la presencia de detergente para solubilizar esta proteína de membrana. Ejemplos típicos de artefactos cryoEM se muestran para RyR1: hielo cristalino, la contaminación del hielo, el astigmatismo, y estructuras en forma de banda (Figura 3). Sus causas y la prevención se describen con más detalle en la sección de discusión. Reconstrucción 3D de SPA y congelado-hidratado RyR1 revela su estructura simétrica de cuatro veces, lo que refleja la organización homotetrameric de la proteína (Figura 4A). El dominio citoplásmico forma un prisma cuadrado de 275 x 275 x 120 Å 3 y contiene varios dominios globulares reproducibles que forman una estructura de andamio similares. El dominio transmembrana forma un prisma cuadrado cónico pequeño con dimensiones máximas de 115 x 115 x 60 A 3. En una resolución de 10 Å es posible visualizar las hélices alfa (Figura 4B). Mapeo diferencia 3D puede revelar la posición de los ligandos importantes, en este caso el mapa 3D diferencia de FKBP12, una proteína de 12 kD considerojo una subunidad de RyR1, se superpone a RyR1 (Figura 4C) 29. Finalmente, los cambios conformacionales proporcionan una visión dinámica de la macromolécula. En este caso RyR1 estabilizado previamente en condiciones bien cerrados o abiertos revela una translocación masa de la cerrado al estado abierto (Figura 4D) 27. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo de la técnica de microscopía electrónica de crio. El diagrama destaca los principales pasos del protocolo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig2.jpg" /> Figura 2. Comparación de NS y cryoEM para una variedad de muestras. (A) AAV5, un virus icosaédrica. (B) TMV, un virus helicoidal. El recuadro muestra la repetición helicoidal, de 23 Å. (C) Nativo KLH. RyR1 (D); puntos de vista representativos se destacan (f, ver y s cuádruple, vista lateral). Todas las muestras son imágenes en condiciones de baja dosis y con la misma ampliación de 50,000X un bajo una tensión de aceleración de 200 kV. Las barras de escala, 10 nm. Todas las muestras NS están en soporte de carbono, muestras cryoEM A, C, D están en fina de carbono sobre Quantifoil, y muestra cryoEM B es directamente a través de los agujeros Quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig3.jpg" /> Figura 3. Galería de imágenes que muestran artefactos cryoEM comunes sobre una muestra RyR1 cryoEM. (A) cristalina de hielo. Contaminación (B) de hielo (flechas). (C) El astigmatismo. RyR1s en la imagen astigmática son apenas visibles. El recuadro de la derecha muestra el respeto de energíaron de la imagen con anillos asimétricos Thon. El recuadro de la izquierda muestra el espectro de potencia de una imagen no astigmática como referencia. (D) estructuras en la Web similares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig4.jpg" /> Figura 4. cryoEM y 3D reconstrucción del receptor de rianodina. . (A) Representación Isosurface (B) de acoplamiento de una estructura cristalina de RyR1 de N-terminal 30 que muestra una buena concordancia entre las coordenadas atómicas y la envolvente cryoEM; flechas apuntan a dos hélices alfa que sobresalen de la estructura. La punta de flecha indica uno de los cuatro hélices que rodean el poro del canal iónico. Las líneas de puntos indican los límites de la membrana. (C) RyR1 y 3D locación del ligando FKBP12 (color naranja). (D) Cambios conformacionales de RyR1 en pasar de la cerrada (naranja) al abierto (negro de malla) conformación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Qué hacer y qué no hacer de crio-microscopía electrónica: Una introducción a la preparación de muestras y de alta calidad de recopilación de datos para la Reconstrucción de Macromoléculas 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

45.7K vistas.  Virginia Commonwealth University. This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Video: Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Concentración, la carga, y la alineación de una célula de ultracentrifugación analítica de muestras

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Investigación

Biología

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Microarrays de ADN: Control de calidad de la muestra, la hibridación de la matriz y de escaneo

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal colony. Proper collection of tissues for further histological processing can impact the quality of testing results. This article describes the conduct of a basic gross examination including identification of heart, liver, lungs, kidneys, and spleen, as well as how to collect those organs. Additionally four of the more difficult tissue/sample collection techniques are demonstrated. Lung collection and perfusion can be particularly challenging as the tissue needs to be properly inflated with a fixative in order for inside of the tissue to fix properly and to enable thorough histologic evaluation. This article demonstrates the step by step technique to remove the lung and inflate it with fixative in order to achieve optimal fixation of the tissue within 24 hours. Brain collection can be similarly challenging as the tissue is soft and easily damaged. This article demonstrates the step by step technique to expose and remove the brain from the skull with minimal damage to the tissue. The mesenteric lymph node is a good sample type in which to detect many common infectious agents as enteric viruses persist longer in the lymph node than they are shed in feces. This article demonstrates the step by step procedure for locating and aseptically removing the mesenteric lymph node. Finally, identification of infectious agents of the respiratory tract may be performed by bacterial culture or PCR testing of nasal and/or bronchial fluid aspirates taken at necropsy. This procedure describes obtaining and preparing the respiratory aspirate sample for bacterial culture and PCR testing.

This article describes the procedures for conducting a basic postmortem examination of a mouse or rat, and the collection of basic organs, as well as more challenging sample types from for histological, microbiological, and PCR evaluation.

La necropsia de diagnóstico y selecta colección de tejidos y muestras en ratas y ratones

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-Microscopía Electrónica de Preparación de Muestras por medio de un haz de iones focalizados

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparación de la muestra y proyección de imagen de exosomas por microscopía electrónica de transmisión

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualización de compactación del ADN en cianobacterias por Tomography del Cryo-electrón de alta tensión

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.