We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. Seguimiento transcelular Difusión de proteínas priónicas-como por En Vivo Time-lapse de imágenes NOTA: Crecer C. elegans de tipo salvaje (WT) (N2) y las líneas transgénicas de acuerdo con métodos estándar y controlar cuidadosamente la temperatura de cultivo 47. <ol><li> Generar líneas transgénicas de C. elegans expresar la proteína prión como, etiquetados con la proteína fluorescente de color rojo monomérica (mRFP). Mira este video que muestra cómo utilizar la microinyección 48. Para más información y métodos que describen cómo integrar estas líneas extracromosómicos, ver 49. </li><li> Preparar poblaciones sincronizadas por la puesta de huevos o de blanqueo de acuerdo con métodos estándar 50. <ol><li> Sincronización de la puesta de huevos <ol><li> Transferencia 10-20 adultos grávidas en un plato y dejar que ellos ponen huevos por 1 - 2 horas. Retire los adultos de la placa y dejar que la progenie crecer hasta la edad deseada. </li></ol></li> &lt;li&gt; Sincronización por blanqueo <ol><li> Recoger una población no sincronizada de los adultos grávidas y blanquear con solución de hipoclorito alcalino (NaOH 250 mM y 1: 4 (v / v) dilución de lejía comercial en H 2 O). Lavar los huevos dos veces (218 g durante 1 min) con tampón M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, agregue dH2O hasta 1 L). </li><li> Deje que se traman en tampón M9 con suave agitación O / N a 20 ° C. Desarrollo gusano arresto en la fase L1 en ausencia de una fuente de alimento, dejando una población sincronizada. Traslado L1s en crecimiento de Medios (NGM) placas fresco nematodos sembradas con OP50 E. bacterias coli y permiten la progenie se desarrolla hasta la edad de 47 años que desee. </li></ol></li></ol></li><li> Prepare 2% agarosa almohadillas (en H 2 O) en un portaobjetos de microscopio como se describe 50. <ol><li> Prepare dos millasdiapositivas croscope con la cinta de etiquetado se coloca sobre toda su longitud para ser utilizados como espaciadores. Coloque una tercera portaobjetos de microscopio entre ellos. </li><li> Disolver 2% de agarosa en H 2 O y una pipeta una gota sobre el portaobjetos limpio. </li><li> Coloque cuarto de diapositivas perpendicular a los otros tres se desliza sobre la parte superior de la caída de agar. Presione suavemente hacia abajo para aplanar la almohadilla en el mismo grosor que la cinta de etiquetar. </li><li> Deje que se seque durante 1 minuto antes de retirar los espaciadores y tirando suavemente de las diapositivas aparte. La almohadilla de agar se apegará a uno de ellos. </li></ol></li><li> Pipeta ~ 10 l anestésico (levamisol 2 mM en tampón M9) en la superficie y la transferencia de ~ 10 animales utilizando un pico alambre de platino. Cubra con una hoja de cubierta (~ 22 x 22 mm) y tomar imágenes dentro de 1 hora. </li><li> Alternativamente, para adquirir películas durante un período de tiempo más largo o para reducir aún más la posibilidad de cualquier movimiento de los animales, utilizar una combinación de anestésico y el talón de inmovilización 51. <ol><li> Preparar 10% agaalmohadillas rosas (en tampón M9) como se describe 51 y agregar gusanos a solución normas de tamaño nanoesfera 3 l (perlas de poliestireno, 100 nm), además de 3 l anestésicos (levamisol 4 mM en tampón M9). Cubra ligeramente con un cubreobjetos. Para evitar la desecación, sellar la hoja de la cubierta con valap (mezcla de cantidades iguales de vaselina, lanolina y cera de parafina). </li></ol></li><li> Image inmovilizado gusanos usando un microscopio confocal. Nota: Los resultados se obtienen utilizando un Spinning Disc AF Microscopio Confocal equipado con una cámara EM-CCD y un software de Microscopía Automatización y Análisis de imagen tales como MetaMorph y describen los detalles a continuación, pero otros sistemas de formación de imágenes confocal comparable también se pueden utilizar. <ol><li> Utilice el objetivo aceite 63X o 100X / 1.4NA y colocar el portaobjetos de microscopio que contiene gusanos en el soporte de portaobjetos de microscopio. </li><li> Abrir el software. Ajustar la potencia del láser y filtros para imágenes mRFP. Utilice el láser de 561 nm en el 10% de energía y la emisión de filtro&gt; 600 nm. </li><li&gt; Abrir &quot;MultiDimensional Adquisición&quot;. En la pestaña &quot;Principal&quot;, active las casillas de &quot;Timelapse&quot; y &quot;Run Journals&quot; (Hardware enfoque automático: desactivado). </li><li> Bajo la pestaña &quot;Saving&quot; seleccionar o crear la carpeta del directorio donde los archivos deben ser guardados. Asigne un nombre al archivo. </li><li> Bajo la pestaña &quot;Longitud de onda&quot;, seleccione la iluminación adecuada y ajustar la exposición y ganancia. Use &quot;YokoQuad Red&quot; (o una configuración de iluminación equivalente para formación de imágenes mRFP) con una exposición de entre 100 y 300 mseg y una ganancia de la cámara entre 100 y 300, dependiendo de la muestra individual (evaluado mediante el uso de la imagen en vivo). </li><li> Bajo la pestaña &quot;Timelapse&quot; seleccione &quot;Número de puntos de tiempo&quot; = 301 &quot;Duración&quot; = 5 min y &quot;Tiempo / Intervalo&quot; = 1 seg. </li><li> En el marco del &quot;Revistas&quot; pestaña seleccione Diario: &quot;AFC SET Z HOLD&quot; y &quot;AFC Volver a Z HOLD&quot;, Tipo: &amp;# 8220; Especial &quot;(dos veces), Punto inicial:&quot; Inicio de la hora punta &quot;y&quot; Fin de punto en el tiempo &quot;. Esta opción de enfoque automático es importante para la imagen de la misma sección durante un período de tiempo más largo. </li><li> Una vez finalizada la configuración, pulse &quot;Adquirir&quot;. El vídeo timelapse se safed como archivos TIFF independientes. </li><li> Abre todos los archivos .tiff de una serie de tiempo dada en ImageJ. Diríjase a &quot;Imagen&quot; → &quot;Stacks&quot; → &quot;Imágenes Stacks&quot;. Opcionalmente, ajustar el brillo y el contraste, añadir la barra de tamaño, etc. Exportar la película en &quot;Archivo&quot; → &quot;Guardar como&quot; → &quot;AVI ...&quot; (por ejemplo, ver video 1 y 2 correspondientes a la Figura 1). </li></ol></li></ol> 2. Usando sensores plegables y Reporteros Estrés encargado de investigar la célula autónoma y no de células Autónoma Afecto sobre Proteostasis y Toxicidad <ol><li> Generar líneas transgénicas que coexpresan un sensor de plegado o Reporte estrésr junto con la proteína prión-similares. Para los métodos sobre cómo establecer cruces o generar líneas transgénicas, consulte 48,49,52. Ver Tabla 1 para una lista de C. elegans cepas que se pueden utilizar. </li><li> Preparar poblaciones sincronizados de animales transgénicos y crecer hasta la edad deseada como se describió anteriormente (sección 1.2) 50. </li><li> El uso de un microscopio estereoscópico, examine el respectivo fenotipo del sensor de plegado o reportero estrés. <ol><li> Para el sensor de plegado, determinar el número de animales que albergan agregados de cada día después de la sincronización (por ejemplo, véase la Figura 2E y F). </li><li> Para el reportero estrés, prueba si la coexpresión de las proteínas priónicas resultados similares en un aumento de fluorescencia del informador (por ejemplo, véase la Figura 3). </li></ol></li></ol> 3. Pantalla de todo el genoma para la supresión de la toxicidad inducida por priones en C. elegans<img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> Figura 4. Representación esquemática del protocolo de cribado RNAi. Vea la sección protocolo 3 para una descripción detallada de los pasos individuales. <ol><li> Sincronización de C. gusanos elegans y la duplicación de RNAi biblioteca <ol><li> Para la pantalla de RNAi, utilizar la biblioteca Ahringer RNAi (o la biblioteca Vidal RNAi) 53,54. Rearray la biblioteca RNAi desde el formato de pozo original 384 en placas de 96 pocillos llenando las placas con 100 l de medios LB-Amp (50 mg / ml de ampicilina en LB) suplementado con 10% de glicerol y inocular utilizando un replicador de 96 pines. Crece a 37 ° CO / N con agitación y se almacena a -80 ° C. </li><li> Mantener C. elegans WT y líneas transgénicas a 20 ° C en NGM placas sembradas con OP50 E. bacterias coli de acuerdo con métodos estándar 47. </li><li>Sincronizar transgénico dominio prión y WT (control) nematodos por el blanqueamiento (ver sección 1.2). </li><li> El mismo día que los gusanos se blanquean, preparar medio LB suplementado con 50 mg / ml de ampicilina. Utilice un dispensador de reactivos automatizado para dispensar (o una pipeta manual) 65 l de los medios de comunicación LB-amp en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. </li><li> Retire 96 y placas de biblioteca Ahringer RNAi de -80 ° C y llevarlos a una campana estéril forrada con papel de cocina. Retire inmediatamente la junta cinta manteniendo la placa boca abajo mientras que las placas todavía están congelados, teniendo cuidado de evitar la contaminación de hielo en el exterior de las placas. Reinvertir las placas y dejar que se descongelen durante aproximadamente 30 minutos. </li><li> Sumerja una estéril replicador de 96 pines en una placa RNAi biblioteca, y luego en una placa LB-amp fresco. Use un replicador estéril nueva para cada plato. Selle todas las placas con cinta de papel adhesivo y devolver las placas de biblioteca a -80 ° C. Los replicadores pueden ser remojados en lejía, enjuagarse,y en autoclave para ser utilizado de nuevo. </li><li> Permitir a las placas de RNAi duplicados para crecer O / N en una incubadora a 37 ° C y 300 rpm. Para utilizar HT115 E. coli bacterias que albergan el vector vacío (L4440) como un control, que crecen por separado en un tubo de cultivo y después de pipetear 65 l de cultivo con una pipeta multicanal en un cuarto de dos placas de 96 pocillos. </li></ol></li><li> La inducción de la producción bacteriana dsRNA y la adición de gusanos <ol><li> Diluir isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) a una concentración 5 mM en ddH 2 O. Utilice una estación de trabajo automatizado con una cabeza multicanal para dispensar (o pipeta manualmente) 10 l de IPTG diluido en cada pocillo de las bacterias RNAi y las placas de control. Volver a sellar y colocar las placas de nuevo en la incubadora. Deja que sacuden durante 3 horas a 37 ° C. </li><li> Mientras que las bacterias están temblando, preparar los gusanos. Mezclar el / suspensión gusano M9 bien, y la pipeta una muestra pequeña (~ 5-10 l) a un portaobjetos de vidrio. Contarel número de gusanos bajo un microscopio estereoscópico y calcular el número de gusanos por l. </li><li> Utilizando una técnica estéril, preparar una solución de M9 suplementado (M9 +) con las siguientes concentraciones finales: 0,20 mg / ml de IPTG, 8,0 g / ml de colesterol, 50 mg / ml de ampicilina, 9,6 g / ml de tetraciclina, 0.0835 g / ml de Fungizone, y 15 gusanos por 50 l. <ol><li> Haga soluciones separadas para transgénico dominio prión y gusanos WT. El volumen final de la solución gusano M9 + necesaria dependerá del número de placas de RNAi copiados (ver más abajo), además de ~ 30 ml de volumen muerto que permanecerá en el depósito, si se utiliza un dispensador automatizado. </li></ol></li><li> Después de la inducción 3 h de producción bacteriana dsRNA, tome las placas de la incubadora y dejar que se enfríe a temperatura ambiente (~ 30 min) para evitar el calor perturbe a los animales. </li><li> Dispensar 50 l M9 + dominio prión solución gusano transgénico a cada pocillo de las placas de RNAi y una de las placas de control de vector vacío. HacerAsegúrese de mezclar la solución gusano antes de cada paso como los animales tienden a sedimentar al fondo del depósito. </li><li> Prescindir gusanos WT en la segunda placa de control. Deje las placas sin sellar para permitir la aireación. Para mantener el cultivo líquido se evapore, apilar 4-5 platos juntos y envolver con una toalla de papel húmeda y papel de aluminio. Incubar a 200 rpm a 20 ° C durante 4 días. </li></ol></li><li> Tanteo NOTA: Después de 4 días en la incubadora, los gusanos estarán en el segundo día de la edad adulta y están listos para defender. Deje que los animales se adaptan a condiciones no sacuden durante 30 minutos antes de cribado para asegurar golear sin ser molestados. <ol><li> Utilizando una cámara Falcon 4M60 conectado a un ordenador con una pantalla del monitor visual para aumentar la thrashing en comparación con tratados con el control de dominio prión animales transgénicos. </li><li> Compilar una lista de éxitos preliminares confirmar utilizando wrMTrck (véase la sección siguiente). </li></ol></li></ol> 4. Confirmación de preliminarPantalla Golpea <ol><li> Ensayo de la motilidad en placas sólidas <ol><li> Preparar placas con NGM suplementadas con 100 g / ml de ampicilina, 12,5 mg / ml de tetraciclina y 1 mM IPTG, de acuerdo con métodos estándar 47. Si es posible, utilice una máquina de placa de vertido para asegurar todas las placas tienen la misma altura de los medios de comunicación, lo que permitirá un proceso de adquisición de vídeo más ágil. </li><li> Cultivar las diferentes clones RNAi en ~ 1 ml de LB + 50 mg / ml de ampicilina, O / N a 37 ° C y 250 rpm. </li><li> El día siguiente, inducir la expresión de la dsRNA con 1 mM IPTG durante 3 horas. Sembrar las placas con 150 l de cada clon bacteriano RNAi, que se distribuyen en una capa delgada. Deje que las bacterias secas durante 2 días a temperatura ambiente en la oscuridad. Preparar 3 planchas por RNAi clon. </li><li> Sincronizar la población de gusanos por blanqueo de acuerdo con los métodos estándar 50 (ver sección 1.2), y dejar que los huevos eclosionan O / N en M9 medios. </li><li> Tomar una muestra de la suspensión de gusano y determinar la cantidad de nematodes por l en el microscopio estereoscópico. Entonces, pipetear el volumen adecuado de M9 más gusanos en cada placa experimental para que contenga de 25 - 30 gusanos L1. Crecer los nematodos a 20 ° C durante 4 días hasta que los gusanos alcanzan día 2 de la edad adulta. </li></ol></li><li> El análisis cuantitativo de la motilidad gusano con el plugin wrMTrck para ImageJ NOTA: Los videos fueron grabados utilizando un microscopio estereoscópico a 10 aumentos con un Hamamatsu Orca-R2 cámara digital C10600-10B y el software de imágenes PCI simple Hamamatsu. <ol><li> Encienda la cámara y el software de imágenes PCI simple. Haga clic en &quot;Live&quot; para permitir el ajuste de las condiciones de la imagen. </li><li> Configurar las condiciones de vídeo de la siguiente manera: Ganancia = 0; Modo Luz = Alta; Velocidad Índice = 1; Intervalos = 2. Haga clic en &quot;Auto Expose&quot; y luego ajustar las condiciones de luz, mover los espejos de microscopio y los diales de brillo y contraste. NOTA: El video tiene que tener un alto contraste sin ser Sobreexpcerradas de la, por lo que los animales aparecen como formas negras sobre un fondo brillante. </li><li> Haga clic en &quot;Scan Time&quot; y seleccione una carpeta y un nombre de archivo. Ajuste &quot;Delay Campo&quot; a 20 ms y &quot;Parada en el tiempo&quot; a 30 seg. Presione &quot;Revisión Live&quot; con el fin de elegir el área de la placa para grabar (donde la mayoría de los gusanos son). Toque en la placa de 3 o 4 veces en el escenario, de forma rápida confirmar su posición en el campo de visión y presione &quot;Start&quot;. </li><li> Después de la película termine de grabar, haga clic derecho sobre la imagen y selecciona &quot;Exportar Montaje Secuencia&quot; para exportar la película a partir de un formato .cxd a un .avi. </li></ol></li><li> El análisis de los vídeos de la motilidad <ol><li> Abra el software ImageJ, vaya a la pestaña &quot;Plugins&quot;, luego &quot;wrmtrck&quot; y selecciona &quot;Lote wrMTrck&quot;. Seleccione el directorio que contiene todos los archivos a analizar. </li><li> En la ventana de entrada principal de wrMTrck_Batch, cargue los valores de entrada como se detalla en Figure 5C. Explicación para cada uno de los parámetros se puede encontrar en las instrucciones que acompañan el plugin. Haga clic en &quot;Aceptar&quot; y dejar que el análisis del movimiento de ejecución. </li><li> El comisariado de los resultados y confirmar que todas las pistas detectadas son de real C. elegans y eliminar los artefactos, se abren cada uno de los archivos .txt creados para cada película y copiar la información a un archivo de software de análisis de datos. Abra el &quot;*&quot; _labels.zip archivos creados y ejecutar el resultante &quot;* _labels.tif&quot; para comprobar y eliminar pistas falsas gusano manualmente. </li></ol></li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Los métodos descritos aquí ayudan a ilustrar la difusión y la toxicidad celular autónoma la célula compleja autónomos y no de las proteínas priones similares. Recientemente hemos descubierto que un dominio citosólico prión agregación propensos se recoge en vesículas de membrana en un proceso de autofagia relacionados. Un subconjunto específico de estas vesículas transporta el dominio prión dentro de y entre las células y los tejidos 40. La clave para controlar su movimiento en el animal vivo es...

Muchas de las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET), se asocian con proteínas de agregación propensos y están, por tanto, colectivamente conocidos como proteínas misfolding trastornos (PMD ). EET o enfermedades priónicas constituyen una clase única de PMD en que pueden ser infecciosas en seres humanos y animales 1. A nivel molecular, los priones se replican mediante el reclutamiento y la conversión-rica α-hélice PrP celular codificada por el hospedador monomérico (PrP C) en el rico en β-hoja de PrP Sc conformación patológica 2,3. Agregados de proteínas autopropagante también se han identificado en los hongos, que comparten características importantes con priones mamíferos 4,5. Además, priones mamíferos son capaces de pasar de célula a célula e infectan células de los animales 6,7. Mientras PMD other de EET no son infecciosas, comparten un principio patógena común con las enfermedades priónicas 8,9. Aunque las proteínas vinculadas a cada uno de los PMD no están relacionadas en estructura o función, que todos los agregados formulario a través de un proceso de cristalización como llaman nucleado o polimerización sembraron; Además semillas proteicas crecen mediante la contratación de sus isoformas solubles 2,10,11. La eficiencia a la auto-propagan in vivo varía, dependiendo de las propiedades intrínsecas de la proteína, que junto con factores celulares adicionales, tales como chaperones moleculares en última instancia determinan las tasas de nucleación agregada, la siembra, la fragmentación y la difusión de 12-15. Por lo tanto, debe existir un equilibrio entre estos factores que permiten la propagación eficiente de la agregación de proteínas. Esto también podría explicar por qué sólo algunos agregados amiloidogénicos albergan las características de un prión, y por lo tanto no todos los PMD son infecciosos. Los priones parecen representar o &#39;top artistas intérpretes o ejecutantesfa amplio espectro de agregados proteicos auto-replicantes, que los convierte en una poderosa herramienta para estudiar PMD 8,13. Curiosamente, la toxicidad asociada con los agregados relacionados con la enfermedad tiene a menudo un componente autónomo no celular 16,17. Esto significa que afectan a las células vecinas que no expresan el gen correspondiente, en contraste con un efecto de célula autónoma estrictamente, lo que implica que sólo las células que expresan el gen de la exposición fenotipo específico. Esto fue convincentemente demostrado por la expresión específica de tejido o derribar las respectivas proteínas en numerosos modelos de enfermedades neurodegenerativas 18-26. Diversos mecanismos se han sugerido como una base para esta toxicidad autónoma no celular en PMD, incluyendo el suministro de nutrientes disminuido, el desequilibrio en la señalización neuronal, excitotoxicidad del glutamato, y la neuroinflamación 16,27,28. Además, un movimiento de priones como de agregados de enfermedades vinculadas entre las células Might contribuyen a este aspecto 29,30. La evidencia creciente sugiere que las inclusiones proteína distinta de priones pueden transmitir de célula a célula, lo que puede explicar la característica de propagación de la patología observado en muchos PMD 30-36. Sin embargo, aún no se ha determinado si existe una clara relación causal entre el movimiento intercelular de proteínas de la enfermedad y el efecto tóxico sobre las células vecinas. Por lo tanto, una mejor comprensión de las vías celulares que subyacen a la transmisión de célula a célula y la toxicidad celular autónomo no es necesario y esencial para el desarrollo de nuevas terapias. Sin embargo, muchos aspectos de priones como la difusión y celulares factores que influyen en la transmisión de célula a célula de proteínas mal plegadas en metazoos no se conocen bien, en particular a nivel del organismo. El nematodo Caenorhabditis elegans tiene varias ventajas que ofrecen el potencial de descubrir nuevas facetas de priones como spreading en metazoos 17. Es transparente, lo que permite el seguimiento in vivo de las proteínas fluorescentemente marcadas en el organismo vivo. Además, muchos procesos celulares y fisiológicas afectadas por la enfermedad se conservan de gusanos para la salud humana, y C. elegans también es susceptible a una amplia variedad de manipulaciones genéticas y análisis moleculares y bioquímicos 37-39. Exactamente 959 células somáticas conforman el adulto hermafrodita con un plan de cuerpo simple que todavía tiene varios tipos de tejidos distintos, incluyendo los músculos, neuronas y delgado. Para establecer un nuevo modelo de prión en C. elegans, se optó por expresar de forma exógena la glutamina / asparagina bien caracterizado (Q / N) ricos en priones dominio NM de la proteína priónica de levadura citosólica Sup35, ya que no hay proteínas priónicas endógenos conocidos gusanos 4,40. Los priones de levadura han sido invaluables en la aclaración de los mecanismos básicos de la replicación de priones 41-44. Además, Nuevo México es el abetocitosólica proteína prión como st que se ha demostrado para recapitular el ciclo de vida completo de un prión en cultivos celulares de mamíferos 45,46. Del mismo modo, cuando se expresa en C. elegans, el dominio prión Sup35 adoptado notablemente bien a los diferentes requisitos para la propagación en células de metazoos en comparación con células de levadura y de las características clave de la biología expuestas prión agregación 40. NM se asoció con una profunda fenotipo tóxicos, incluyendo la interrupción de la integridad mitocondrial y la apariencia de diversas vesículas autofagia relacionados en el nivel celular, así como la detención embrionario y larval, retraso del desarrollo, y una alteración generalizada del medio ambiente plegamiento de la proteína en el nivel del organismo. Sorprendentemente, el dominio prion celular exhibe toxicidad celular autónoma y no autónoma, que afecta a los tejidos vecinos en la que no se expresó el transgén. Además, el transporte vesicular del dominio prión dentro de y entre las células se monitoriza en tiempo real &lt;em&gt; in vivo 40. Aquí se describe cómo examinar difusión-prión como en C. elegans. Vamos a explicar cómo supervisar el transporte intra e intercelular de vesículas que contienen el dominio de priones usando microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Haremos hincapié en el uso de sensores de plegado específicos de tejido y de expresión ubicua reporteros de estrés para evaluar los teléfonos celulares efectos autónomas autónomas y no sobre la aptitud celular. Por último, vamos a describir el procedimiento de una pantalla recientemente realizado genoma amplia ARN de interferencia (RNAi) para identificar nuevos modificadores de la toxicidad inducida por priones. En combinación, estos métodos pueden ayudar a desmenuzar las vías genéticas implicadas en el movimiento intercelular de proteínas y su toxicidad autónoma no celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Reagent</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Nanosphere size standards 100 nm</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">3100A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Levamisole</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">L-9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">IPTG</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">15502-10G</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Ahringer RNAi library</td>
			<td style="width:107px;">Source BioScience LifeSciences&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.lifesciences.sourcebioscience 
			.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">75004521</td>
			<td style="width:255px;">http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ 
			XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 
			VAC/EW-17707-60</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">96 pin replicator&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Scionomix&#160;&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">HiGro high-capacity, incubating shaker&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Digilab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.digilabglobal.com/higro</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Multidrop Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Titertrek</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Biomek FX AP96 Automated Workstation&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">Innova44 shaker</td>
			<td style="width:107px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&#38;pb=d78efbc05310ec 
			04&#38;action=products&#38;contentid=1&#38; 
			catalognode=83389</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">M205 FA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">Spinning Disc AF Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Falcon 4M60 camera&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Teledyne Dalsa&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Software</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">ImageJ</td>
			<td style="width:107px;">NIH</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">wrMTrck plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">C. elegans strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">N2 (WT)</td>
			<td style="width:107px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">AM815&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>
			<td style="width:107px;">Morimoto lab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">available from our laboratory&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism c. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Monitoreo intercelular propagación de proteínas priónicas como in vivo por time-lapse Transgénicos C. elegans líneas que expresan el dominio de priones son particularmente adecuados para el análisis de ciertos aspectos de proteínas priónicas-como, por ejemplo, la transmisión de célula a célula y la toxicidad no autónoma de la célula. La transparencia de los animales permite el seguimiento de fluorescencia proteínas etiquetadas desde d...

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Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

investigating-spreading-toxicity-prion-like-proteins-using-metazoan

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

15.7K vistas.  Northwestern University. Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Video: Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Investigación

Biología

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.