Como un poderoso modelo animal en estudios neurodegenerativos y de comportamiento, C. elegans se puede utilizar para detectar y evaluar eficientemente compuestos tóxicos contra la neurotoxicidad de poliglutamina utilizando modelos similares a la enfermedad de Huntington. La principal ventaja de esta técnica es el perfilado y la integración de múltiples fenotipos en diferentes modelos de C.elegans. También en realidad como C.elegans modelos se utilizan en este método.
Proporciona tamaño en la detección y la investigación de candidatos terapéuticos para otros retrasos neurodegenerativos y, de hecho, otros retrasos. Por favor, preste atención a las temperaturas utilizadas en el crecimiento de C.elegans y realice la prueba en las etapas correctas de desarrollo nómico. Demostrando el procedimiento estarán Jiang Yiyi, Xioa Yue y Wang Qiangqiang, tres estudiantes graduados.
Comience transfiriendo de 300 a 500 larvas L1 sincronizadas de nematodos AM141 a cada pocillo de una placa de 48 pocillos con 500 microlitros de medio S que contiene la cepa OP50 de E. coli y cinco miligramos por mililitro de astragalán. Selle la placa con parafilm e incube a 20 grados centígrados y 120 rotaciones por minuto durante los intervalos de tiempo deseados. Transfiera los nematodos en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y lave con tampón M9 tres veces por centrifugación para eliminar las células OP50 restantes.
Luego, vuelva a suspender los nematodos AM141 en el tampón M9. Ahora, transfiera de 10 a 15 nematodos a cada pozo en una placa de 384 pocillos, estableciendo 10 pocillos replicados para cada tratamiento y agregue 10 microlitros de azida de sodio milimolar de 200 milimolares a cada pozo para paralizar los nematodos al permitirles asentarse hasta el fondo. Coloque la placa en un sistema de imágenes de alto contenido para adquirir imágenes fluorescentes.
Abra el software de adquisición de imágenes y configure los parámetros mencionados en el texto manuscrito. Analice los datos de la imagen abriendo la ventana de datos de la placa de revisión y seleccionando la placa de prueba para el análisis de imágenes. Haga doble clic en un pozo de prueba para mostrar su imagen.
A continuación, seleccione los núcleos de recuento como método de análisis y haga clic en el botón de configuración de ajustes. Defina la imagen de origen del canal FITC y seleccione el algoritmo estándar. Establezca los parámetros de análisis de imágenes como se describe en el texto manuscrito y pruébelos para optimizar el método de análisis.
Guarde la configuración y ejecute el análisis en todos los pozos. Exporte el total de núcleos como el número total de agregados Q40:YFP en cada pozo. Cuente el número de nematodos en cada pozo y calcule el número promedio de agregados Q40:YFP por nematodo en cada grupo.
Luego, calcule el índice de inhibición. Para preparar nematodos para el ensayo de neurotoxicidad polyQ, transfiera de 300 a 500 larvas L1 sincronizadas de nematodos HA759 a cada pocillo de una placa de 48 pocillos con 500 microlitros de medio S que contenga la cepa OP50 de E. coli y cinco miligramos por mililitro de astragalán. Después de sellar las placas, incubar, cosechar y resuspender los nematodos en el tampón M9 como se demostró anteriormente.
Ahora, prepare en almohadilla de agarosa agregando dos gramos de agarosa a 100 mililitros de tampón M9 y caliente la solución en un microondas hasta casi hervir. Dispense 0,5 mililitros de agarosa fundida en el centro de un portaobjetos de vidrio de microscopía de un milímetro de espesor colocado entre dos piezas de placas de vidrio de dos milímetros de espesor, cubriendo con otro portaobjetos verticalmente. Retire suavemente el portaobjetos superior una vez que la agarosa se enfríe y se solidifique.
Comience el ensayo de supervivencia neuronal ASH agregando una gota de azida de sodio milimolar de 20 milimolar en la almohadilla agros y luego transfiriendo de 15 a 20 nematodos HA759 a la gota para inmovilizarlos. Coloque un deslizamiento de cubierta suavemente sobre los nematodos. Ahora, mantenga el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara digital.
Seleccione una lente objetivo 40x y un filtro FITC para detectar neuronas ASH GFP positivas en la región de la cabeza de los nematodos. Seleccione más de 50 nematodos en cada grupo al azar para contar el número de nematodos con neuronas ASH bilaterales marcadas con GFP en su región de la cabeza, y luego calcule la tasa de supervivencia de las neuronas ASH. Para el ensayo de evitación osmótica, divida una placa NGM libre de alimentos en zonas normales y de trampa creando una línea de glicerol de ocho molares en el medio.
Luego, extienda una línea de azida de sodio de 200 milimolares a aproximadamente un centímetro de distancia de la línea de glicerol para paralizar los nematodos que cruzan a través de la barrera de glicerol hacia la zona de trampa. Transfiera alrededor de 200 nematodos cada uno a la zona normal de tres placas replicadas para cada grupo. Luego, agregue una gota de 1% de butanodiona en la zona de la trampa para atraer a los nematodos.
Cubra la tapa de la placa de Petri inmediatamente e incube a 23 grados centígrados durante 90 minutos. Puntúe el número de nematodos en ambas zonas bajo un microscopio y calcule el índice de evitación. La cepa transgénica polyQ AM141 expresa fuertemente las proteínas de fusión Q40:YFP en las células musculares de la pared corporal, identificadas por este protocolo automatizado de imágenes y análisis, cuya cantidad creciente fue inhibida por el tratamiento con astrágalo demostrando su potencial protector.
Una pérdida de fluorescencia GFP y neuronas ASH bilaterales en las regiones de la cabeza de los nematodos indica la muerte neuronal de ASH. Este ensayo de supervivencia neuronal ASH se puede utilizar para evaluar visualmente el efecto neuroprotector de los compuestos de prueba en las neuronas Caenorhabditis elegance. El ensayo de evitación quimiosensorial se utilizó para examinar las muestras de prueba efectivas sobre la pérdida funcional de las neuronas ASH mediada por la agregación poliQ.
El índice de evitación de los nematodos HA759 tratados con astrágalo a 15 grados centígrados durante tres días aumentó a más de 0,6, lo que demuestra un efecto neuroprotector del polisacárido contra los trastornos del comportamiento. Para evaluar la capacidad neuroprotectora global de los compuestos de ensayo, los datos de los ensayos individuales se integraron y se presentaron como un gráfico de radar que muestra el área del triángulo en el grupo de tratamiento con astrágalo mayor que la del grupo control, lo que indica los efectos anti-poliQ del polisacárido. Tenga en cuenta que los alimentos, la temperatura y la humedad pueden afectar su comportamiento de C.elegans.
