We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.

ملاحظة: إنتاجية هذه النظم الفحص تعتمد على معدات المختبرات المتاحة HTS. ومما يسهل هذا البروتوكول من قبل TECAN الحرية EVO 200 الروبوت، الذي يؤدي التعامل مع السائل في شكل 96-جيدا. التصغير إلى تنسيق 384 جيدا هو ممكن أيضا. يتم وضع نظام مناولة السائل الروبوتية تحت غطاء تدفق الصفحي من أجل الحفاظ على ظروف معقمة خلال جميع الخطوات التجريبية. إذا لم يكن هناك أتمتة معالجة السائل هو متاح، بروتوكول يمكن تكييفها بسهولة إلى تنسيق منخفضة الإنتاجية. الفحص الأولي 1. يوم 1: إعداد وخلايا البذور ملاحظة: خلايا البذور لتسفر عن 80٪ التقاء في وقت معايرة luciferase النشاط، أي 48 ساعة بعد البذر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend trypsinized الخلايا العصبية CHP134-mycn3UTR إلى تركيز من 2 × 10 5 خلية / مل في RPMI تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ L-الجلوتامين. لمدة 27 لوحات إعداد 250 مل على الأقل من<html> تعليق الخلية مع الأخذ بعين الاعتبار التعامل السائل، أحواض كميات الميتة والخطوات pipetting لالمتكررة. صب تعليق خلية في خزان معقم ووضعه على طاولة الروبوت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 9 barcoded بيضاء مسطحة القاع لوحات 96-جيدا وعلبة من 200 ميكرولتر نصائح الماصة العقيمة على مكتب الروبوت. مزيج تعليق خلية من قبل pipetting قبل كل خطوة إعفاء لتجنب خلايا تسوية تحت الجاذبية. الاستغناء 75 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من 9 لوحات للحصول على الكثافة النهائية من 1.5 × 10 4 خلايا لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحات مع الأغطية وتركهم خارج الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا لالرواسب في قاع البئر. وهذا تقليل الآثار الحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1.2 و 1.3 ضعف من أجل إعداد إجمالي عدد 27 لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحات عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ واحتضان لمدة 24 ساعة. </li></ol> 2. يوم 2: علاج للخلايا مع المركبات المكتبة ntent &quot;&gt; ملاحظة: تتكون المكتبة الطيف مجموعة جزيء صغير من 2،000 المركبات مرتبة في 8 الصفوف والأعمدة 10 في 25 لوحات 96-جيدا في تركيز 10 ملم في DMSO يتم ترك الآبار على الأعمدة الأولى والأخيرة فارغة لعناصر. وعادة ما يتم تنفيذ. المقايسات فحص المركبة في 1-10 ميكرومتر تركيز مركب (8). بروتوكول الفحص الموصوفة هنا بإصلاح 2 ميكرومتر باسم تركيز العمل و 24 ساعة كنقطة نهاية الفحص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد 9 لوحات مكتبة المجمع في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد اثنين من أحواض مع معقم PBS وPBS-0.5٪ DMSO الحلول ووضعها على المنضدة الروبوت. لكل لوحة المكتبة، وإعداد وتسمية وفقا لذلك واحدة لوحة التخفيف - البولي بروبلين U-أسفل لوحة 96-جيدا مع حجم عمل لا يقل عن 400 ميكرولتر. ملء كل بئر من الأعمدة 2 إلى 11 لوحات التخفيف مع 398 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة باستخدام نصائح الثابتة معالج السائل. ملء الأعمدة 1 و 12 مع 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمةمع 0.5٪ DMSO من أجل التكاثر تركيز المركبات في آبار المراقبة (0.02٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اثنين من لوحات المكتبة، لوحات تخفيف المسمى المقابل، صندوقين من 50 ميكرولتر نصائح الماصة العقيمة وستة خلايا لوحات على الطاولة الروبوت. كشف خلايا لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 2 ميكرولتر من 10 ملي حل الأوراق المالية من واحد من اثنين من لوحات مكتبة في لوحة التخفيف المقابلة وتخلط جيدا. وهذا يؤدي إلى تركيز مركبات وسيطة من 50 ميكرومتر. باستخدام نفس مجموعة من النصائح، الاستغناء 3 ميكرولتر من التخفيف 50 ميكرومتر في 3 البيضاء barcoded لوحات 96-جيدا مع الخلايا. هذه النتائج خطة التخفيف في 2 ميكرومتر تركيز كل العمل اختبار المجمع. ملاحظة: لتجنب التلاعب غير الضرورية مع النصائح، واستخدام مجموعة كاملة من 96 نصائح من البداية، على الرغم من أن لوحات مكتبة تحتوي على مركبات فقط 80. وهذا ممكن منذ أول والأعمدة الأخيرة من لوحات مكتبة فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال نصائح الماصة وكرر القديسالجيش الشعبي 2.4 لوحة مكتبة الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحات الخلايا وإعادتها إلى حاضنة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،3-2،6 مرتين أخريين لوحات مكتبة المتبقية. </li></ol> 3. يوم 3: إجراء الفحص luciferase المراسل ملاحظة: قبل تنفيذ فحص luciferase المراسل، فمن الممكن أن معدد مع مقايسة بقاء الخلية على أساس الحد من ريسازورين من أجل الحصول على مؤشر الخلية الجدوى من كل بئر 9. مضاعفة و luciferase جدوى فحص النتائج المقايسات في الحد من إشارة luciferase المراسل أن، ومع ذلك، يمكن تجاهلها إذا توفر الخلايا على مستوى عال يكفي من luciferase النشاط. ويمكن الكشف عن luciferase النشاط من قبل مجموعة متنوعة من 10،11 luciferase المراسل الكواشف فحص التجارية ومحلية الصنع مع مستقرة إشارة الانارة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن الكاشف luciferase المراسل أعيد الاختيار إلى درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن حجم ما يكفي لجميع لوحات يعاير. 27 لوحةسوف تكون هناك حاجة ق 170 مل من luciferase المراسل كاشف مع الأخذ بعين الاعتبار التعامل السائل، أحواض حجم القتلى والخطوات pipetting لالمتكررة. صب كاشف luciferase المراسل في خزان ووضعه على طاولة الروبوت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 9 لوحات مع الخلايا من الحاضنة، ووضعها على طاولة الروبوت، والكشف عن وانتظر حتى معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 50 ميكرولتر من كاشف luciferase المراسل في لوحة جيدا من لوحة. بين لوحات، وإدخال تأخير يساوي الوقت في القراءة التلألؤ من لوحة واحدة. وهذا يؤكد أن يتم قياس جميع لوحات ضمن فترة زمنية متساوية من إضافة كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة 30 دقيقة، ووضع لوحة الأولى في luminometer وقياس التلألؤ بعد خطوة تهز وجيزة. أكرر للجميع لوحات. تسجيل الباركود من كل لوحة وربطه إلى ملف بيانات المطابق لتجنب الأخطاء الناجمة عن عدد كبير من لوحات التعامل معها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،2-3،3 مرتين ل18 لوحات المتبقية مع الخلايا. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ما تبقى من luciferase المراسل كاشف وتخزينه في -20 ° C. </li></ol> 4. يوم 4: تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عملية البيانات التجريبية باستخدام تطبيع جميع العينات إلى متوسط ​​ضوابط المعالجة مركبة على لوحة. لكل مجمع مكتبة، وحساب X القيمة المتوسطة وSD على يثلث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد يصل التنظيم ويضرب من خلال تحديد عتبة X ± ك × SD، حيث يتم احتساب X القيمة المتوسطة وSD على كل القيم فحص معالجتها، و k-تنظيم أسفل هو تعريف ثابت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عتبة التعسفية قطع &lt;20٪ من الضوابط المعالجة المركبة عند تخفيض إشارة luciferase المراسل هو على الارجح المرتبطة سمية المركب. والتخلص من الزيارات دون هذه العتبة تقلل إلى حد كبير عدد الزيارات إيجابية كاذبة في مكافحة الفرز. ملاحظة: بدلا من القائم على السيطرة التطبيع، البيانات التجريبية يمكن معالجة تطبيق Z درجة أو ما قوية التناظرية B قالأساسية 12. وبالإضافة إلى ذلك، تتوفر 12 النهج الإحصائية بديلة لاختيار تضررا. </li></ol> 5. مكافحة الفحص ملاحظة: المركبات التي تم تحديدها في الشاشة الرئيسية (المسمى &#39;يضرب&#39;) تأكدت وتقييمها لخصوصية من قبل مكافحة الفرز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكرز اختيار يضرب مختارة من مأخوذة المخزنة في واحدة أنابيب barcoded 2D وخلق فرص عمل جديدة &quot;ضرب لوحات&quot;، وتوفير تخطيط المقابل. لا تنسى أن تترك مواقف مجانية للضوابط. ملاحظة: في حالة عدم وجود نظام الانتقاء كفاءة، يمكن للمرء أن يختبر كل من السيطرة و3 &#39;UTR الحاملة للخلايا بالتوازي في الفحص الأولي. في هذه الحالة، سوف اختيار محددة من المركبات مع الآثار تعتمد فقط على قدم 3 &#39;UTR يكون ممكنا بعد الفحص الأولي مما يلغي الحاجة لمكافحة الفرز. ومع ذلك، فإن فحص مواز في اثنين من خطوط الخلايا مضاعفة فحصالتكاليف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد بروتوكول للفحص الأولي (القسم &quot;يوم 1: إعداد وخلايا البذور&quot;)، لكل &quot;ضرب لوحة&quot; إعداد ثلاث لوحات 96-جيدا من كل CHP134-mycn3UTR وCHP134-CTRL خلايا مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد بروتوكول للفحص الأولي (القسم &quot;يوم 2: علاج للخلايا مع مكتبة مركبات&quot;)، استخدم كل لوحة ضرب لعلاج ثلاثة CHP134-mycn3UTR وثلاث لوحات CHP134-CTRL في 2 ميكرومتر تركيز العمل. ملاحظة: في حين يتم تنفيذ الشاشة مضادة الموصوفة هنا في يثلث في جرعة واحدة من 2 ميكرومتر، قد يكون من المفيد استبدال مكررات القياسية واختبار يضرب في 3 تركيزات كما التخفيفات 10 أضعاف تتراوح بين 2 ميكرومتر إلى 20 نانومتر. ان تطبيق هذا النهج لن تسمح فقط لتأكيد البيانات من الشاشة الرئيسية، ولكن أيضا للحصول على بيانات الاستجابة للجرعة أولية عن الضربات الأولية، والتقليل من معدلات إيجابية كاذبة. في هذه الحالة، يجب أن يكون خط أنابيب تحليل مختلف تطبيق صحيفةإد لمعالجة البيانات التجريبية والتأكد من الزيارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد بروتوكول للفحص الأولي (القسم &quot;يوم 3: إجراء الفحص luciferase المراسل&quot;)، وقياس luciferase النشاط في جميع لوحات CHP134-mycn3UTR وCHP134-CTRL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد بروتوكول للفحص الأولي (القسم &quot;يوم 4: تحليل البيانات&quot;)، وتطبيع البيانات التجريبية من الآبار المعالجة إلى متوسط ​​ضوابط المعالجة مركبة على لوحة وحساب المتوسط ​​وSD على مكررات. لكل مجمع اختبارها، وحساب التغير أضعاف من luciferase النشاط في CHP134-mycn3UTR مقابل خلايا CHP134-CTRL. اختر تغيير أضعاف التعسفي خفض العرضية ل&gt; 1.5 وأهمية ص القيم ل&lt;0.01. ملاحظة: في إعدادات الفحص وصف المعلمة المحدد لضرب خصوصية هو تغيير أضعاف كبير من luciferase النشاط في CHP134-mycn3UTR مقابل خلايا CHP134-CTRL. إذا لزم الأمر، يمكن للمرء أن أيضا تقييم سمية المركبة عن طريق أداء في وقت واحد مقايسة بقاء الخلية على ذاتهمركبات lected. قد يكون هذا مفيدا خاصة إذا كان يضرب الأولية يتم فحص مكافحة في تحليل الاستجابة للجرعة. لجرعة واحدة، تجربتنا يشير إلى وجود علاقة قوية انخفاض luciferase النشاط مع انخفاض خلية بقاء 6. لذلك، انخفض luciferase النشاط في الخلايا المستهدفة وكذلك الخلايا السيطرة يمكن اعتباره مؤشرا على سمية المركب في تركيز اختبارها. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells.">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).</li><li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs.">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3&#8217;+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3&#8217; untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cell-Based+High-Throughput+Screen+Addressing+3&#8217;+UTR-Dependent+Regulation+of+the+MYCN+Gene.">A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3&#8217; UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene.</a> Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).</li><li>Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+developmental+biology,+cancer+genomics+and+immunotherapy.">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Herbst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexing+a+high-throughput+liability+assay+to+leverage+efficiencies.">Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies.</a> Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).</li><li>van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+luciferase+reporter+assay+for+cell-based+high-throughput+screening.">Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li><li>Hitti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ribosomal+protein+promoter-based+reporter+system+for+selective+assessment+of+RNA+stability+and+post-transcriptional+control.">A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control.</a> RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).</li><li>Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+regulatory+elements+in+conserved+3&#8217;+UTRs+of+human+transcripts.">Systematic identification of regulatory elements in conserved 3&#8217; UTRs of human transcripts.</a> Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J. Vis. Exp. (87), (2014).</li><li>Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3&#8217;+untranslated+region+of+messenger+RNA:+A+molecular+&#8220;hotspot&#8221;+for+pathology.">The 3&#8217; untranslated region of messenger RNA: A molecular &#8220;hotspot&#8221; for pathology.</a> Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).</li><li>Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+methods+to+monitor+the+modulation+of+mRNA+stability:+a+novel+approach+to+drug+discovery+and+therapeutic+intervention.">A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention.</a> J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).</li><li>Pascale, A., Govoni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+world+of+post-transcriptional+mechanisms:+is+their+deregulation+a+common+link+for+diseases?+Focus+on+ELAV-like+RNA-binding+proteins.">The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).</li><li>Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+pre-mRNA+processing+and+altered+architecture+of+3&#8217;+untranslated+regions+contribute+to+the+development+of+human+disorders.">Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3&#8217; untranslated regions contribute to the development of human disorders.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).</li><li>Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+GEMS--a+novel+platform+technology+targeting+post-transcriptional+control+mechanisms.">Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms.</a> Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).</li><li>Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+post-transcriptional+control+for+drug+discovery.">Targeting post-transcriptional control for drug discovery.</a> RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3&#8217; UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based ...

لتنظيم النسخي فترة طويلة من التعبير الجيني كان يعتقد أن تلعب الكبرى إن لم يكن دور الحصري في السيطرة على إنتاج البروتين. تراكم الأدلة، ومع ذلك، يشير إلى أن التنظيم بعد النسخي يساهم بقدر ما، إن لم يكن أكثر من والتنظيم النسخي لتحديد البروتين الخلوي وفرة 1،2. السيطرة بعد النسخي في التعبير الجيني هو أكثر تعقيدا وتفصيلا مما كان يعتقد في البداية. في الواقع، ظهرت جميع مراحل مختلفة من السيطرة ما بعد النسخي إلى أن ينظم، بما في ذلك تجهيز مرنا، التعريب، والدوران، والترجمة 3 فضلا عن وصفه حديثا عكسها RNA مثيلة 4. من عدد من عمليات التنظيم بعد النسخي يحتمل أن تتأثر، ووصف الفحص أدناه يركز على تلك التي تنطوي على &quot;المنطقة غير مترجمة (3 &#39;مرنا 3 UTR). 3 &#39;UTR يؤثر على نطاق واسع مرنا مصير أساسا عن طريق التفاعل محدد من ملزم RNA العلاقات العامةoteins والرنا غير المشفر إلى متواليات التنظيمية و / أو هياكل الثانوية 5. ولذلك، فإن الجزيئات الصغيرة التي تغير هذه التفاعلات أو تتداخل مع المنبع مسارات نقل الإشارة تحول التوازن الذي ينظم وفرة البروتين. هذا النهج العلاجي له أهمية خاصة بالنسبة لأمراض الإنسان التي أدلة موجود يظهر أن الجينات الأمراض ذات الصلة يتعرضون لتنظيم مرحلة ما بعد النسخي، والتي بالتالي تمثل هدفا محتملا للتدخل الدوائي. ولذلك، يمكن لنظم يسمح لفحص جهري مستويات مرنا من خلال التدخل في آليات الرقابة في مرحلة ما بعد النسخي في شكل الإنتاجية العالية تصبح أدوات قيمة في تحديد العلاجات رواية المحتملة. ووصف القائم على خلية مقايسة مراسل الجينات يسمح للتعرف على مركبات قادرة على تعديل مرنا مصير عبر آليات تعتمد على لها &#39;UTR 3. وهو يتألف من عدة ج الرئيسيةomponents (الشكل 1) ويتطلب بضع خطوات تمهيدية للتحقق من صحة جدوى الفحص. أولا وقبل كل شيء، تم تصميم بناء مراسل لتشمل UTR 3 &#39;من الجينات في المصالح. وتنصهر في &quot;UTR 3 إلى نهاية جين مراسل مثل يراعة luciferase (الشكل 1). سوف أية تغييرات في آليات الرقابة في مرحلة ما بعد النسخي المبذولة من خلال إدراج 3 &#39;UTR يغير من الاستقرار و / أو الكفاءة ترجمة هذا النص خيالية، مما أدى إلى مستويات luciferase المراسل متنوعة. لذلك، والتغيرات في luciferase النشاط تخدم مقياس غير مباشر كما في المتضررين التنظيم بعد النسخي من الجينات في المصالح. المكون الثاني من النظام هو بناء مراسل السيطرة، وهو التعبير البلازميد متطابقة أن يعبر عن نفسه مراسل الجينات ولكن لا تحتوي على أي 3 &#39;UTR. البلازميدات مراسل اثنين يمكن أن تصمم في المختبر باستخدام بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية التقليدية أو شراؤها من مصادر تجارية. اختيار خط الخلية المناسبة أمر بالغ الأهمية لبناء الفحص. الذي خط الخلية هو النموذج الأمثل يعتمد على عوامل عديدة تتراوح بين المتطلبات السريرية مثل تشابه القصوى لعلم الأمراض على القضايا العملية فقط مثل خصائص توافر، وtransfectability، والنمو. الأهم من ذلك، قبل المضي قدما ينبغي لأحد أن تأكد من أن انصهار 3 &#39;UTR إلى الجين مراسل له تأثير متوقع على مستوى النص خيالية. غياب اختلاف كبير في إشارة luciferase المراسل من 3 &#39;UTR الحاملة والسيطرة مراسل يبني عابر في الخلايا المحددة تشير إلى أن 3&#39; UTR ليس وظيفي في هذا النموذج الخلوي، مما دفع للبحث عن بديل منها. لتنسيق الإنتاجية العالية، 3 &#39;UTR الحاملة والسيطرة luciferase المراسل يبني مراسل ينبغي إدماج ثابت في خط الخلية المحددة. باستخدام متكاملة مستقر على مدى عابر transfectedخط الخلية هو الأفضل لعدة أسباب. هذا وسوف توسيع اختيار نموذج الخلوية بما في ذلك خطوط الخلايا التي يصعب بالنقل، والحد من التباين في البيانات الناشئة عن التقلبات في كفاءة ترنسفكأيشن، تهدأ التكاليف. وعلاوة على ذلك، على خلايا ترنسفكأيشن عابرة وفي أحيان كثيرة جدا مثقلة البلازميد الحمض النووي مما يؤدي إلى تشبع النظام. في هذه الإعدادات قد تكون زيادة أخرى في التعبير مراسل تحديا، مما أدى إلى انخفاض حساسية تجاه مركبات upregulating المحتملة. وأخيرا، عندما يتم تعيين كافة مكونات فحص ما يصل، فمن الأهمية بمكان قبل أن ينتقل إلى تنسيق الإنتاجية العالية لتحديد جدوى الفحص، أي إذا luciferase النشاط يمكن أن يكون في الواقع الأعلى وإلى الأسفل تنظم على وجه التحديد عن طريق إدخال 3 &quot; UTR. فإن أفضل الضوابط أن يكون جزيئات صغيرة ذكرت لتعديل الاستقرار أو ترجمتها من مرنا من خلال UTR 3 &#39;من الفائدة. إذا كان وجود هذه هيغير ممكن، وتقبل ضوابط بديلة تقليد التأثير المطلوب. يمكن أن تكون هذه miRNAs أو البروتينات ملزم RNA المعروف أن ممارسة آثارها عن طريق ملزمة ل&#39;UTR 3 من الفائدة. تقييم هذه الضوابط قبل الفحص الأولي يشير ليس فقط وظيفة الفحص المتقدمة، ولكن يسمح أيضا لتقدير لها ديناميكية نطاق والحساسية والأداء في شكل الإنتاجية العالية. باستخدام بروتوكول يصف نحن فرز مكتبة 2،000 مركبة 6. وقد استخدم العصبية، والأورام الصلبة خارج القحف الأكثر شيوعا من الطفولة، كنموذج البيولوجي و&quot;UTR 3 من الجين الورمي MYCN، الذي التضخيم يتوقع بقوة نتائج السلبية لالعصبية، باسم الجينات المستهدفة 7 الشكل 2 الخطوط العريضة لتخطيط التجريبية. تم تقسيم الفرز في ثلاثة أشواط مع حجم دفعة من 27 لوحات عرضه في تشغيل واحد. وتضمنت دفعة من 27 لوحات مكتبة الطيف مجموعةلوحات N.1-n.8 + n.25 (الجولة الأولى)، n.9-n.16 n.25 + (الجولة الثانية) وn.16-n.24 n.25 + (المدى الثالث)، كل لوحة عرضه في ثلاث نسخ. وهكذا، كان يعاير لوحة مكتبة واحدة (n.25) في جميع أشواط ثلاثة مما يجعل احتمال المقارنة بين التشغيل. يصف بروتوكول أدناه تشغيل واحد من 9 لوحات مكتبة اختبار في ثلاث نسخ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Culture plate 96-well White</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6005688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6008190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">100 ml disposable trough for reagents</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td>10 613 048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">300 ml disposable robotic reservoir</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">PB12001301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 50&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 200&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">3711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">ONE-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">RPMI</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-918F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">PBS-1X, w/o Ca++, Mg++</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">The Spectrum collection (compound library)</td>
			<td style="width:239px;">MicroSource Discovery Systems</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan Freedom EVO200 robot&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan F200 multiplate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for chemical modulators of post-transcriptionally regulated genes

كلا النسخي والتنظيم بعد النسخي يكون لها تأثير عميق على الجينات التعبير. ومع ذلك، تركز اعتمدت عادة خلية مقرها المقايسات الفرز على تنظيم النسخي، ويجري تهدف أساسا في تحديد جزيئات استهداف المروج. ونتيجة لذلك، يتم كشف آليات ما بعد النسخي إلى حد كبير من التعبير الجيني تطوير الأدوية المستهدفة. نحن هنا وصف فحص خلية القاعدة التي تهدف إلى التحقيق في دور &#39;المنطقة غير مترجمة (3&#39; 3 UTR) في التشكيل مصير مرنا لها، وإلى تحديد مركبات قادرة على تعديله. ويستند هذا الفحص على استخدام بناء luciferase المراسل تحتوي على &quot;UTR 3 من الجينات في المصالح المتكاملة ثابت في خط الخلية الأمراض ذات الصلة. وينقسم البروتوكول إلى قسمين، مع التركيز في البداية على غربلة أولية تهدف إلى التعرف على الجزيئات التي تؤثر luciferase النشاط بعد 24 ساعة من العلاج. الجزء الثاني من البروتوكوليصف ضرورية لتمييز المركبات تحوير luciferase النشاط على وجه التحديد من خلال UTR 3 &#39;الفرز مضادة. بالإضافة إلى بروتوكول مفصلة ونتائج ممثلة، ونحن نقدم اعتبارات هامة عن تطور الفحص والتحقق من ضرب (ق) على الهدف الذاتية. فإن وصفه خلية مقرها مراسل فحص الجينات تسمح للعلماء لتحديد جزيئات تحوير مستويات البروتين عن طريق آليات ما بعد النسخي تعتمد على &quot;UTR 3.

باستخدام نهج وصفها، وفرز مكتبة 2،000 مركبة لجهري المحتملة لآليات الرقابة في مرحلة ما بعد النسخي المبذولة من خلال &#39;UTR 3 من الجين MYCN الشكل 3 يصور نتائج الفرز الأولية يتضح من لوحة مكتبة واحدة. تم الحصول على إشارة luciferase المراسل عرض كنسبة مئوية من الضوابط المع...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes at JoVE.com

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Views.  University of Trento. Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Video: High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.