We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.

NOT: Bu tür deney sistemlerinin verimi mevcut HTS laboratuar ekipmanları bağlıdır. Bu protokol, 96-kuyu formatında sıvı taşıma yapan bir Tecan Freedom EVO 200 robot ile kolaylaştırılır. 384-gözlü formata minyatürleştirme da mümkündür. Robotik sıvı taşıma sistemi tüm deneysel adımlar sırasında aseptik koşullarda korumak için bir laminer akış kaputun altında konumlandırılmış. Herhangi bir sıvı işleme otomasyon mevcut ise, protokol hali hazırda düşük verimli bir formata adapte edilebilir. Birincil Eleme 1. Gün 1: hazırlayın ve Tohum Hücreler Not: Tohum hücreleri, lusiferaz aktivitesi, tohumlama sonra, yani 48 saat tahlil zamanında% 80 izdiham elde edilir. <ol><li> Süspanse% 10 FBS ve% 1 L-glutamin ihtiva eden RPMI içinde 2 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar CHP134-mycn3UTR nöroblastoma hücreleri tripsinize. 27 plakaları için en az 250 ml hazırlamak<html> Hesap sıvı taşıma dikkate alarak hücre süspansiyonu, ölü hacimleri ve tekrarlanan pipetleme adımlarını oluklara. Steril rezervuar içine hücre süspansiyonu dökün ve robot masanın üzerine yerleştirin. </li><li> 9 barkodlu beyaz düz tabanlı 96-kuyu plakaları ve robot masasının üzerine 200 ul steril pipet uçları bir kutu yerleştirin. Yerçekimi altında yerleşen hücreleri önlemek için her muafiyet adımından önce pipetleme hücre süspansiyonu karıştırın. Oyuk başına 1.5 x 10 4 hücrelerinin nihai yoğunluk elde etmek için 9 levhaların her bir kuyunun içine hücreleri 75 ul koyun. </li><li> Kapaklı plakaları örtün ve hücreler, alt tortu olanak sağlamak için 30 dakika boyunca kuluçka dışında bırakın. Bu kenar etkilerini en aza indirmek olacaktır. </li><li> Tekrar 27 plakaları toplam sayısını hazırlamak için iki kez 1.2 ve 1.3 adımları. </li><li> 37 ° C&#39;de plakalar yerleştirin ve% 5 CO2 ve 24 saat daha inkübe edilir. </li></ol> 2. Gün 2: Kütüphane Bileşikler ile Hücreler davranın ntent &quot;&gt; Not: Spektrum Koleksiyonu küçük molekül kütüphane DMSO içinde 10 mM konsantrasyonda 25 96 oyuklu plakalar içinde 8 sıra ve 10 sütundaki düzenlenmiş 2000 bileşiklerden oluşur, ilk ve son sütun üzerine kuyu kontroller için boş bırakılır. . Bileşim tarama tahlilleri tipik olarak 1-10 uM bileşik konsantrasyonu 8 gerçekleştirilir. Burada açıklanan tarama protokolü çalışma konsantrasyonu 2 uM ve analiz edilmesi son nokta olarak 24 saat giderir. <ol><li> Oda sıcaklığında 9 bileşik kütüphane plakaları çözülme. </li><li> Steril PBS ve PBS-% 0.5 DMSO çözümleri ile iki olukları hazırlayın ve robot masanın üzerine koyun. Her bir kütüphane levha için hazırlanması ve buna uygun olarak tek bir seyreltme plakası etiket - en az 400 ul bir çalışma hacmine sahip bir polipropilen U-tabanlı 96-çukurlu plaka. Sıvı eylemci sabit ipuçlarını kullanarak steril PBS 398 ul seyreltme plakaları 11 sütun 2 Her çukurun doldurun. Dolgu sütun 1 ve steril PBS 12 50 ile ulKontrol kuyuları araç konsantrasyonu (% 0.02) yeniden üretilmesi için,% 0.5 DMSO ile. </li><li> İki kütüphane tabak, buna etiketli seyreltme plakaları, 50 ul steril pipet uçları iki kutu ve robot masasına altı hücreleri tabak yerleştirin. Hücreler plakaları ortaya çıkarın. </li><li> Pipet 2, ilgili seyreltme plakası iki kütüphane tabakalarından biri 10 mM stok çözeltisi ul ve iyice karıştırın. Bu 50 uM&#39;lik bir ara bileşikler konsantrasyonu ile sonuçlanır. Uçları aynı kümesini kullanarak hücreleri ile 3 Barkodlanan beyaz 96 gözlü plakalar içinde 50 uM seyreltme 3 ul dağıtmak. Her bir konsantrasyonunu çalışan 2 uM Bu seyreltme şeması sonuçlar bileşik olarak test edilmiştir. NOT: ipuçları ile gereksiz manipülasyonlar önlemek kütüphane plakaları sadece 80 bileşikleri içeren olsa bile, baştan 96 ipuçları tam bir set kullanın. İlk ve kütüphane plakalarının son sütunları boş olduğundan bu mümkün. </li><li> Pipet ipuçları değiştirin ve St tekrarİkinci kütüphane plaka için ep 2.4. </li><li> Hücreler plakaları örtün ve 24 saat için inkübatör onları geri. </li><li> Kalan kütüphane plakaları için 2,3-2,6 iki kez daha Adımları. </li></ol> 3. Gün 3: Lüsiferaz Testi gerçekleştirin Not: lusiferaz deneyi gerçekleştirmeden önce, her bir kuyuya 9 bir hücre canlılığı endeksi elde etmek için resazurin azalmaya dayalı olarak, bir hücre canlılığı deneyi ile multipleks mümkündür. Çoğullama lusiferaz ve canlılık testi hücreleri, lusiferaz aktivitesi yeterince yüksek düzeyde sağlamak, ancak, göz ardı edilebilir, lusiferaz sinyalinin bir azalma deneyleri sonuçları. Lusiferaz aktivitesi sabit lüminesan sinyal ticari ve ev yapımı 10,11 lusiferaz deney reaktif çeşitli saptanabilir. <ol><li> Oda sıcaklığına kadar seçim yeniden lusiferaz reaktif dengelenmesi. Hacmi, tüm tahlil plakalar için yeterli olduğundan emin olun. 27 plaka içinlusiferaz reaktifi s 170 ml hesap sıvı taşıma dikkate alınarak gerekli olacaktır, ölü hacim ve tekrarlanan pipetleme adımlarını oluklara. Bir rezervuar içine lusiferaz reaktif dökün ve robot masanın üzerine yerleştirin. </li><li> , Inkübatör hücreleri ile 9 plakaları çıkarın robot masanın üzerine koyun, ortaya çıkarmak ve oda sıcaklığına dengelendi kadar bekleyin. Plakası ile plaka başına lusiferaz reaktifi 50 ul ekle. Plakalar arasında bir plaka lüminesans okuma süresine eşit bir gecikme. Bu, tüm plakaları reaktif ek eşit zaman aralığında ölçülür güvence altına alacaktır. </li><li> 30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, luminometrede birinci plaka yerleştirmek ve kısa bir çalkalama adımından sonra lüminesans ölçümü. Tüm plakaları için tekrarlayın. Her plaka barkod kaydedin ve ele plakaların çok sayıda kaynaklanan hataları önlemek için ilgili veri dosyasına ilişkilendirmek. </li><li> Tekrar hücreleri ile kalan 18 plakaları için iki kez 3,2-3,3 adımları. </li&gt; <li> Kalan lusiferaz reaktif toplayın ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 4. Gün 4: Veri Analizi <ol><li> On plaka, araçla tedavi edilen kontrollere ortalamasına tüm örneklerin normalleştirme kullanarak işlem deneysel veriler. Her kütüphane bileşik için, üçlü üzerinden ortalama değer x ve SD hesaplamak. </li><li> Seçin regülatör-yukarı ve aşağı düzenleyen ortalama değer x ve SD tüm tahlil işlenmiş değerler üzerinden hesaplanır SD, ve k × ± k X bir eşiği ayarlayarak hit tanımlı sabittir. </li><li> Rasgele bir eşik cut-off &lt;lusiferaz sinyalinin bir azalma muhtemelen bileşik toksisite ile ilişkili olan, araç ile tedavi edilen kontrol grubu% 20 seçin. Bu eşiğin altında hit atarak önemli ölçüde karşı tarama yalancı-pozitif hit bir dizi azaltacaktır. NOT: yerine denetimi tabanlı normalleştirme, deneysel veriler Z skoru ya da sağlam analog B s uygulanarak işlenebilirÇekirdek 12. Buna ek olarak, isabet seçimi için alternatif istatistiksel yaklaşımlar 12 mevcuttur. </li></ol> 5. Karşı-tarama Not: Primer taramada tespit edilen bileşikler doğruladı ve bir karşı tarama ile özgüllüğü için değerlendirilmektedir (&#39;hit &quot;etiketli). <ol><li> Kiraz ilgili düzenini tasarrufu, tek 2D barkodlu tüplerde saklanan alikotları seçilen hit almak ve yeni &quot;plakaları vurmak&quot; yaratmak. Kontroller için ücretsiz pozisyonları bırakmak unutmayın. Not: etkin kiraz toplama sisteminin yokluğunda, tek bir kontrol ve Primer taramada paralel olarak 3 &#39;UTR taşıyan hücreleri hem de test edebilir. Bu durumda, sadece kişiye 3 &#39;UTR bağlı etkileri olan bileşikler söz konusu seçimi, karşı tarama ihtiyacını ortadan kaldırarak Primer taramada sonra mümkün olacaktır. Ancak, iki hücre hatlarında paralel tarama deneyi katına çıkacakmaliyetler. </li><li> Primer tarama protokolüne (Bölüm &quot;1. Gün: hazırlayın ve Tohum hücreler&quot;) sonra, her bir &quot;hit levha&quot; her CHP134-mycn3UTR ve CHP134-CTRL kararlı üç hücre 96 oyuklu plakalar hazırlamak. </li><li> Birincil tarama için protokol (Bölüm &quot;Gün 2: Kütüphane Bileşikler ile Hücreler davranın&quot;) ardından, konsantrasyon çalışan 2 uM üç CHP134-mycn3UTR ve üç CHP134-CTRL plakaları tedavi etmek için her hit plakasını kullanın. Not: Burada tarif edilen karşı ekran 2 uM tek bir dozda, üç kez yapılır iken, standart çoğaltır yerine 2 uM 20 nM arasında değişen 10 kat seyreltik olarak 3 konsantrasyonlarda hit test etmek için faydalı olabilir. Bu yaklaşımı uygulamak sadece yanlış-pozitif oranları en aza indirerek, birincil hit üzerinde ön doz-yanıt verileri elde etmek de birincil ekran verileri teyit, ama izin vermedi. Bu durumda, başka bir analiz hattı başvurunun olmalıdıred deneysel verileri işlemek ve hit onaylamak için. </li><li> Birincil tarama için protokol (Bölüm &quot;Gün 3: Lüsiferaz Testi gerçekleştirin&quot;) ardından, tüm CHP134-mycn3UTR ve CHP134-CTRL plakaları lusiferaz aktivitesini ölçmek. </li><li> Primer tarama protokolüne (Bölüm &quot;4. Gün: Veri Analizi&quot;) sonra, on plaka, araçla tedavi edilen kontrollere ortalamasına işlenmiş olan gözeneklerden elde deneysel verileri normalleştirmek ve tekrarın ortalama ve SD hesaplar. Test edilen her bir bileşik için, CHP134-CTRL hücreleri vs CHP134-mycn3UTR lusiferaz etkinliğinin kat değişimi hesaplamak. Keyfi kat değişikliği cut-off&gt; &lt;0.01 1.5 ve önemi p-değerleri seçin. NOT: hit özgüllüğü için belirleyici parametre CHP134-CTRL hücreleri vs CHP134-mycn3UTR içinde lusiferazm önemli bir kat değişiklik açıklanan tahlil ayarlarında. Gerekirse, bir de se olarak eş zamanlı olarak, bir hücre canlılığı deneyi gerçekleştirilerek bileşik toksisitesini değerlendirmek olabilirseçilir ve bileşikler. Birincil hit bir doz yanıt analizinde karşı taranır Bu özellikle faydalı olabilir. Tek bir doz için, deneyim 6 hücre canlılığı azalmış indirgenmiş lusiferaz aktivitesinin güçlü bir korrelasyonu göstermektedir. Bu nedenle, hedef hücreleri ve kontrol hücreleri, lusiferaz aktivitesi azalmış Test edilen konsantrasyonda bileşiğin toksisitesinin bir göstergesi olarak kabul edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells.">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).</li><li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs.">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3&#8217;+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3&#8217; untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cell-Based+High-Throughput+Screen+Addressing+3&#8217;+UTR-Dependent+Regulation+of+the+MYCN+Gene.">A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3&#8217; UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene.</a> Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).</li><li>Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+developmental+biology,+cancer+genomics+and+immunotherapy.">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Herbst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexing+a+high-throughput+liability+assay+to+leverage+efficiencies.">Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies.</a> Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).</li><li>van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+luciferase+reporter+assay+for+cell-based+high-throughput+screening.">Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li><li>Hitti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ribosomal+protein+promoter-based+reporter+system+for+selective+assessment+of+RNA+stability+and+post-transcriptional+control.">A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control.</a> RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).</li><li>Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+regulatory+elements+in+conserved+3&#8217;+UTRs+of+human+transcripts.">Systematic identification of regulatory elements in conserved 3&#8217; UTRs of human transcripts.</a> Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J. Vis. Exp. (87), (2014).</li><li>Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3&#8217;+untranslated+region+of+messenger+RNA:+A+molecular+&#8220;hotspot&#8221;+for+pathology.">The 3&#8217; untranslated region of messenger RNA: A molecular &#8220;hotspot&#8221; for pathology.</a> Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).</li><li>Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+methods+to+monitor+the+modulation+of+mRNA+stability:+a+novel+approach+to+drug+discovery+and+therapeutic+intervention.">A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention.</a> J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).</li><li>Pascale, A., Govoni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+world+of+post-transcriptional+mechanisms:+is+their+deregulation+a+common+link+for+diseases?+Focus+on+ELAV-like+RNA-binding+proteins.">The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).</li><li>Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+pre-mRNA+processing+and+altered+architecture+of+3&#8217;+untranslated+regions+contribute+to+the+development+of+human+disorders.">Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3&#8217; untranslated regions contribute to the development of human disorders.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).</li><li>Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+GEMS--a+novel+platform+technology+targeting+post-transcriptional+control+mechanisms.">Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms.</a> Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).</li><li>Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+post-transcriptional+control+for+drug+discovery.">Targeting post-transcriptional control for drug discovery.</a> RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3&#8217; UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based ...

Gen ifadesinin uzun bir süre transkripsiyonel düzenleme için protein üretimini kontrol açık olmayan rolü ise önemli bir oynadığı düşünülmektedir edildi. Giderek artan kanıtlar, bununla birlikte, transkripsiyon sonrası düzenleme hücresel protein bolluğu 1,2 belirlemek için olduğu kadar, eğer değilse, transkripsiyonel düzenleme daha fazla katkı göstermektedir. Gen ifadesinin transkripsiyon sonrası kontrol ilk düşünce oldu çok daha karmaşık ve ayrıntılı. Aslında, post-transkripsiyonel kontrol tüm çeşitli aşamalarında mRNA işleme, lokalizasyonu, ciro, çeviri 3 gibi yeni açıklanan geri dönüşümlü RNA metilasyon 4 olmak üzere, düzenlendiği ortaya çıktı. Transkripsiyon sonrası düzenleme olan bir dizi işlem potansiyel olarak etkilenen kaynaktan deney aşağıda tarif edilen mRNA&#39;nın 3 &#39;çevrilmemiş bölge (3&#39; UTR) yer aldığı, bu odaklanmaktadır. 3 &#39;UTR geniş RNA bağlayıcı pr belirli etkileşim yoluyla esas mRNA kaderi etkilerdüzenleyici dizileri ve / veya ikincil yapılar 5 oteins ve kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar. Bu nedenle, bu etkileşimleri değiştirebilir veya yukarı sinyal iletim yollarında engel küçük moleküller, protein bolluğu düzenleyen dengeyi kayacak. Bu tedavi yaklaşımı olan bir kanıt, hastalık-ilgili genler, bu şekilde farmakolojik müdahale için potansiyel bir hedef temsil etmektedir post transkripsiyonel düzenlenmesinde tabi olduğunu gösteren Varlığından insan patolojilerinin için özel bir önem taşımaktadır. Bu nedenle, yüksek verimli bir formatta transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmaları ile girişim ile mRNA düzeyleri &#39;modülatörlerinin taranması için izin sistemleri, potansiyel yeni tedavi tanımlanmasında değerli araçlar olabilir. tarif edilen hücre bazlı bir raportör gen deneyi ile 3 &#39;UTR bağlı mekanizmalar yoluyla mRNA&#39;nın kaderi modüle edebilirler bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Birçok ana c oluşmaktadıromponents (Şekil 1) ve birkaç ön adım gerektirir tahlil fizibilite doğrulamak için. Her şeyden önce, raportör yapı, söz konusu geninden 3 &#39;UTR içerecek şekilde tasarlanmıştır. 3 &#39;UTR, örneğin ateşböceği lusiferaz (Şekil 1) gibi bir raportör genin ucuna kaynaştırılır. Takılı 3 &#39;UTR ile uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının herhangi bir değişiklik, çeşitli lusiferaz seviyelerinde elde edilen bu kimerik transkripti stabilitesini ve / veya translasyon etkinliğini değiştirir. Bu nedenle, lüsiferaz faaliyetindeki değişimler de ilgi konusu genin, etkilenen transkripsiyon sonrası düzenleme dolaylı ölçü vermektedir. sisteminin ikinci bileşeni, bir kontrol raportör yapı, aynı haberci genini tanımlayan fakat herhangi bir 3 &#39;UTR içermeyen benzer bir sentezleme plazmiddir. İki raportör plasmidleri, geleneksel moleküler biyoloji protokollerini kullanarak laboratuarda tasarlanmış ya da ticari kaynaklardan satın alınabilir. bir hücre sırasına seçimi deney yapımı için kritik önem taşır. Hangi hücre hattı optimum model kullanılabilirlik, transfectability ve büyüme özellikleri gibi sadece pratik konulara patolojiye maksimum benzerlik gibi klinik gereksinimlerine kadar pek çok faktöre bağlıdır. Önemlisi, önce bir raportör gen 3 &#39;UTR füzyon kimerik transkript düzeyinde beklenen etkiye sahip olduğundan emin olmalısınız devam etmek. 3 lusiferaz sinyali anlamlı fark olmaması alternatif olanlar arama için isteyen, UTR bu hücresel modelde işlevsel değil &#39;UTR taşıyan ve kontrol muhabiri geçici 3 belirtmek istiyorum seçilen hücrelerde transfekte yapılarını&#39;. Yüksek işleme kapasiteli bir düzende, 3 &#39;UTR taşıyan ve kontrol lusiferaz raportör yapılan ile kararlı bir şekilde seçilen bir hücre dizisindeki entegre edilmelidir. Kullanarak stabil bir şekilde geçici olarak üzerinde entegre transfekteHücre hattı, çeşitli nedenlerden dolayı tercih edilir. Bu maliyetleri azalır, transfeksiyon verimliliği hareketlerinden kaynaklanan veri değişkenliği azaltmak, zor transfect hücre hatları da dahil olmak üzere bir hücresel modelin seçimi genişletmek olacaktır. Ayrıca, geçici transfeksiyon hücreleri üzerine çok sık sistemin doygunluk giden bir DNA plazmid ile aşırı yük. Bu şartlarda raportör ekspresyonu daha fazla bir artışın potansiyel regülasyonunda bileşiklere karşı duyarlılık azalmasına neden zor olabilir. Tüm tahlil bileşenleri kurmak zaman lusiferaz aktivite gerçekten yukarı ve aşağı-regüle &#39;3 takılı yoluyla özellikle olabilir Son olarak, bu deneyde, yani fizibilitesini belirlemek için yüksek verimli formatına geçmeden önce kritik UTR. iyi kontrol ilgi 3 &#39;UTR ile mRNA stabilitesini veya çevrilebilirlik modüle etmek için rapor küçük moleküller olacaktır. Bu sahip isemümkün değil, istenen etkiyi taklit vekil kontroller kabul edilir. Bu miRNA&#39;ların veya ilgi 3 &#39;UTR bağlanma yoluyla etkilere neden olduğu bilinmektedir, RNA bağlanan proteinleri olabilir. Bu tür kontrollerin değerlendirilmesi primer tarama geliştirilen testin işlevselliğini gösterir, aynı zamanda yüksek verimli biçimde dinamik aralık, hassasiyet ve performans tahmini için izin verir sadece daha önce. Açıklanan protokol kullanarak biz 2.000 bileşik kütüphane 6 gösterildi. Nöroblastom, bebeklik en sık ekstrakraniyal solid tümör, bir biyolojik model olarak kullanıldı ve amplifikasyon MYCN onkogen, 3 &#39;UTR güçlü bir hedef genin 7 olarak nöroblastom olumsuz sonuç, tahmin. 2 deneysel düzen özetliyor Şekil. Tarama bir seferde elenmiş 27 plaka toplu boyutu ile üç aşamada bölündü. 27 plakaları toplu Spektrum Koleksiyonu kütüphane dahilPlakalar n.1-n.8 + n.25 (ilk çalıştırma), n.9-n.16 + n.25 (ikinci dönem) ve n.16-n.24 + n.25 (üçüncü dönem), her plaka üç nüsha olarak tarandı. Böylece, bir kütüphane plakası (n.25) mümkün arası çalışma karşılaştırma yapma üç çalışır içerisinde test edildi. protokol aşağıda üç kopya halinde test edilen 9 kütüphane tabakalarından tek bir çalışma açıklar.

<table><tbody><tr><td>Culture plate 96-well White</td><td>PerkinElmer</td><td>6005688</td><td></td></tr><tr><td>StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)</td><td>PerkinElmer</td><td>6008190</td><td></td></tr><tr><td>100 ml disposable trough for reagents</td><td>Tecan</td><td>10 613 048</td><td></td></tr><tr><td>300 ml disposable robotic reservoir</td><td>VWR</td><td>PB12001301</td><td></td></tr><tr><td>Robot tips DITI 50&amp;nbsp;&amp;mu;l Sterile</td><td>Tecan</td><td>30038607</td><td></td></tr><tr><td>Robot tips DITI 200&amp;nbsp;&amp;mu;l Sterile</td><td>Tecan</td><td>30038617</td><td></td></tr><tr><td>Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>3711</td><td></td></tr><tr><td>ONE-Glo Luciferase Assay System&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6120</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-918F</td><td></td></tr><tr><td>PBS-1x, w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200&amp;nbsp;mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>The Spectrum collection (compound library)</td><td>MicroSource Discovery Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO200 robot&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan F200 multiplate reader&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput screening for chemical modulators of post-transcriptionally regulated genes

Transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası düzenleme Her iki genlerin ifadesi üzerinde derin bir etkiye sahip. Ancak, yaygın olarak kabul edilen hücre tabanlı tarama deneyleri esas promotör hedefleme moleküllerinin belirlenmesi amaçlı olan, transkripsiyonel regülasyonu odaklanmak. Sonuç olarak, transkripsiyon sonrası mekanizmalar büyük ölçüde gen ifadesi hedeflenen ilaç gelişimi ile ortaya edilmektedir. Burada ve değiştirmek mümkün bileşiklerin belirlenmesi onun mRNA kaderi modülasyonunda 3 &#39;çevrilmemiş bölge (3&#39; UTR) rolünü araştırmak amacıyla bir hücre bazlı deney tarif eder. Deney kararlı bir şekilde hastalığa, ilgili hücre hattına entegre ilgi konusu bir genin 3 &#39;UTR içeren bir lusiferaz raportör yapının kullanımına dayanmaktadır. Protokol tedavi 24 saat sonra lusiferaz aktivitesi etkileyen moleküllerin tanımlanması amaçlı birincil tarama başlangıç ​​odaklanarak, iki parçaya ayrılmıştır. protokolün ikinci bölümüaçıklar karşı tarama özellikle 3 &#39;UTR ile lusiferaz aktivitesini modüle bileşikleri ayırmak için gerekli. Ayrıntılı protokol ve temsil sonuçlarına ek olarak, biz tahlil geliştirme ve endojen hedefe isabet (ler) doğrulama konusunda önemli hususlar sağlamaktadır. tarif edilen hücre bazlı bir raportör gen deneyi bilim adamları 3 &#39;UTR bağımlı transkripsiyon sonrası mekanizmalar yoluyla protein seviyelerini modüle molekülleri tanımlamak için izin verecektir.

Tarif edilen yaklaşımı kullanarak, MYCN geninin 3 &#39;UTR ile uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının potansiyel modülatörleri için bir 2000-bileşiği kütüphanesini taramıştır. 3, tek bir kütüphane plaka ile örneklenen primer tarama sonuçlarını tasvir etmektedir. Araç ile muamele edilen kontrol yüzdesi olarak gösterildi: Lusiferaz sinyali tek bir kütüphane plaka bileşikleri ile tedavi CHP134-mycn3UTR hücre plakaları üçer defa lu...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes at JoVE.com

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K Görüntüleme.  University of Trento. Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Video: High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetik

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Gelişim Biyolojisi

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Biyomühendislik

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Kanser Araştırmaları

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Tıp

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Biyoloji

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...