We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.

참고 : 이러한 분석 시스템의 처리량이 가능한 HTS 실험실 장비에 따라 달라집니다. 이 프로토콜은 96- 웰 포맷으로 액체 취급을 수행 테칸 프리덤 EVO 로봇 (200)에 의해 용이하게된다. 384- 웰 포맷 소형화도 가능하다. 로봇 액체 핸들링 시스템은 모든 실험 단계에서 무균 상태를 유지하기 위해 층류 후드 아래에 배치된다. 어떤 자동화 액체 처리가 없다면, 프로토콜 용이 낮은 스루풋 포맷으로 구성 될 수있다. 기본 검사 1. 1 일 : 준비 및 종자 세포 주 : 종자 세포는 루시퍼 라제 활성, 즉 시드 후, 48 시간을 분석시 80 % 합류를 얻었다. <ol><li> 재현 탁 10 % FBS, 1 % L- 글루타민을 함유하는 RPMI에서 2 × 105 세포 / ml의 농도로 CHP134-mycn3UTR 신경 아세포종 세포를 트립신 처리. 27 판은 적어도 250 ml의 준비<html> 계정 액 처리 고려 세포 현탁액, 데드 볼륨 반복 피펫 팅 단계를 쓰루. 멸균 저수지에 세포 현탁액을 붓고 로봇 책상에 놓습니다. </li><li> 9 바코드 흰색 평면 바닥 96 웰 플레이트 및 로봇 책상에 200 ㎕를 멸균 피펫 팁 상자를 놓습니다. 중력 침강 세포를 피하기 위해 각각의 불출 단계 이전 피펫 팅 세포 현탁액을 혼합한다. 웰 당 1.5 × 104 세포의 최종 농도를 얻기 위해 9 플레이트의 각 웰에 세포를 75 μL 분주. </li><li> 뚜껑 판을 덮고 세포가 우물의 바닥에 침전 수 있도록 30 분 동안 인큐베이터 이외의 장소에 둡니다. 이 가장자리의 영향을 최소화 할 것이다. </li><li> 반복 판 (27)의 총 개수를 준비하기 위해 1.2 배 및 1.3 단계. </li><li> 37 ° C에서 접시를 놓고 5 % CO 2, 24 시간 동안 배양한다. </li></ol> 2. 제 2 일 : 도서관 화합물과 세포 치료 ntent &quot;&gt; 참고 : 스펙트럼 컬렉션 작은 분자 라이브러리 DMSO 10 mM의 농도에서 25 96 웰 플레이트에서 8 행 10 열로 정렬 2,000 화합물로 구성되어 첫 번째와 마지막 열에 우물 컨트롤 비어 있습니다. . 화합물 스크리닝 분석은 일반적으로 1-10 μM 화합물 농도 (8)에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 검사 프로토콜은 작업 농도가 2 μM 및 분석 엔드 포인트로 24 시간을 해결합니다. <ol><li> 실온에서 9 화합물 라이브러리 플레이트를 해동. </li><li> 멸균 PBS와 PBS-0.5 % DMSO 솔루션 두 골짜기를 준비하고 로봇 책상에 배치합니다. 각 라이브러리 플레이트를 들어, 준비하고 그에 따라 하나의 희석 판 레이블 - 적어도 400 μL의 작업 양을 가진 폴리 프로필렌 U-바닥 96 웰 플레이트를. 액체 핸들러의 고정 된 정보를 사용하여 멸균 PBS 398 ㎕를 희석 판 (11)에 열 2의 각 웰을 입력합니다. 입력 열 1 멸균 PBS의 12 50 μL대조군 웰의 농도 비히클 (0.02 %)를 재생하기 위해서는 0.5 % DMSO로. </li><li> 두 라이브러리 판, 대응 표시된 희석 판, 50 ㎕를 멸균 피펫 팁의 두 상자와 로봇 책상에 여섯 세포 판을 놓습니다. 세포 판을 폭로. </li><li> 피펫이 해당 희석 플레이트에서 두 개의 라이브러리 판 중 하나에서 10 mM의 주식 솔루션의 μL 잘 섞는다. 이 50 μM의 중간 화합물 농도가 발생합니다. 팁의 동일한 세트를 사용하여, 셀 3 바코드 백색 96- 웰 플레이트에서 50 μM 희석액 3 μL 분주. 각각의 농도를 작동하는 2 μM에서이 희석 방식 결과는 화합물을 테스트했다. 참고 : 끝으로 불필요한 조작을 방지 라이브러리 판은 80 화합물을 포함하더라도, 처음부터 (96) 팁의 전체 세트를 사용합니다. 제 라이브러리 플레이트의 마지막 칼럼이 비어 있기 때문에 이것이 가능하다. </li><li> 피펫 팁을 교체하고 세인트 반복두 번째 라이브러리 플레이트 EP 2.4. </li><li> 세포 판을 덮고 24 시간 동안 인큐베이터에 반환. </li><li> 반복 나머지 라이브러리 판에 대한 2.3-2.6 두 번 더 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 주 3 : 루시퍼 라제 분석을 수행 주 : 루시퍼 라제 분석을 수행하기 전에, 각각의 웰 (9)로부터 세포 생존 지수를 얻기 위해 레사 주린 감소에 기초하여 세포 생존율 분석법로 다중화 할 수있다. 다중화 루시페라아제 및 생존 분석 세포는 루시퍼 라제 활성을 충분히 높은 수준을 제공하는 경우, 그러나, 무시 될 수 있다는 루시퍼 신호의 감소 분석 결과. 루시퍼 라제 활성은 안정한 발광 신호 상업 및 제 10,11 루시퍼 라제 분석 시약의 종류에 의해 검출 될 수있다. <ol><li> 실온으로 선택 재구성 루시퍼 라제 시약을 평형. 볼륨이 모든 정량하여 플레이트 충분히 있는지 확인합니다. 27 판의 경우루시 페라 제 시약의 170 ml의 계정 액체 처리에 복용해야합니다, 죽은 볼륨과 반복 피펫 팅 단계를 쓰루. 저수지에 루시퍼 라제 시약을 붓고 로봇 책상에 놓습니다. </li><li> 인큐베이터에서 세포와 9 판을 제거 로봇 책상에 배치, 발견하고 실온으로 평형을 때까지 기다립니다. 판에 의해 웰 플레이트 당 루시퍼 라제 시약의 5​​0 μl를 추가합니다. 플레이트 사이에, 하나의 플레이트 발광 판독 시간과 동일한 지연을 도입. 이것은 모든 플레이트 시약 첨가로부터 동일한 시간 내에 측정되는 것을 보장한다. </li><li> 30 분 인큐베이션 후에, 루미에서 제 1 플레이트를 배치하고 간단히 진탕 공정 후에 발광을 측정한다. 모든 판을 반복합니다. 각 플레이트의 바코드를 기록하고 처리 판에서 발생하는 다수의 실수를 방지하기 위해 대응하는 데이터 파일에 연관. </li><li> 반복 세포와 나머지 18 판 두 번 3.2-3.3 단계를 반복합니다. </리&gt; <li> 나머지 루시 페라 제 시약을 수집하고 -20 ° C에서 보관합니다. </li></ol> 4. 주 4 : 데이터 분석 <ol><li> 에 판 차량 처리 컨트롤의 평균에 모든 샘플의 정상화를 사용하여 프로세스 실험 데이터. 각 라이브러리 화합물, 삼중 위에 평균값 X 및 SD를 계산. </li><li> 선택 조절 - 위 아래로 조절 평균 값 x와 SD는 모든 분석 처리 값에 대해 계산되는 SD, 및 K × K ± X의 임계 값을 설정하여 안타를 정의 상수이다. </li><li> 임의의 임계 컷오프 &lt;루시퍼 신호의 감소는 아마도 화합물 독성과 연관된 차량 제어 처리의 20 %를 선택한다. 이 임계 값 아래 안타를 폐기하는 것은 크게 반대 검사에서 위양성 히트 수를 줄일 수 있습니다. 참고 : 대신 제어 기반의 정상화, 실험 데이터는 Z 점수 또는 강력한 아날로그 B s을 (를) 적용 처리 할 수​​ 있습니다코어 (12). 또한, 히트 선택을위한 다른 통계 접근 방식은 12 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 카운터 검사 참고 : 기본 화면에서 확인 된 화합물을 확인하고 카운터 검사에 의한 특이성에 대한 평가 ( &#39;히트&#39;라는 레이블이 붙어 있음). <ol><li> 체리는 해당 레이아웃을 저장, 단일 2D 바코드 튜브에 저장된 분량에서 선택한 안타를 선택하고 새로운 &quot;판을 칠&quot;만듭니다. 컨트롤에 대한 무료 위치를 떠날 것을 잊지 마십시오. 주 : 효율적인 체리 픽킹 시스템의 부재에서 하나의 제어 및 일차 스크리닝 평행 3 &#39;UTR - 내포 세포 모두를 테스트 할 수있다. 이 경우, 도입 된 3 &#39;UTR에 의존 효과를 갖는 화합물의 특정 선택은 반대의 스크리닝 불필요 차 선별 후 가능할 것이다. 그러나, 두 개의 세포주에서 병렬 검사는 분석을 두 배로비용. </li><li> 차 선별을위한 프로토콜 (절 &quot;1 일 : 준비 및 종자 세포&quot;)에 따라, 각각의 &quot;히트 판&quot;각 CHP134-mycn3UTR 및 CHP134-CTRL 안정적 세포의 세 96 웰 플레이트를 준비합니다. </li><li> 차 선별을위한 프로토콜 (절 &quot;주 2 : 도서관 화합물과 세포 치료&quot;)에 따라, 농도를 작동하는 2 μM에서 세 CHP134-mycn3UTR 세 CHP134-CTRL 판을 치료하기 위해 각각의 히트 플레이트를 사용합니다. 주 : 여기에서 설명 된 이의 화면이 μM의 단일 투여 량으로 3 회 반복 수행되는 동안, 그것은 표준 복제물 대체 2 μM 내지 20 nM의 범위의 10 배 희석 물로 3 농도 히트를 테스트하는 것이 유익 할 수도있다. 이 접근법을 적용하는 것은 단지 위양성 요금을 최소화 차 안타 예비 용량 - 반응 데이터를 획득하는 것도 기본 화면의 데이터를 확인하지만, 허용하지 않을 것이다. 이 경우, 서로 다른 파이프 라인 분석 애플리되어야에드 실험 데이터를 처리하고 안타를 확인합니다. </li><li> 차 선별을위한 프로토콜 (절 &quot;주 3 : 루시퍼 라제 분석을 수행&quot;)에 따라, 모든 CHP134-mycn3UTR 및 CHP134-CTRL 판에서 루시 페라 제 활성을 측정합니다. </li><li> 차 선별을위한 프로토콜 (절 &quot;주 4 : 데이터 분석&quot;) 다음에 판 차량 처리 컨트롤의 평균 처리 된 우물에서 실험 데이터를 정상화하고 반복 실험을 통해 평균과 SD를 계산합니다. 각 시험 화합물의 경우, CHP134-CTRL 세포 대 CHP134-mycn3UTR 루시퍼 라제 활동의 배의 변화를 계산한다. 임의의 배 변경 컷 - 오프&gt; &lt;0.01의 1.5 중요성 P-값을 선택합니다. 참고 : 히트 특이성에 대한 결정 매개 변수가 CHP134-CTRL 세포 대 CHP134-mycn3UTR 루시퍼 라제 활동의 중요한 배의 변화 기술 분석 설정에서. 필요한 경우, 하나는 SE에서 동시에 세포 생존 분석을 수행하여 화합물의 독성을 평가할 수있다선택 된 화합물. 차 히트는 용량 반응 분석에서 카운터를 차단하는 경우에 특히 도움이 될 수 있습니다. 단일 투여를 들어, 우리의 경험은 6 세포 생존율이 감소하여 감소 된 루시퍼 라제 활성의 강한 상관 관계를 나타낸다. 따라서, 표적 세포뿐만 아니라 대조군 세포에서 루시퍼 라제 활성을 감소는 시험 농도에서 화합물 독성의 지표로 간주 될 수있다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3&#8217; UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based ...

유전자 발현의 장기간 전사 조절에 단백질 생산을 조절 배타적이지 않은 경우 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각 하였다. 축적 된 증거 그러나, 전사 후 조절은 세포 단백질 풍부 1,2-를 결정하는만큼, 그렇지 않은 경우, 전사 조절 이상 기여 것을 나타낸다. 유전자 발현의 전사 후 제어는 제 생각에보다 훨씬 더 복잡하고 정교하다. 사실, 전사 후 제어 모든 다양한 단계는 mRNA의 프로세싱, 지역화, 회전율, 번역 3뿐만 아니라 새롭게 기재된 가역적 RNA 메틸화 4 포함한 조절되는 것으로 나왔다. 전사 후 조절 프로세스의 개수가 영향을받을 가능성에서, 분석은 후술 mRNA의 3 &#39;비 번역 영역 (3&#39;UTR)을 포함하는 것들에 집중한다. 3 &#39;UTR는 크게 RNA 결합 홍보의 특정 상호 작용을 통해 주로 mRNA의 운명에 영향을 미칩니다규제 시퀀스 및 / 또는 보조 구조 5 oteins 및 비 코딩 RNA를. 따라서, 이러한 상호 작용을 변경하거나 업스트림 신호 전달 경로를 방해 소분자 단백질 존재 량을 조절하는 밸런스를 이동한다. 이 치료 방법은있는 증거가 질병 관련 유전자를 따라서 약물 학적 개입의 대상이 될 가능성을 나타내는 전사 후 조절,을 실시한다 보여주는 존재하는 인간의 병리 특히 중요하다. 따라서, 높은 처리량 형식의 전사 후 조절 기전과의 간섭을 통해 mRNA 수준 &#39;조절제의 스크리닝을 가능 시스템은 잠재적 인 신규 한 치료의 확인에 유용한 도구가 될 수있다. 셀 기반 기술 된 리포터 유전자 분석법은 3 &#39;UTR에 의존 기전을 통해 mRNA의 운명을 조절 할 화합물의 식별을 허용한다. 그것은 몇 가지 주요한 C로 구성omponents (그림 1)과 몇 가지 예비 단계를 필요는 분석의 타당성을 검증합니다. 우선, 리포터 구조물은 관심 유전자의 3 &#39;UTR을 포함하도록 설계된다. 3 &#39;UTR은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (도 1)와 같은 리포터 유전자의 말단에 융합된다. 삽입 된 3 &#39;UTR을 발휘 전사 후 조절 메커니즘의 변경은 다양한 루시 페라 수준의 결과,이 키메라 성적 증명서의 안정성 및 / 또는 번역 효율을 변경합니다. 따라서, 루시 페라 제 활동의 변화는 관심의 유전자의 영향을받는 전사 후 조절의 간접 측정을 제공합니다. 시스템의 제 2 성분 제어 리포터 구조체 같은 리포터 유전자를 발현하지만 임의 3 &#39;UTR을 포함하지 않는 동일한 발현 플라스미드이다. 두 개의 리포터 플라스미드는 종래의 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 실험실에서 설계 또는 시판 처로부터 구입할 수있다. 적절한 세포주의 선택은 구조 분석에 중요하다. 어떤 세포주가 최적의 모델입니다 가용성, transfectability, 성장 특성 같은 단지 실제적인 문제에 대한 병리 최대 유사 같은 임상 적 요구 사항에 이르기까지 수많은 요인에 따라 달라집니다. 중요한 것은, 이전에 하나의 리포터 유전자 3 &#39;UTR의 융합 키메라 성적의 수준에 예상되는 효과가 있는지 확인해야합니다 진행합니다. 3에서 루시 페라 제 신호에 유의 한 차이가 없으면 다른 사람의 검색하라는 메시지 UTR이 세포 모델에서 작동하지 않습니다 &#39;UTR 베어링 및 제어 기자가 일시적으로 (3)가 있음을 나타냅니다 선택한 셀에 형질 구축&#39;. 고 스루풋 포맷의 경우, 3 &#39;UTR 베어링 및 제어 루시퍼 라제 리포터 구조물을 안정적으로 선택된 세포주에 통합되어야한다. 사용하여 안정적으로 일시적를 통해 통합 된 형질 전환세포계는 여러 가지 이유로 바람직하다. 이것은 비용을 가시고, 형질 전환 효율의 변동으로부터 발생하는 데이터의 변동을 감소 어려운 트랜 세포주를 포함한 셀룰러 모델의 선택 범위를 확장 할 것이다. 또한, 일시적인 형질 세포에 매우 자주 시스템의 포화에 이르는 DNA 플라스미드 오버로드됩니다. 이러한 설정에서 기자 발현의 추가 증가는 잠재적 인 상승 조절 화합물으로 감소 감도의 결과, 문제가 될 수 있습니다. 모든 분석 성분을 설정할 때 루시퍼 라제 활성이 참으로 상향 및 하향 조절 3 &#39;삽입을 통해 구체적으로 될 수있는 경우 마지막으로, 그것은 분석, 즉의 타당성을 결정하기 위해 고 스루풋 포맷으로 이동하기 전에 중요 UTR. 가장 관심 컨트롤 3 &#39;UTR을 통해 mRNA의 안정성 또는 번역 능력을 조절하는 것으로보고 소분자 것이다. 이러한를 갖는 경우가능하지, 원하는 효과를 모방 대리 컨트롤이 허용됩니다. 이러한 miRNA가 또는 관심의 3 &#39;UTR에 결합을 통해 그 효과를 발휘하는 것으로 알려져 RNA 결합 단백질이 될 수 있습니다. 이러한 제어 평가 일차 스크리닝 분석법 개발의 기능을 나타내고, 또한 높은 스루풋 포맷의 동적 범위, 감도 및 성능 추정을 허용하지 전에 만. 설명 프로토콜을 사용하여 우리는 2,000 화합물 라이브러리 (6) 상영. 신경 모세포종, 유아기의 가장 흔한 두개 외 고형 종양은 생물학적 모델로서 사용하고, 증폭 MYCN 종양 유전자의 3 &#39;UTR 강하게 표적 유전자는 7 아세포종의 불리한 결과를 예측한다. (2) 실험 레이아웃을 설명도. 심사는 하나의 실행에서 상영 27 판의 배치 크기로 3 실점으로 분할되었다. 27 판의 배치는 스펙트럼 컬렉션 라이브러리를 포함플레이트 N.1 - n.8 + n.25 (첫 번째 실행), n.9-n.16 + n.25 (두 번째 실행)과 n.16 - n.24 + n.25 (제 3 군), 각 판은 세중에서 상영. 따라서, 하나의 라이브러리 판 (n.25)이 가능한 간 실행 비교를 세 가지 실행 내에서 측정 하였다. 이 프로토콜은 아래 중으로 시험 9 라이브러리 판의 단일 실행에 대해 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Culture plate 96-well White</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6005688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6008190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">100 ml disposable trough for reagents</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td>10 613 048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">300 ml disposable robotic reservoir</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">PB12001301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 50&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 200&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">3711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">ONE-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">RPMI</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-918F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">PBS-1X, w/o Ca++, Mg++</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">The Spectrum collection (compound library)</td>
			<td style="width:239px;">MicroSource Discovery Systems</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan Freedom EVO200 robot&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan F200 multiplate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for chemical modulators of post-transcriptionally regulated genes

전사와 전사 후 조절은 모두 유전자 발현에 지대한 영향을 미친다. 그러나, 일반적으로 채택 세포 기반 스크리닝 분석은 본질적으로 프로모터 대상 분자의 식별을 목표로하고, 전사 조절에 초점을 맞 춥니 다. 그 결과, 전사 후 기전은 주로 유전자 발현 표적 약물 개발에 의해 발견된다. 여기에서 우리는 그것을 수정할 수 화합물을 식별하는 자사의 mRNA의 운명의 변조의 3 &#39;번역 영역 (3&#39;UTR)의 역할을 조사하기위한 셀 기반 분석을 설명합니다. 분석은 안정 질병 관련 세포주에 통합 관심 유전자의 3 &#39;UTR을 포함하는 루시퍼 라제 리포터 구조물의 사용에 기초한다. 프로토콜은 치료 후 24 시간 후 루시퍼 라제 활성에 영향을 미치는 분자 식별 목적 일차 스크리닝에서 초기 포커스로, 두 부분으로 분할된다. 프로토콜의 두 번째 부분설명 카운터 선별 특히 3 &#39;UTR을 통해 루시퍼 라제 활성을 조절 화합물을 구별 할 필요가있다. 프로토콜 상세 및 대표적인 결과 외에, 우리는 분석법 개발 및 내인성 표적에 적중 (들)의 유효성에 대한 중요한 고려 사항을 제공한다. 셀 기반 기술 된 리포터 유전자 분석법 과학자 3 &#39;UTR에 종속 전사 후 기전을 통해 단백질 수준을 조절 분자를 식별 할 수 있도록 할 것이다.

설명 된 접근법을 사용하여, 우리는 MYCN 유전자의 3 &#39;UTR 누두 전사 후 제어 메커니즘의 전위 조절제 위해 2,000 화합물 라이브러리를 스크리닝.도 3은 하나의 라이브러리 플레이트로 예시 일차 스크리닝의 결과를 도시도. 비히클 - 처리 된 콘트롤의 백분율로서 표시 루시페라아제 신호는 단일 라이브러리 플레이트 화합물로 처리-mycn3UTR CHP134 세포 중으로 판에 루시...

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K 조회수.  University of Trento. Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

비디오: High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

연구

생물학

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

자동화 모​​듈 높은 처리량 엑소 폴리 사카 라이드 심사 플랫폼은 매우 민감한 탄수화물 지문 분석과 결합

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...