We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.

注：そのようなアッセイシステムのスループットは、利用可能なHTSのラボ機器に依存します。このプロトコルは、96ウェルフォーマットで液体ハンドリングを行うテカン自由EVO 200ロボットによって促進される。 384ウェルフォーマットの小型化も可能である。ロボット液体ハンドリングシステムは、全ての実験工程の間、無菌状態を維持するために、層流フードの下に配置されている。に液体ハンドリング自動化が可能でない場合、プロトコルは、容易に低スループットフォーマットに適合させることができる。 一次スクリーニング 1. 1日目：準備し、種細胞 NOTE：種子細胞はルシフェラーゼ活性、播種後、すなわち 、48時間の検定時に80％のコンフルエンスが得られた。 <ol><li>再懸 ​​濁し、10％FBSおよび1％L-グルタミンを含むRPMI中で2×10 5細胞/ mlの濃度にCHP134-mycn3UTR神経芽腫細胞をトリプシン処理。 27プレート用の少なくとも250ミリリットルを準備<html>アカウント液体ハンドリングを考慮細胞懸濁液は、デッドボリュームを繰り返しピペット操作谷。無菌のリザーバに細胞懸濁液を注ぎ、ロボット机の上に置きます。 </li><li> 9バーコード白平底96ウェルプレートとロボットの机の上に200μlの滅菌ピペットチップの箱を置きます。重力下で沈降細胞を避けるために、各分注工程の前に、ピペッティングにより細胞懸濁液を混合する。ウェルあたり1.5×10 4細胞の最終密度を得るために9プレートの各ウェルへの細胞の75μlの分注する。 </li><li>蓋でプレートをカバーし、細胞がウェルの底に沈降することを可能にするために30分間インキュベーターの外にそれらを残す。これは、エッジ効果を最小化する。 </li><li>繰り返し27プレートの総数を調製するために、二度1.2および1.3を繰り返す。 </li><li> 37℃でプレートを置き、5％CO 2および24時間インキュベート。 </li></ol> 2. 2日目：ライブラリ化合物を用いて細胞を処理ntent &quot;&gt;注：スペクトラムコレクション小分子ライブラリーは、DMSO中10mMの濃度で、25を96ウェルプレートに8行10列に配列された2000の化合物で構成され、最初と最後のカラムにウェルをコントロールの空のままにされている。 。化合物スクリーニングアッセイは、通常、1〜10μMの化合物濃度8で実行されている。ここで説明するスクリーニングプロトコルは、アッセイのエンドポイントとして使用濃度として2μM、24時間を修正します。 <ol><li>室温で9化合物ライブラリープレートを解凍する。 </li><li>滅菌PBSとPBS-0.5％のDMSO溶液で2谷を準備し、ロボットの机の上に置きます。少なくとも400μlの作業容積でポリプロピレンU底96ウェルプレート - 各ライブラリープレートについては、それに応じてつの希釈プレートを調製し、ラベルを付けます。液体ハンドラの固定チップを使用して滅菌PBSの398μlの希釈プレートの11に列2の各ウェルを埋める。無菌PBS50μlと列1および12を埋める対照ウェルにおける車両濃度（0.02％）を再生するために、0.5％のDMSOを含む。 </li><li>ロボット机の上に2ライブラリのプレート、それに応じてラベル希釈プレート、50μlの滅菌したピペットチップと6セルプレートの2箱を置きます。細胞プレートを発見する。 </li><li>対応する希釈プレート内の2つのライブラリプレートの1から10 mMのストック溶液をピペットを2μl、よく混ぜる。これは、50μMの中間体化合物の濃度になります。チップの同じセットを使用して、細胞と3バーコードの白色96ウェルプレートに50μMの希釈液3μlを分配する。各々の濃度を作業2μMでこの希釈スキームの結果は、化合物をテストした。 注：ライブラリプレートは唯一の80の化合物が含まれているにもかかわらず、最初から96のヒントの完全なセットを使用し、ヒントを不要な操作を避けるために。第ライブラリプレートの最後の列は空であるので、これは可能である。 </li><li>ピペットチップを交換して、聖を繰り返す第二のライブラリプレート用EP 2.4。 </li><li>細胞プレートをカバーし、24時間培養器に戻す。 </li><li>繰り返して、残りのライブラリプレート用2.3から2.6をさらに2回繰り返します。 </li></ol> 3. 3日目：ルシフェラーゼアッセイを行う注：ルシフェラーゼアッセイを行う前に、各ウェルからの9細胞生存率を得るために、レサズリンの還元に基づく細胞生存率アッセイでそれを多重化することが可能である。多重ルシフェラーゼおよび生存率アッセイ細胞を、ルシフェラーゼ活性の十分に高いレベルを提供する場合、しかし、無視できるルシフェラーゼシグナルの減少アッセイの結果。ルシフェラーゼ活性は、安定した発光シグナルの商業自家製10,11ルシフェラーゼアッセイ試薬の多様によって検出することができる。 <ol><li>室温への最適な再構成されたルシフェラーゼ試薬を平衡化する。ボリュームはすべてのアッセイされたプレートには十分であることを確認してください。 27プレートのためにSルシフェラーゼ試薬の170ミリリットルは、アカウントの液体処理を考慮して必要とされる、デッドボリュームと繰り返しピペット操作ステップを谷。リザーバにルシフェラーゼ試薬を注ぎ、ロボット机の上に置きます。 </li><li>インキュベーターから細胞と9のプレートを取り外し、ロボット机の上に置き、明らかにし、室温に平衡化するまで待つ。プレートによってウェルプレートあたりルシフェラーゼ試薬50μlのを追加。プレート間に、一方のプレートの発光読み取り時間に等しい遅延を導入する。これは、すべてのプレートが試薬添加から等しい時間間隔内に測定されることを保証する。 </li><li> 30分間のインキュベーション後、ルミノメーターで第一プレートを配置し、簡単な振盪工程後の発光を測定する。すべてのプレートについて繰り返します。各プレートのバーコードを記録し、取り扱いのプレートの大多数から生じるミスを避けるために、対応するデータファイルに関連付けます。 </li><li>繰り返して細胞と残りの18プレート用二度3.2から3.3を繰り返します。 </LI&gt; <li>残りのルシフェラーゼ試薬を収集し、-20℃で保管してください。 </li></ol> 4. 4日目：データ解析<ol><li>オンプレートビヒクル処置対照の平均にすべてのサンプルの正規化を使用して、プロセスの実験データ。各ライブラリー化合物については、トリプリケートにわたる平均値XおよびSDを計算。 </li><li>選択してアップレギュレートおよびダウンレギュレートの平均値xとSDが全てのアッセイ処理された値に対して計算されているSD、およびK×K±xのしきい値を設定することでヒットを定義された定数である。 </li><li>ルシフェラーゼシグナルの減少は、おそらく、化合物の毒性に関連付けられている場合、任意の閾値カットオフ&lt;ビヒクル処置対照の20％を選択する。このしきい値以下のヒットを破棄することが大幅カウンタースクリーニングで偽陽性ヒット数を減らすことができます。 注：代わりに、制御系の正常化のため、実験データは、Zスコアまたはその堅牢なアナログB sに適用して処理することができるコア12。また、ヒットの選択のための代替統計的アプローチは12利用可能です。 </li></ol> 5.カウンタースクリーニング注：一次スクリーニング（ラベル「ヒット」）で同定された化合物は、カウンタースクリーニングにより特異性について確認され、評価される。 <ol><li>チェリーは単一の2Dバーコードのチューブに格納されている分量から選択ヒットを選んで、「プレートをヒット &quot;新しいを作成し、対応するレイアウトを保存する。コントロールの自由な位置を残すことを忘れないでください。 注：効率的なチェリー·ピッキングシステムが存在しない場合には、1を制御し、一次スクリーニングで並行して、3 &#39;UTRを有する細胞の両方をテスト可能性があります。この場合、唯一の導入3 &#39;UTR依存効果を有する化合物の特定の選択は、カウンタースクリーニングの必要性を排除し、一次スクリーニングの後に可能となる。しかし、2つの細胞株における並列スクリーニングアッセイを倍増コスト。 </li><li>一次スクリーニングのためのプロトコル（セクション &quot;1日目：準備し、種細胞」）に続いて、各「ヒットプレート」のために各CHP134-mycn3UTRとCHP134-CTRL安定した細胞の3の96ウェルプレートを準備します。 </li><li>一次スクリーニングのためのプロトコル（セクション「2日目：ライブラリ化合物を用いて細胞を処理」）に続いて、作業濃度2μMで3 CHP134-mycn3UTRと3 CHP134-CTRLプレートを治療するための各ヒットプレートを使用しています。 注：ここで説明するカウンター画面が2μmの単回投与で、三連で行われている間、それは標準の複製を代用し、2μMから20の範囲の10倍希釈液として3濃度でのヒットをテストすることは有益かもしれません。このアプローチを適用する一次画面のデータを確認することを可能にするだけでなく、一次ヒットの予備的な用量 - 応答データを取得するために、偽陽性率を最小化する。この場合、異なる解析パイプラインはアプリであるべき実験データを処理し、ヒットを確認するために、編。 </li><li>一次スクリーニングのためのプロトコル（セクション「3日目：ルシフェラーゼアッセイの実行」）に続いて、すべてのCHP134-mycn3UTRとCHP134-CTRLプレートでルシフェラーゼ活性を測定する。 </li><li>一次スクリーニングのためのプロトコル（セクション「4日目：データ解析 &quot;）に続いて、オンプレートビヒクル処置対照の平均に処理したウェルからの実験データを正規化し、反復実験にわたる平均およびSDを計算する。試験した各化合物について、CHP134-CTRL細胞対CHP134-mycn3UTRにおけるルシフェラーゼ活性の変化倍率を計算する。任意の倍率変化カットオフ&gt; &lt;0.01の1.5と意義p値を選択します。 注：記載されているアッセイの設定でヒット特異性のための行列式のパラメータは、CHP134-CTRL細胞対CHP134-mycn3UTRにおけるルシフェラーゼ活性の有意な倍率変化である。必要に応じて、一つ又それに並行して細胞生存率アッセイを行うことにより、化合物の毒性を評価するかもしれないlected化合物。一次ヒットは、用量反応分析でカウンタースクリーニングされる場合に特に有益であり得る。単回投与のために、我々の経験は6細胞生存率の低下を低減し、ルシフェラーゼ活性の強い相関関係を示している。従って、標的細胞におけるルシフェラーゼ活性の低下、並びにコントロール細胞は、試験した濃度で、化合物の毒性の指標と考えることができる。 </li></ol>

<ol>
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Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).</li><li>Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+post-transcriptional+control+for+drug+discovery.">Targeting post-transcriptional control for drug discovery.</a> RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3&#8217; UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based ...

長期間の遺伝子発現の転写調節は、タンパク質産生の制御において主要でない場合、排他的な役割を果たしていると考えられた。証拠を蓄積するが、転写後調節は、細胞のタンパク質存在量1,2を決定する限り、そうでない場合、転写調節よりも寄与していることを示している。遺伝子発現の転写後制御は、最初に考えただけであったよりはるかに複雑かつ精巧である。実際には、転写後制御のすべての様々な段階は、mRNAプロセシング、局在、代謝回転、並進3と同様に、新たに記載の可逆的RNAのメチル4を含む、調節されることが浮上している。潜在的に影響を受けた転写後調節プロセスの数から、以下に記載のアッセイは、mRNAの3 &#39;非翻訳領域（UTR）に関与するものに焦点を当てている。 3 &#39;UTRは広く、主にRNA結合PRの特異的相互作用を介してmRNAの運命に影響を与えるその調節配列および/ ​​または二次構造5 oteinsおよび非コードRNA。したがって、これらの相互作用を変化させるか、上流のシグナル伝達経路を妨害する小分子は、タンパク質の存在量を調節するバランスをシフトする。この治療アプローチは、証拠は、疾患関連遺伝子がこのような薬理学的介入のための潜在的標的を表す転写後調節に供されていることを示す存在するヒトの病状のために特に重要である。したがって、ハイスループット形式における転写後制御機構との干渉を介してmRNAレベル「モジュレーターのスクリーニングを可能にするシステムは、潜在的な新規治療の同定に有用なツールになることができる。 記載した細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイは、その3 &#39;UTR依存メカニズムを介してmRNAの運命を調節することができる化合物の同定を可能にする。これは、いくつかの主要なCで構成されていomponents（ 図1）およびアッセイの実現可能性を検証するためにいくつかの予備的な手順が必要です。まず、レポーター構築物は、目的の遺伝子の3 &#39;UTRを含むように設計されている。 3 &#39;UTRは、ホタルルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子（ 図1）の末端に融合される。挿入された3 &#39;UTRを介して発揮される転写後制御機構の変化は、様々なルシフェラーゼのレベルをもたらす、このキメラ転写物の安定性および/または翻訳効率を変える。したがって、ルシフェラーゼ活性の変化は、目的の遺伝子の影響を受けた転写後調節の間接的な尺度として役立つ。システムの第二の成分は、対照レポーター構築、同じレポーター遺伝子を発現するが、任意の3 &#39;UTRを含まない同一の発現プラスミドである。 2つのレポータープラスミドは、従来の分子生物学プロトコールを用いて実験室で設計された、または商業的供給源から購入することができる。適切な細胞株の選択は、アッセイの構築のために重要である。どの細胞株が最適モデルである可用性、トランスフェクション能力、及び成長特性のようなだけで実用的な問題への病理に対する最大の類似性のような臨床要件に至るまで、多くの要因に依存します。重要なことは、前には1つが、レポーター遺伝子の3 &#39;UTRの融合がキメラ転写物のレベルで期待される効果があることを確認する必要が進みます。 3からのルシフェラーゼシグナルの有意差がないこと」UTR-ベアリングとコントロールレポーター一過選択した細胞にトランス構築物3ことを示すことになる」UTRは、代替ものの検索の入力を求める、この細胞モデルにおいて機能していません。ハイスループットフォーマットでは、3 &#39;UTR-軸受および制御ルシフェラーゼレポーター構築物を安定的に選択された細胞株中で統合されるべきである。安定的にトランスフェクト一過上に統合を使用して、細胞株は、いくつかの理由のために好ましい。これは、困難なトランスフェクト細胞株を含む細胞モデルの選択を広げるトランスフェクション効率の変動によるデータのばらつきを減少させ、コストが治まる。また、一過性トランスフェクション細胞に非常に多くの場合、システムの飽和につながるDNAプラスミドで過負荷にされている。これらの設定ではレポーター発現の更なる増加は、潜在的なアップレギュレート化合物に向かって減少した感度で、その結果、困難な場合があります。 すべてのアッセイ成分が設定されている場合、ルシフェラーゼ活性を特異的に挿入3を介して上方及び下方調節することができ、実際に最後に、もし、それは、 すなわち 、アッセイの実行可能性を決定するために、ハイスループットフォーマットに移動する前に、重要であるUTR。最高のコントロールが関心の3 &#39;UTRを通じてmRNAの安定性または翻訳可能を調節することが報告された小分子であろう。これらを有するある場合所望の効果を模倣していない可能性、サロゲートコントロールが受け入れられます。これらのmiRNAまたは対象の3 &#39;UTRへの結合を介してそれらの効果を発揮することが知られているRNA結合タンパク質であり得る。このような制御の評価は次スクリーニングは、開発されたアッセイの機能性を示すだけでなく、ハイスループット形式でのダイナミックレンジ、感度や性能の推定を可能にするだけでなく、前に。 記載されているプロトコルを使用して、我々は、2000-化合物ライブラリ6をスクリーニングした。神経芽細胞腫、幼児期の最も一般的な頭蓋外固形腫瘍は、増幅強く標的遺伝子7として、神経芽細胞腫の有害転帰を予測するMYCN癌遺伝子の生物学的モデルおよび3 &#39;UTRとした。 図2実験的なレイアウトの概要を示します。スクリーニングは、1回の実行でスクリーニング27のプレートのバッチサイズで3回の実行に分けた。 27プレートのバッチはスペクトラムコレクションライブラリが含まれてプレートN.1-N.8 + n.25（ファーストラン）、n.9-n.16 + n.25（セカンドラン）とn.16-n.24 + n.25（第3ラン）、各三重でスクリーニングプレート。このように、1ライブラリプレート（n.25）が可能インターラン比較を行う3つのすべての実行中で分析した。以下のプロトコルを3回試験9ライブラリプレートの回の実行について説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Culture plate 96-well White</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6005688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6008190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">100 ml disposable trough for reagents</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td>10 613 048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">300 ml disposable robotic reservoir</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">PB12001301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 50&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 200&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">3711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">ONE-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">RPMI</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-918F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">PBS-1X, w/o Ca++, Mg++</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">The Spectrum collection (compound library)</td>
			<td style="width:239px;">MicroSource Discovery Systems</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan Freedom EVO200 robot&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan F200 multiplate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for chemical modulators of post-transcriptionally regulated genes

転写および転写後調節の両方が遺伝子発現に大きな影響を持っている。しかし、一般的に採用細胞ベースのスクリーニングアッセイは、本質的に、プロモーター - 標的分子の同定を目的とされて、転写調節に焦点を当てる。その結果、転写後のメカニズムは、主に薬剤開発の標的遺伝子の発現によって明らかにされる。ここでは、それを修正することができる化合物を同定することで、そのmRNAの運命の調節において3 &#39;非翻訳領域（UTR）の役割を調べることを目的とした細胞ベースのアッセイを記載する。アッセイは、安定に疾患関連細胞株に組み込まれた目的の遺伝子の3 &#39;UTRを含むルシフェラーゼレポーター構築物の使用に基づいている。プロトコルは、処理の24時間後にルシフェラーゼ活性に影響する分子の同定を目的とした一次スクリーニングでの最初の焦点を、2つの部分に分割される。プロトコルの第2部分カウンタースクリーニング3 &#39;UTRを通じて、具体的ルシフェラーゼ活性を調節する化合物を区別する必要を説明しています。詳細なプロトコルおよび代表的な結果に加えて、我々はアッセイ開発および内因性標的に対するヒット（複数可）の妥当性についての重要な考慮事項を提供する。記載した細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイは、科学者が3 &#39;UTR依存的転写後機構を介してタンパク質レベルを調節する分子を同定することを可能にする。

説明したアプローチを用いて、我々は、MYCN遺伝子の3 &#39;UTRを介して発揮される転写後制御機構の潜在的調節のための2000-化合物ライブラリーをスクリーニングした。 図3を単一のライブラリープレートによって例示次スクリーニングの結果を示す。ビヒクル処置対照のパーセンテージとして表示されるルシフェラーゼシグナルは、単一のライブラリープレートの化合物で?...

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K ビュー.  University of Trento. Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

生物学

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

ハイスループットのアプリケーションのための大人のゼブラフィッシュハーツの回復

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

自動化されたモジュラーハイスループットエキソポリサッカライドスクリーニングプラットフォームは、高感度炭水化物フィンガープリント分析と相まって

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...