We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.

הערה: התפוקה של מערכות assay זה תלויה בציוד המעבדה HTS זמין. פרוטוקול זה הוא בהנחייתם של טקאן חופש רובוט EVO 200, אשר מבצע טיפול נוזלי בפורמט 96-היטב. מזעור לפורמט 384 גם הוא גם אפשרי. מערכת הטיפול הנוזלי רובוטית ממוקמת מתחת הזרימה למינרית על מנת לשמור על תנאים אספטיים במהלך כל שלבי הניסוי. אם אין אוטומציה של טיפול בנוזלים זמינה, הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות לפורמט נמוכה תפוקה. הקרנה ראשונית 1. יום 1: הכן ותאי זרע הערה: תאי זרע להניב מפגש 80% בעת מנסה לאמוד פעילות לוציפראז, כלומר, 48 שעות לאחר זריעה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend trypsinized תאי נוירובלסטומה CHP134-mycn3UTR לריכוז של 2 × 10 5 תאים / מיליליטר בRPMI המכיל 10% FBS ו -1% L- גלוטמין. במשך 27 צלחות להכין לפחות 250 מיליליטר של<html> השעיה תא לוקחת בחשבון טיפול נוזלי, שקתות כרכים מתים וצעדי pipetting חוזרים ונשנים. יוצקים את ההשעיה התא לתוך מאגר סטרילי ולמקם אותו על שולחן הרובוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 9 צלחות המינימרקטים לבנים שטוחות תחתונה 96-היטב ותיבה של 200 μl טיפים pipet סטרילי על שולחן הרובוט. מערבבים את ההשעיה התא על ידי pipetting לפני כל צעד היתר להימנע מתאי שיקוע תחת כוח הכבידה. לוותר 75 μl של תאים לתוך באר כל 9 צלחות כדי לקבל צפיפות סופית של 1.5 × 10 4 תאים לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצלחות עם העפעפיים ולהשאיר אותם מחוץ לחממה למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים למשקעי תחתית הבאר. זה יהיה למזער את אפקט קצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.2 ו -1.3 פעמיים כדי להכין את המספר כולל של 27 צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו דגירה של 24 שעות. </li></ol> 2. יום 2: פנק את התאים עם תרכובות הספרייה ntent &quot;&gt; הערה: ספריית המולקולה הקטנה ספקטרום האוסף מורכב של 2,000 תרכובות מסודרות בשורות 8 ו -10 עמודים ב- 25 96-גם צלחות בריכוז של 10 מ&quot;מ בDMSO הבארות בעמודים הראשונים ואחרונים נותרו ריקות עבור פקדים. . מבחני מיון מתחם מבוצעים בדרך כלל בריכוז מתחם 1-10 מיקרומטר 8. פרוטוקול ההקרנה המתואר כאן מתקן 2 מיקרומטר כריכוז העבודה ו -24 שעות כנקודת סיום assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר 9 צלחות ספריית מתחם בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתי שקתות עם PBS סטרילי ופתרונות DMSO%-0.5 PBS ומניח אותם על שולחן הרובוט. לכל צלחת ספרייה, להכין ולתייג בהתאם צלחת דילול אחד - פוליפרופילן צלחת 96-היטב U-תחתונה עם נפח עבודה של לפחות 400 μl. מלא היטב בכל עמודות 2-11 לוחות דילול עם 398 μl של PBS סטרילי באמצעות טיפים הקבועים של המטפל הנוזלי. עמודים מלא 1 ו -12 עם 50 μl של PBS סטריליעם DMSO 0.5% על מנת לשחזר את ריכוז הרכב בבארות השליטה (0.02%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שתי צלחות ספרייה, צלחות דילול שכותרתו בהתאמה, שתי קופסות של טיפים pipet סטרילי 50 μl ושש צלחות תאים על שולחן הרובוט. לחשוף לוחות תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 2 μl של פתרון 10 מ&quot;מ מניות מאחת משתי צלחות ספרייה בצלחת הדילול המתאימה ומערבבים היטב. זה יגרום ריכוז תרכובות ביניים של 50 מיקרומטר. באמצעות אותה הקבוצה של טיפים, לוותר 3 μl של דילול 50 מיקרומטר ב 3 96-גם צלחות הלבנות המינימרקטים עם תאים. תוצאות תכנית דילול זה ב 2 מיקרומטר עובד ריכוז של כל נבדקו מתחם. הערה: כדי למנוע מניפולציות מיותרות עם הטיפים, להשתמש סט מלא של 96 טיפים מההתחלה, למרות שצלחות הספרייה מכילות רק 80 תרכובות. זה אפשרי מאז ראשון והטורים האחרונים של צלחות הספרייה ריקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הטיפים pipet וחזור Step 2.4 לצלחת הספרייה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחות תאים ולהחזיר אותם לחממה למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.3-2.6 פעמים נוספות לצלחות ספרייה שנותרו. </li></ol> 3. יום 3: בצע בלוציפראז Assay הערה: לפני ביצוע assay בלוציפראז, ניתן זמנית אותו עם assay כדאיות תא המבוסס על הפחתה של resazurin על מנת לקבל מדד תא-כדאיות מכל הטוב 9. לוציפראז Multiplexing וassay כדאיות תוצאות מבחני בהפחתה של אות בלוציפראז ש, לעומת זאת, אפשר להתעלם ממנו אם התאים לספק מספיק רמה גבוהה של פעילות בלוציפראז. פעילות לוציפראז יכולה להיות מזוהה על ידי מגוון רחב של חומרים כימיים assay 10,11 לוציפראז מסחריים וביתיים עם אות זורח יציבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן מגיב לוציפראז מחדש של בחירה לטמפרטורת חדר. ודא שעוצמת הקול הוא מספיק לכל צלחות assayed. במשך 27 צלחתשל 170 מיליליטר של מגיב לוציפראז יידרש תוך טיפול נוזלי חשבון, שקתות נפח מת וצעדי pipetting חוזרים ונשנים. יוצקים את מגיב לוציפראז לתוך מאגר ולמקם אותו על שולחן הרובוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 9 צלחות עם תאים מן החממה, מניח אותם על שולחן הרובוט, לחשוף ולחכות עד equilibrated לטמפרטורת חדר. הוסף 50 μl של מגיב לוציפראז לכל צלחת היטב על ידי צלחת. בין הלוחות, להציג עיכוב שווה לזמן קריאת הארה של צלחת אחת. זה יבטיח שכל הצלחות נמדדות בתוך פרק זמן שווה מבנוסף מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 30 דקות, מניח את הצלחת הראשונה בluminometer ולמדוד הארה אחרי צעד רועד קצר. חזור על פעולה עבור כל הצלחות. רשום את הברקוד של כל צלחת ולשייך אותו לקובץ נתונים המקביל, כדי למנוע טעויות הנובעות ממספר רב של צלחות בטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.2-3.3 פעמיים במשך 18 הצלחות שנותרו עם תאים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את מגיב לוציפראז שנותר ולאחסן אותו ב -20 ° C. </li></ol> 4. יום 4: ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני ניסוי תהליך באמצעות נורמליזציה של כל הדגימות לממוצע של בקרות רכב שטופל על-צלחת. לכל מתחם ספרייה, לחשב את ממוצע x הערך וSD על triplicates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עד-ויסות ולהיטים ידי קביעת סף של X ± k × SD, שבו x הערך הממוצע וSD מחושבים על כל ערכי assay מעובד, וk ויסות כלפי מטה הוא מוגדר קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סף שרירותי חתוך &lt;20% בקבוצת ביקורת שטופל ברכב כאשר הפחתה של אות בלוציפראז היא ככל הנראה קשורה עם רעילות מתחם. השלכת הלהיטים מתחת לסף זה יהיה להפחית באופן משמעותי מספר הלהיטים חיוביים שגויים בדלפק-ההקרנה. הערה: במקום נורמליזציה מבוססת שליטה, יכולים להיות מעובד נתוני ניסוי החלת ציון Z או B של האנלוגי החזקה שלהליבה 12. בנוסף, גישות סטטיסטיות חלופיות לבחירת להיט זמינות 12. </li></ol> 5. Counter-הקרנה הערה: תרכובות שזוהו במסך הראשי (שכותרתו &#39;להיטים&#39;) הם אישרו והערכה לסגולית על ידי נגדי הקרנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחור לעצמה את הלהיטים שנבחרו מaliquots מאוחסן בצינורות המינימרקטים 2D אחת וליצור חדשים &quot;פגעה צלחות&quot;, להציל את הפריסה המקבילה. אל תשכח להשאיר עמדות חינם לבקרה. הערה: בהעדר מערכת דובדבן-קטיף יעיל, אפשר לבדוק את שניהם שליטה ו -3 תאים &#39;UTR נושאות במקביל בהקרנה הראשונית. במקרה זה, בחירה ספציפית של תרכובות עם אפקטים תלויים רק ב3 &#39;UTR הציג תתאפשר לאחר ההקרנה הראשונית ומבטלת את הצורך של נגד הקרנה. עם זאת, ההקרנה המקבילה בשתי שורות תאים תכפיל את assayעלויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף &quot;יום 1: הכן ותאי זרע&quot;), עבור כל &quot;צלחת פגע&quot; להכין שלוש 96-גם צלחות של כל תאים יציבים CHP134-mycn3UTR וCHP134-CTRL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף &quot;היום 2: פנק את התאים עם ספריית תרכובות&quot;), להשתמש בכל צלחת להיט לטיפול בשלוש CHP134-mycn3UTR ושלוש צלחות CHP134-CTRL בשעה 2 מיקרומטר עובד ריכוז. הערה: בעוד דלפק המסך המתואר כאן מתבצע בtriplicates במנה אחת של 2 מיקרומטר, זה יכול להיות מועיל להחליף משכפל הסטנדרטי ולבדוק את הלהיטים ב 3 ריכוזים כפי 10 דילולים הנעים בין 2 מיקרומטר עד 20 ננומטר. יישום גישה זו לא יאפשר רק כדי לאשר את הנתונים של המסך הראשי, אלא גם לקבל נתונים מנה-תגובה ראשוניות על הלהיטים העיקריים, מזעור שיעורים חיוביים שגויים. במקרה זה, צינור ניתוח שונה צריך להיות applied לעבד את נתוני הניסוי ולאשר את הלהיטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף &quot;יום 3: בצע בלוציפראז Assay&quot;), למדוד את הפעילות בלוציפראז בכל צלחות CHP134-mycn3UTR וCHP134-CTRL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף &quot;יום 4: ניתוח נתונים&quot;), לנרמל את הנתונים ניסיוניים מבארות שטופלו לממוצע של בקרות רכב שטופל על-צלחת ולחשב את הממוצע וSD על משכפל. עבור כל מתחם שנבדק, לחשב את שינוי הקיפול של פעילות לוציפראז בCHP134-mycn3UTR לעומת תאי CHP134-CTRL. בחר שינוי קיפול שרירותי לחתוך מחיקות של&gt; 1.5 ומשמעות p-ערכים של &lt;0.01. שים לב: בהגדרות assay תיארו את הפרמטר הקובע ללהיט סגוליות הוא שינוי משמעותי של פי פעילות לוציפראז בCHP134-mycn3UTR לעומת תאי CHP134-CTRL. אם יש צורך, אפשר גם להעריך רעילות מתחם על ידי ביצוע במקביל assay כדאיות תא על seתרכובות lected. זה עשוי להיות מועיל במיוחד אם הלהיטים הראשוניים-הוקרנו דלפק בניתוח תגובת מינון. למנה אחת, הניסיון שלנו מצביע על מתאם חזק של פעילות לוציפראז המופחתת לירידה בכדאיויות תא 6. לכן, ירידה בפעילות בלוציפראז בתאי מטרה, כמו גם תאי שליטה יכולה להיחשב כמדד לרעילות מתחם בריכוז נבדק. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells.">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).</li><li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs.">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3&#8217;+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3&#8217; untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cell-Based+High-Throughput+Screen+Addressing+3&#8217;+UTR-Dependent+Regulation+of+the+MYCN+Gene.">A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3&#8217; UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene.</a> Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).</li><li>Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+developmental+biology,+cancer+genomics+and+immunotherapy.">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Herbst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexing+a+high-throughput+liability+assay+to+leverage+efficiencies.">Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies.</a> Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).</li><li>van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+luciferase+reporter+assay+for+cell-based+high-throughput+screening.">Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li><li>Hitti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ribosomal+protein+promoter-based+reporter+system+for+selective+assessment+of+RNA+stability+and+post-transcriptional+control.">A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control.</a> RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).</li><li>Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+regulatory+elements+in+conserved+3&#8217;+UTRs+of+human+transcripts.">Systematic identification of regulatory elements in conserved 3&#8217; UTRs of human transcripts.</a> Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J. Vis. Exp. (87), (2014).</li><li>Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3&#8217;+untranslated+region+of+messenger+RNA:+A+molecular+&#8220;hotspot&#8221;+for+pathology.">The 3&#8217; untranslated region of messenger RNA: A molecular &#8220;hotspot&#8221; for pathology.</a> Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).</li><li>Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+methods+to+monitor+the+modulation+of+mRNA+stability:+a+novel+approach+to+drug+discovery+and+therapeutic+intervention.">A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention.</a> J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).</li><li>Pascale, A., Govoni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+world+of+post-transcriptional+mechanisms:+is+their+deregulation+a+common+link+for+diseases?+Focus+on+ELAV-like+RNA-binding+proteins.">The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).</li><li>Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+pre-mRNA+processing+and+altered+architecture+of+3&#8217;+untranslated+regions+contribute+to+the+development+of+human+disorders.">Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3&#8217; untranslated regions contribute to the development of human disorders.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).</li><li>Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+GEMS--a+novel+platform+technology+targeting+post-transcriptional+control+mechanisms.">Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms.</a> Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).</li><li>Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+post-transcriptional+control+for+drug+discovery.">Targeting post-transcriptional control for drug discovery.</a> RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3&#8217; UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based ...

לרגולצית תעתיק תקופה ארוכה של ביטוי גנים שחשבו לשחק עיקרי אם לא בלעדי תפקיד בשליטה על ייצור חלבון. צבירת ראיות, לעומת זאת, מצביע על כך שרגולציה לאחר תעתיק תורמת באותה מידה, אם לא יותר מ, רגולציה תעתיק לקבוע שפע חלבון תאי 1,2. שליטה לאחר תעתיק של ביטוי גנים היא הרבה יותר מורכב ומשוכלל יותר מהייתה במחשבה ראשונה. למעשה, את כל השלבים השונים של בקרה לאחר תעתיק צמחו להיות מוסדרים, כוללים עיבוד mRNA, לוקליזציה, מחזור, תרגום 3, כמו גם מתילציה RNA הפיכה תיארה זה עתה 4. ממספר תהליכי רגולציה לאחר תעתיק מושפע באופן פוטנציאלי, assay מתואר להלן מתמקד באלה הקשורים &#39;האזור מתורגם (3&#39; mRNA 3 UTR). 3 &#39;UTR רחב משפיע גורל mRNA בעיקר באמצעות אינטראקציה ספציפית של יחסי ציבור מחייב RNAoteins וRNAs ללא קידוד רצפיה רגולציה ו / או מבנים משניים 5. לכן, מולקולות קטנות המשנות אינטראקציות אלה או להפריע למסלולי העברת אותות במעלה הזרם תעבור את האיזון שמסדיר שפע חלבון. גישה טיפולית זו היא בעלת חשיבות מיוחדת לפתולוגיות אדם שלראיות מראים כי קיימות גנים של מחלות-רלוונטי נתונות לרגולציה שלאחר תעתיק, אשר מייצגת אפוא יעד פוטנציאלי להתערבות תרופתית. לכן, מערכות המאפשרות להקרנה של מאפננים &#39;רמות ה- mRNA באמצעות התערבות במנגנוני בקרה שלאחר תעתיק בפורמט תפוקה גבוהה יכולות להיות כלי רב ערך בזיהוי של טיפולי רומן פוטנציאליים. Assay גן הכתב מבוסס התאים המתוארים מאפשר לזיהוי תרכובות מסוגלת לווסת את גורל mRNA באמצעות מנגנונים תלויים בה 3 &#39;UTR. הוא מורכב מכמה ג העיקריomponents (איור 1) ודורש כמה צעדים ראשוניים כדי לאמת את הכדאיות של assay. קודם כל, לבנות הכתב נועד כולל UTR &#39;3 מגן של עניין. 3 &#39;UTR הוא התמזגו בסופו של גן כתב כגון לוציפראז גחלילית (איור 1). כל שינוי במנגנוני בקרה שלאחר תעתיק מופעל באמצעות 3 &#39;UTR הוכנס ישנה את היציבות ו / או יעילות תרגום של תמליל chimeric זה, וכתוצאה מכך רמות לוציפראז מגוונות. לכן, שינויים בפעילות לוציפראז לשמש אמצעי עקיף של תקנה לאחר תעתיק המושפע של הגן של עניין. המרכיב השני של המערכת הוא לבנות כתב שליטה, פלסמיד ביטוי זהה המבטא את אותו גן הכתב אך אינו מכיל &#39;UTR 3. יכולים להיות מתוכנן שני פלסמידים הכתב במעבדה תוך שימוש בפרוטוקולי ביולוגיה מולקולרית קונבנציונליים או שנרכשו ממקורות מסחריים. הבחירה של קו תא מתאים היא קריטית לבניית assay. איזה קו התא הוא המודל האופטימלי תלוי בגורמים רבים, החל מדרישות קליניות כמו דמיון מקסימאלי לפתולוגיה לסוגיות מעשיות רק כמו מאפיינים זמינות, transfectability, וצמיחה. חשוב לציין, לפני להמשיך יש לוודא כי שילוב של 3 &#39;UTR לגן הכתב יש השפעה צפויה על הרמה של תמליל chimeric. היעדר ההבדל משמעותי באות בלוציפראז מן 3 &#39;UTR כתב נושאות ושליטה בונת transfected זמני בתאים שנבחרו היה מציין כי 3&#39; UTR הוא לא פונקציונלי במודל סלולארי זה, מה שגרם לחיפוש של חלופה אלה. לפורמט התפוקה הגבוהה, בונה כתב 3 נושאות UTR &#39;ולוציפראז השליטה צריכה להיות משולבת ביציבות בקו התא הנבחר. שימוש משולב על יציבות זמנית transfectedשורת תאים עדיפה מכמה סיבות. זה ירחיב את הבחירה של מודל סלולארי כולל שורות תאים שקשה transfect, להקטין את השונות בנתונים נובעים מתנודות ביעילות transfection, חולף עלויות. יתר על כן, על תאי transfection חולפים הם לעתים קרובות מאוד עמוסים עם פלסמיד דנ&quot;א המוביל לרוויה של המערכת. בהגדרות אלה עלייה נוספת בביטוי העיתונאי עשויה להיות מאתגרת, וכתוצאה מכך ירידה ברגישות כלפי תרכובות upregulating פוטנציאליות. לבסוף, כאשר כל רכיבי assay מוגדרים, זה קריטי, לפני שעבר לפורמט התפוקה הגבוהה כדי לקבוע את הכדאיות של assay, כלומר, אם פעילות לוציפראז יכול להיות אכן למעלה ובמיוחד באמצעות הוכנס 3 &#39;למטה מוסדר UTR. הפקדים הטובים ביותר יהיו מולקולות קטנות דיווחו לווסת את היציבות או translatability של mRNA באמצעות UTR &#39;3 של עניין. אם יש אלה הואלא ניתן, בקרות פונדקאיות מחקה את האפקט הרצוי מתקבלות. אלה יכולים להיות miRNAs או מחייב חלבוני RNA הידועים להפעיל האפקטים שלהם באמצעות קשירה ל&#39;UTR 3 של עניין. הערכת בקרות כגון לפני ההקרנה הראשונית מצביעה לא רק את הפונקציונליות של assay פיתח, אלא גם מאפשרת להערכת הטווח, הרגישות שלה הדינמית וביצועים בפורמט התפוקה גבוהה. באמצעות הפרוטוקול המתואר הוקרן ספריית 2,000 מתחם 6. נוירובלסטומה, הגידולים מוצקים extracranial הנפוצים ביותר של גיל הינקות, שימשה כמודל ביולוגי ו&#39;UTR 3 של אונקוגן MYCN, הגברה שמאוד מנבא תוצאות שליליות של נוירובלסטומה, כגן מטרה 7. איור 2 מתארים את הפריסה הניסיונית. ההקרנה הייתה מחולקת בשלוש ריצות עם גודל אצווה של 27 צלחות הוקרנו בטווח אחד. הקבוצה של 27 צלחות כלולות ספריית ספקטרום אוסףצלחות הערת 1-N.8 + n.25 (הפעלה ראשונה), n.9-n.16 + n.25 (ריצה שנייה) וn.16-n.24 + n.25 (סיבוב שלישי), כל אחד צלחת הוקרנה בשלושה עותקים. כך, צלחת אחת ספרייה (n.25) הייתה assayed בתוך כל שלוש הריצות עושים השוואה בין-טווח אפשרי. הפרוטוקול להלן מתאר ריצה אחת של 9 צלחות ספרייה נבדקו בשלושה עותקים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Culture plate 96-well White</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6005688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6008190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">100 ml disposable trough for reagents</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td>10 613 048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">300 ml disposable robotic reservoir</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">PB12001301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 50&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 200&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">3711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">ONE-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">RPMI</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-918F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">PBS-1X, w/o Ca++, Mg++</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">The Spectrum collection (compound library)</td>
			<td style="width:239px;">MicroSource Discovery Systems</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan Freedom EVO200 robot&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan F200 multiplate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for chemical modulators of post-transcriptionally regulated genes

תעתיק ורגולציה לאחר תעתיק לשניהם יש השפעה עמוקה על ביטוי גנים. עם זאת, מבחני סינון מבוסס תאים נפוצים אימצו להתמקד ברגולצית תעתיק, שנועדו במהותו בזיהוי של מולקולות מיקוד אמרגן. כתוצאה מכך, מנגנונים שלאחר תעתיק נחשפים במידה רבה על ידי פיתוח תרופות ממוקדות ביטוי גנים. כאן אנו מתארים assay מבוסס תאים שנועד לבחון את התפקיד של &#39;האזור מתורגם (3&#39; 3 UTR) באפנון של הגורל של mRNA שלה, ובזיהוי תרכובות יוכלו לשנות אותה. Assay מבוסס על השימוש במבנה כתב בלוציפראז המכיל &#39;UTR 3 של גן של עניין המשולב ביציבות לקו תא מחלה-רלוונטית. הפרוטוקול מחולק לשני חלקים, עם ההתמקדות הראשונית על ההקרנה הראשונית שמטרתו זיהוי של מולקולות המשפיעות על הפעילות בלוציפראז לאחר 24 שעות של טיפול. החלק השני של הפרוטוקולמתאר את הצורך להפלות תרכובות ויסות פעילות לוציפראז במיוחד דרך UTR &#39;3 הקרנה ללא מרשם. בנוסף לפרוטוקול מפורט ותוצאות נציג, אנו מספקים שיקולים חשובים על פיתוח assay והאימות של הלהיט (ים) על יעד אנדוגני. Assay הגן המתואר מבוסס תאי הכתב יאפשר למדענים לזהות מולקולות ויסות רמות חלבון באמצעות מנגנונים שלאחר תעתיק תלויים ב&#39;UTR 3.

שימוש בגישה המתוארת, אנו הוקרנו ספריית 2,000 מתחם למאפנני פוטנציאל של מנגנוני בקרה שלאחר תעתיק מופעלים באמצעות &#39;UTR 3 של גן MYCN. איור 3 מתארים את התוצאות של בדיקות הסקר הראשוניים שהודגמה על ידי צלחת ספרייה אחת. אות בלוציפראז מוצגת כאחוז מפקדי רכב שטופל היית?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes at JoVE.com

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Views.  University of Trento. Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Video: High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.