Nuestro trabajo es apoyado por la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación. Nos gustaría agradecer a Prof Tamotsu Yoshimori para nosotros proporcionar amablemente con el plásmido para la expresión de PPC-LC3.

1. Preparación de células <ol><li> Semilla bajo número de pases de las células HEK-293T que expresan establemente GFP-DFCP1 en cubreobjetos redondos 22 mm; células de cultivos de una noche en medio Dulbecco Modificado de Eagles (DMEM), a una confluencia de 30-40% (objetivo para una confluencia de 80% después de 2 día - día de imágenes de células vivas). </li></ol> 2. Transfección celular <ol><li> Preparar la mezcla de complejo de transfección para cada plato, que contiene 100 l OptiMEM reduje el suero, 3 l X-9 tremeGENE ADN transfección reactivo, y 0,5 g de pECFP-LC3 plásmido ADN. Mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo y se incuba 15 minutos a temperatura ambiente. [Nota: Hemos encontrado repetidamente que otros reactivos de transfección, como Lipofectamine 2000, tienen un montón de toxicidad y, además, producen partículas fluorescentes en sus propios que interfieren con muchas técnicas de microscopía.] </li><li> Aspirar el medio de las placas y añadir DMEM fresco pre-calentado a 37 ° C. </li><li> Agregue la transfection complejo a las células por pipeteo, se incuban las células durante 24 horas. </li></ol> 3. Incubación de las células con el marcador Orgánulos (Opcional) <ol><li> Añadir MitoTracker / LysoTracker a DMEM a una concentración final de 75 nM, y mantener en hielo, en un tubo Falcon cubierto con papel de aluminio, a lo largo de todo el día experimental, para evitar la exposición a la luz y la congelación repetitivo y los ciclos de descongelación. </li><li> Retirar una alícuota de 2 ml del medio que contiene LysoTracker MitoTracker / y calentar a 37 ° C; medio aspirado a partir de células transfectadas y reemplazar con MitoTracker / LysoTracker-que contiene el medio y se incuban las células durante 30 - 60 min. </li></ol> 4. Preparación de la cámara de incubación para imágenes de células vivas (Figura 1) <ol><li> Limpieza de metal y las juntas tóricas de plástico con 75% de etanol y aplicar grasa de silicona en el borde de la junta tórica de metal. </li><li> El uso de pinzas quitar el cubreobjetos de la placa y secar el exceso de medio desde el lado inferior del cubreobjetos,para evitar que se mezclen demasiado medio con la grasa, ya que esto aumentará la probabilidad de fugas. </li><li> Deje el cubreobjetos para descansar en el borde de la junta tórica de plástico y adaptarse a la junta tórica de metal en la parte superior de la junta tórica de plástico, con el cubreobjetos insertado en el medio, con el fin de crear una cámara cerrada. </li><li> Rellenar cámara con el medio de la placa; desde este punto y en, evitar la incubación prolongada de las células en medio DMEM sin ​​un agente tampón, para evitar cambios en el pH que se produzca, como el sistema de tampón de bicarbonato de DMEM requiere concentración artificial de CO 2 de 5-10% y la concentración de CO 2 del aire ambiente es mucho menor. </li></ol> 5. Padecer hambre a las células <ol><li> Coloque la cámara de incubación en la platina del microscopio. </li><li> Aspirar el medio completo y se lava con 2 ml de medio de inanición 3 veces, para asegurarse de que no hay aminoácidos se han mantenido desde el DMEM, que eventualmente inhibir la respuesta autofagia; establecer eltemporizador ON. </li></ol> 6. Microscopía <ol><li> Se requiere un sistema de imagen adecuada configurada para células vivas de gran campo epi-fluorescencia. Este comprenderá típicamente un marco de la investigación de grado microscopio invertido, una intensa de amplio espectro de fuentes de luz, espejos y filtros específicos para la proteína fluorescente (s) / tinte (s) de interés, una lente de objetivo de alta calidad, un CCD / sCMOS sensible cámara y una cámara de incubación. Todos los principales fabricantes de microscopios ofrecen sistemas completos de gran campo apropiado para imágenes de células vivas, pero también es posible en casa a construir un sistema con componentes de una variedad de fabricantes y controlan el uso de software de código abierto como Micro-Manager ( <a href="http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/" target="_blank">http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki /</a> ). El aspecto más importante en nuestra opinión es el uso de un sistema de alta sensibilidad para que los niveles de expresión de los periodistas fluorescentes pueden mantenerse al mínimo. </li><li> Selecting las celdas correspondientes a la imagen. <ol><li> Seleccione las celdas grandes y planas que permiten eventos de formación más autophagosome a ser capturados. Además, optar por las células que ya han comenzado la producción de un mayor número de omegasomes. </li><li> Iniciar la captura de vídeo después de 30 min o bien en respuesta autofagia, con el fin de capturar una proporción más grande de eventos de formación autophagosome por vídeo. </li></ol></li><li> Imaging. <ol><li> Utilice un objetivo gran aumento (100x 1.4 NA). </li><li> Ajuste la intensidad de luz de excitación a un 10-20% del máximo para evitar la foto-blanqueo. </li><li> Ajuste la cámara (Hamamatsu ORCA ER, tamaño de píxel 6.45 m) para la exposición 100-500 ms, binning 2x2 y 100 de ganancia. </li><li> Ajuste la velocidad de adquisición de imágenes de 1 fotograma cada 10 seg. </li></ol></li></ol> 7. La creación de montajes de autophagosome Formación Eventos con ImageJ [Esto se puede hacer de una manera no sistemática por el simple escaneado el vídeo fusionado para el correorespiraderos de interés, pero también puede ser sistematizados como se indica a continuación.] <ol><li> Pilas de imágenes abiertas para el 3 (o 2) capturaron canales en ImageJ / Fiji. </li><li> Aplicar LUT verde, rojo y azul (Tablas de búsqueda) para el canal correspondiente; combinar 3 colores y ahorrar. </li><li> En la ficha Analizar, seleccione Herramientas&gt; ROI gerente ... &gt; Especificar, a continuación, seleccionar un área aleatoria de tamaño definido en la primera imagen de la pila. </li><li> En la ficha Imagen, seleccione duplicado, con el fin de duplicar el área seleccionada de la pila. </li><li> En la ficha Imagen, seleccione Pilas&gt; Hacer montage ... para crear un montaje provisional contiene capturan todos los marcos. Analizar todos los marcos en el montaje de un evento complete la formación autophagosome; tomar notas de la primera y la última imagen del evento. </li><li> En la ficha Analizar, seleccione Herramientas&gt; ROI gerente ... seleccionar la misma zona en la primera imagen de la pila para los otros 2 colores, así como para la imagen resultante de la concentración colores y duplicar pilas. </li><li> De tél pestaña Archivo, seleccione Nuevo&gt; Imagen, y para un ancho de acuerdo al número de píxeles seleccionados inicialmente con el administrador de retorno de la inversión, establecidos para la altura 4 veces la altura establecida en el gestor de ROI más 3 píxeles de espacio entre los 3 y los colores Rebanadas fusionado, y se definen como el número de fotogramas en cada pila. </li><li> En la ficha Imagen, seleccione Pilas&gt; Herramientas&gt; Insertar ... y luego insertar cada sub-pila encima de otra, dejando un espacio de 1 pixel en el medio. </li><li> En la ficha Imagen, seleccione Pilas&gt; Hacer montage ... para crear un montaje de partida y acabado con la primera y última trama de la formación de evento autofagosoma capturado. </li></ol>

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método descrito en este protocolo permite la visualización de la localización de una proteína durante la formación de autofagosoma. Hemos intentado varios métodos de visualización de los eventos descritos como punto confocal de barrido, disco giratorio confocal y de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) microscopía. Hemos encontrado que para los propósitos generales de campo amplio epi-fluorescencia estándar proporciona el mejor compromiso entre la sensibilidad y la resolución. Esto asegura una ...

La autofagia es un proceso muy dinámico, que requiere la coordinación de un gran número de proteínas para el resultado final de la formación autophagosome 1-3. Microscopía es probablemente la técnica más comúnmente aplicada para el estudio de la autofagia 4. La localización de la mayoría de las proteínas de la autofagia ha sido ampliamente estudiado en células fijadas, tanto por inmuno-tinción de las proteínas endógenas y por la expresión de la proteína exógena marcado con fluorescencia. Además, la microscopía electrónica (EM), solo y en combinación con el etiquetado inmuno-oro, ha descrito los detalles finos de estas estructuras 5,6. A pesar del hecho de que estas técnicas han establecido nuestra comprensión de la formación autofagosoma en las 3 dimensiones del espacio, que no han logrado proporcionar suficiente cantidad de información acerca de la 4 ª dimensión - tiempo. Imágenes de células en vivo supera esta barrera ya que permite después de la formación de un autofagosoma tan cerca como seable a tiempo real 7. Esta técnica se utilizó primero para estudiar la autofagia por Yoshimori y colegas 8, y se ha utilizado cada vez más en adelante. Microscopía de lapso de tiempo captura la localización del punto de interés en células vivas y durante un período de tiempo. Al comparar esta información con la autofagia bien caracterizado y / u orgánulo marcador, el análisis de imágenes de células vivas puede poner el punto de interés en el mayor contexto espacial y temporal de la formación autophagosome. Análisis de imágenes de células vivas se basa en la captura repetitiva de la localización a lo largo de PDI todos los pasos de la formación de autofagosoma, mientras que las imágenes de células fijadas se basa en una sola captura. Por lo tanto, imágenes de células vivas puede demostrar la contribución de los POI a los pasos específicos de formación autophagosome, mientras que las imágenes de las células fijas sólo puede asumir la función de punto de interés, en base a su localización media en muchos autofagosomas capturados simultáneamente en diferentes etapas de su lifecycle. A pesar de imágenes de células vivas es un método de alta capacidad analítica, tiene algunas limitaciones inherentes que deben ser tomados en consideración. En primer lugar, imágenes de células vivas requiere la expresión de una o más proteínas exógenos marcados con fluorescencia. Etiquetas fluorescentes tienden a ser grandes en tamaño y que a veces puede alterar el comportamiento de una proteína debido a razones estéricas. Esta situación se ve acentuada por las proteínas de membrana, ya que necesitan para funcionar en el espacio limitado de las 2 dimensiones de las membranas. De nota, autofagosomas son estructuras membranosas, y en consecuencia su formación requiere un gran número de proteínas asociadas a la membrana. Otro conjunto de problemas está conectado a los niveles de expresión de la PDI. En principio, una proteína exógena debe ser expresada a niveles comparables a la proteína endógena. Esto asegura que los reguladores importantes de su localización sub-celular no estarán saturados, y thanálisis e será biológicamente relevante. Por otra parte, la sobreexpresión de proteínas de la autofagia se debe evitar, como cuando se expresan por encima de los niveles endógenos, que tienden a inhibir la respuesta autofagia 9. A la inversa, ya que los niveles de expresión del POI debe ser lo suficientemente alta como para permitir seguir su localización por un buen período de tiempo sin foto-blanqueo, un compromiso se ha alcanzado. El logro de los niveles de expresión óptimos de una proteína exógena en células mamíferos requiere mucha sintonía fina, pero es factible mediante el establecimiento y la detección de líneas celulares que expresan de forma estable los diferentes niveles de la PDI. La resolución espacial que se puede lograr con microscopía de fluorescencia estándar es otro factor limitante. La resolución puede ser limitado por una serie de razones, pero en el mejor, resolución lateral será de alrededor de 250 nm. Esto significa que los objetos separados por una distancia menor que esta aparecerán conectado (o como una solaobjeto) y objetos de menos de 250 nm estarán representados en la imagen más grande de lo que realmente son. Por lo tanto, las imágenes siempre deben interpretarse teniendo esto en cuenta y las técnicas complementarias como la EM tendrán que resolver detalles finos ultra-estructural. Por último, imágenes de células vivas requiere inherentemente exposición de una célula a la luz, potencialmente, para un período de tiempo prolongado. Esto puede alterar las respuestas fisiológicas de una célula, un fenómeno conocido como foto-toxicidad. Hemos utilizado con éxito imágenes de células vivas de la proteína de unión a PI3P DFCP1 para describir por primera vez que se originan a partir de autofagosomas PI3P ricas en estructuras en forma de anillo omegasomes denominados, que están en estrecha asociación con ER hebras 10,11. Hemos demostrado claramente que las estructuras de LC3-positivos se empiezan a formar en estrecha asociación con omegasomes. Estamos aquí, sugerimos que el empleo de una línea celular estable expresando GFP-DFCP1 para la célula vivaimagen de la proteína de interés, establece un marco espacial y temporal robusto para la caracterización de su papel en la formación autophagosome.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

La autofagia es una respuesta celular provocada por la falta de nutrientes, especialmente la ausencia de aminoácidos. La autofagia se define por la formación de estructuras de doble membrana, llamada autofagosomas, que secuestran citoplasma, proteínas de larga duración y los agregados de proteínas, orgánulos defectuosos, e incluso virus o bacterias. Autofagosomas finalmente se fusionan con los lisosomas que conducen a la degradación mayor parte de su contenido, con los nutrientes producidos se reciclan de nuevo al citoplasma. Por lo tanto, la autofagia es fundamental para la homeostasis celular y la desregulación de la autofagia puede conducir a la enfermedad, sobre todo la neurodegeneración, el envejecimiento y el cáncer. Formación autophagosome es un proceso muy elaborado, para el cual las células han asignado un grupo específico de proteínas, llamada la maquinaria autofagia núcleo. La maquinaria de la autofagia núcleo está funcionalmente complementa con proteínas adicionales que intervienen en diversos procesos celulares, por ejemplo, en membranel tráfico de correo, en la biología mitocondrial y lisosomal. La coordinación de estas proteínas para la formación y la degradación de autofagosomas constituye la respuesta altamente dinámica y sofisticada de la autofagia. Imágenes de células vivas permite seguir la contribución molecular de cada proteína relacionada con la autofagia hasta el nivel de un solo evento de formación autofagosoma y en tiempo real, por lo tanto, esta técnica ofrece una alta resolución temporal y espacial. Aquí se utiliza una línea celular estable expresando GFP-DFCP1, para establecer un contexto espacial y temporal para nuestro análisis. DFCP1 marcas omegasomes, que son estructuras precursoras conducen a la formación autofagosomas. Una proteína de interés (POI) puede ser marcado con una etiqueta de color rojo o cian fluorescente. Los diferentes orgánulos, como el ER, las mitocondrias y los lisosomas, están todos involucrados en diferentes etapas de formación de autofagosoma, y ​​pueden ser marcados utilizando un rastreador tinte específico. Time-lapse microscopía de autophagy en este montaje experimental, permite que la información se extrae de la cuarta dimensión, es decir, tiempo. Por lo tanto podemos seguir la contribución del POI de la autofagia en el espacio y el tiempo.

En el protocolo descrito, hemos utilizado la microscopía de lapso de tiempo para seguir la localización de la PPC de etiquetado LC3 en una línea celular estable expresando GFP-etiquetados DFCP1, en condiciones que inducen la autofagia. El resultado de este experimento es la captura de 2 series o pilas de imágenes, uno de la verde y uno desde el canal azul, correspondientes a GFP-DFCP1 y CFP-LC3. Hemos analizado más estos videos usando ImageJ, con el fin de crear montajes correspondientes a eventos de formación aut...

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Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.4K vistas.  The Babraham Institute. Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

Video: Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Investigación

Biología

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

La activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caracterización de la calcificación Eventos en vivo mediante técnicas ópticas y microscopía electrónica en un Gusano Tubícola Marina

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

Imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma que invaden el cerebro del pez cebra

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...