Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los telómeros, como la localización de ARN TERRA telomérica de levadura, y puedo insistir en que es telómero de origen o en trans, un cromes-mants diferente La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores visualizar moléculas TERRA expresas desde un solo telómero en células vivas. Demostrando el procedimiento serán Claudio Oss Pegorar y Nicole Bettin, dos estudiantes graduados de mi laboratorio. Para comenzar a crecer celdas AGS de acuerdo con el protocolo de texto.
Luego, cuando las células alcanzan 50 a 60%confluencia transpect ellos con sgRNA Cas9 expresando vector y el casete MS2. Al día siguiente reemplace el medio de cultivo por un medio que contenga Neomicina. Después de esto añadir 10 microlitros de 0.25%Tripsyn a cada pozo de una placa de 96 pozos.
Usando un microscopio y un marcador, marque la posición de cada clon visible en el plato. Sustituya el medio de cultivo de Neomycin por suficiente PBS para formar una película delgada de líquido en los clones. Usando una pipeta de 10 microlitros que contenga cinco microlitros de Tripppsin, libere lentamente el púpsido en la colonia.
Permita que el Trypsin desenganche las células durante un minuto. Raspa la colonia con la punta, y succiona la punta. Después de esto, transfiera las células de la colonia a un pozo de la placa de 96 pozos.
Incubar el plato durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, llene el pozo con 150 microlitros de medio selectivo. A continuación, añadir 100 microlitros de gelatina a cada pozo de tres placas de 96 pozos.
Incubar las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos y lavar las placas con PBS dos veces. Después de que los clones alcancen el 90% de confluencia, aspirar el medio de cada pozo de la placa, y lavar la placa con PBS. Luego agregue 30 microlitros de Trypsin a cada pozo, e incubar la placa a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
A continuación, añadir 70 microlitros de medio selectivo a cada uno de los pozos. Interrumpir las células pipeteando arriba y abajo. Transfiera 30 microlitros de la mezcla al pozo de la placa de ADN gelatinizada que contiene 120 microlitros de medio selectivo.
A continuación, transfiera 30 microlitros de la mezcla a la placa de congelación gelatinizada que contiene 50 microlitros de medio. Coloque el ADN en la incubadora y permita que las células crezcan a 37 grados centígrados hasta que alcancen el 90% de confluencia. Después de esto, agregue 80 microlitros de medio de congelación de hielo a cada pozo de la placa de congelación.
Selle la placa con parafilm, reemplace la tapa y envuelva la placa en papel de aluminio. A continuación, mantenga las placas de congelación a 80 grados centígrados. Después de que los clones en la placa de ADN alcancen el 90% de confluencia, lave la placa con PBS dos veces.
Luego lice las células con 50 microlitros de tampón de lysis. Cubra la placa con parafilm, reemplace la tapa y envuelva la placa en una envoltura de saran. Después de esto, incubar la placa a 37 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente añadir 100 microlitros de solución de cloruro de sodio de etanol a cada pozo, y permitir la precipitación de ADN durante seis horas o durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, invierta la placa y lávela tres veces con 200 microlitros de etanol 70% por pozo. Añadir 20 microlitros de RNase Una solución a cada pozo de la placa, e incubar la placa a 37 grados centígrados durante una hora.
Después de esto, utilice tres microlitros de ADN genómico para amplificación de PCR, y configure la máquina PCR. Haga crecer los clones positivos de PCR en seis placas de pozos de acuerdo con el protocolo de texto. Una vez que los clones alcanzan el 90%confluencia, lavar las células con PBS, y añadir 250 microlitros de tampón de lysis con Proteinase K a cada pozo.
Utilice un rascador de células para raspar las células y transfiera el lysate a un tubo de 1,5 mililitros. Incubar el lysate a 37 grados centígrados durante 16 horas. Añadir un mililitro de etanol al lysate, y agitar vigorosamente.
Permita que los clones crezcan en medio F-12K de acuerdo con el protocolo de texto. Luego agregue el adenovirus que expresa Cre a las células una vez que alcancen el 70% de confluencia. 48 horas después de la infección, dividir las células en tres platos de 10 centímetros.
A continuación, cultivo de los terceros platos para la congelación celular, y la extracción de ARN. En primer lugar, plato los clones TERRA-MS2 y las células de tipo salvaje AGS en platos de fondo de vidrio. A continuación, añada Polybrene y el MS2-GFP expresando retrovirus al medio.
Después de 24 horas desechar el medio que contiene el retrovirus, y añadir medio fresco sin rojo fenol a las células. Por último, utilizando un microscopio invertido y una cámara sensible imagen de las células con el objetivo y la apertura adecuados. En este protocolo se crearon y crearon imágenes clones de células cancerosas que contenían una etiqueta de secuencia MS2 en un solo sublomere.
Los clones resistentes a la neomicina fueron examinados con PCR. Los clones positivos fueron cultivados en lysed para la extracción de ADN genómico y el análisis de manchas del sur. Los clones positivos para pcR y análisis de manchas meridionales se infectaron con el CRE-GFP que expresa adenovirus con el fin de eliminar el gen de neomicina presente en el casete MS2.
Una vez confirmada la eliminación del gen de resistencia a la neomicina, se hizo pruebas de ARN extraídos de los clones para la expresión de transcripciones TERRA-MS2. Con el fin de visualizar las transcripciones TERRA-MS2 en células vivas mediante microscopía confocal, los clones seleccionados se infectaron con un retrovirus que expresaba una proteína de fusión MS2-GFP. Las transcripciones y telómeros TERRA-MS2 se visualizaron simultáneamente en células vivas mediante microscopía confocal mediante la co-expresión de la proteína de fusión MS2-GFP y una proteína de unión a telómeros fusionada con mCherry, TRF2, en los clones seleccionados.
Al intentar este procedimiento es importante hacer todo lo posible para seleccionar un solo clon en lugar de una población mixta de clones. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como un FISH de ADN en los spreads cromosómicas, para visualizar la integración del casete MS2 en células fijas. Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de los telómeros exploren la localización celular de moléculas de TERRA de telómeros individuales en células humanas vivas.
No olvide que trabajar con vectores virales y materiales radiactivos puede ser extremadamente incierto. Y siempre se deben tomar precauciones, como usar abrigos de laboratorio, guantes y el uso de escudos de plexiglás para minimizar la radiación al realizar este procedimiento.
