Name: dyeing insects for behavioral assays: the mating behavior of anesthetized drosophila
Uploaded: 2015-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
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Nos gustaría dar las gracias a Alex Hitchen y Meg stand por su ayuda con los ensayos de apareamiento. Este trabajo fue apoyado por NERC subvención NE / H015604 / 1 al TP.

1. Preparación de Alimentos Fly con colorante de alimentos <ol><li> Tomar un vial estándar Drosophila con aproximadamente 20 ml de la comida en la parte inferior (Figura 1). Utilice la siguiente receta para la mezcla de alimentos utilizando 1 L de agua hirviendo: 10 g de agar, 85 g de dextrosa, 60 g de harina de maíz, 40 g de levadura, y se agita durante 5 min de cocer a fuego lento. Añadir 25 ml de 10% nipagen una vez que la mezcla se ha enfriado a 75 ° C. </li><li> Después de la comida se ha enfriado y solidificado añadir dos gotas (aproximadamente 0,5 a 1 ml) de colorante azul de la parte superior de la comida y se extienden por toda la superficie del vial (Figura 1). Utilice un tinte de color diferente, si se prefiere. </li><li> Deje la comida durante dos días en la nevera para que el colorante es absorbido por la capa superior de los alimentos; esto evita el exceso de humedad dañar las moscas durante el período de maduración. Añadir un pequeño trozo de papel de seda, si la humedad excesiva sigue siendo un problema para secar la humedad extra y, posteriormente,removerlo. </li><li> Transferencia vuela sobre el alimento, ya sea de forma individual o en grupos. Nota: Las moscas ganarán tinción intestinal dentro de 1 día de ser colocado en la comida. Alternativamente, madurar plenamente las moscas en la comida teñido antes del experimento (aumento de la mortalidad durante el período de maduración no se observó a partir de la exposición al colorante alimenticio). </li><li> Compruebe que las moscas teñidos pueden distinguirse fácilmente de las moscas no teñidos. Si no pueden distinguirse, repita los pasos 1.1 a 1.4 utilizando una mayor concentración de colorante, o un colorante diferente. </li></ol> 2. Dos ensayos de apareamiento masculino el uso de alimentos para colorear <ol><li> Para la producción de progenie, configurar varios viales que contienen pares de moscas hembras y machos (pequeños grupos de hombres y mujeres también son adecuadas, aunque tenga cuidado para evitar el hacinamiento de las larvas). Permita que las hembras pongan huevos y se mueven las moscas a los nuevos viales cada 5-7 días. Guarde los viales a una temperatura adecuada para la especie de interés (22 ° C fo D. pseudoobscura y D. subobscura y 25 ° C para D. melanogaster). </li><li> Antes de recoger las moscas experimentales eliminan todas las moscas de los viales de concentración en un tiempo determinado antes de recoger los machos y hembras para asegurar que serán vírgenes (D. melanogaster - 6 horas a 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 horas a 22 ° C, y D. subobscura - 24 horas a 22 ° C). Nota: si las moscas no son virgen este sesgo voluntad de su comportamiento en los ensayos de apareamiento 15. <ol><li> Tienda y macho maduro individualmente en 75 x 20 mm viales de plástico estándar (que contiene ~ 20 ml de alimento). Esto evita los impactos negativos en el comportamiento de apareamiento masculino y fitness visto en algunas especies cuando los machos se mantienen en grupos de 16. </li><li> Exponga la mitad de los varones para el tratamiento deseado (CO 2 anestesia en este caso). Use un tapete CO 2 o toque para exponer las moscas durante el tiempo requerido. Media tienda del males en cada tratamiento en los alimentos de color hasta que el apareamiento tiene lugar. Esto hará que sean visualmente distinguibles durante los ensayos de apareamiento. </li><li> Para la transferencia de moscas utilizan un aspirador 17. Etiqueta de cada vial para identificar tanto el tratamiento y el estado de color de la masculina. Aquí, utilizar cuatro tratamientos (anestesia, no coloreado = G-NC, anestesia, color = GC, sin anestesia, no coloreado, NG-NC, y sin anestesia, coloreado, NG-C). </li></ol></li><li> Traslado hembras recién emergidas en viales de alimentos frescos a madurar como grupos de 10. </li><li> Permitir moscas maduren a la edad de apareamiento (D. melanogaster - 3 días, D. pseudoobscura - 5 días, D. subobscura - 7 días 18 tienda moscas a una temperatura adecuada para la especie en estudio (por ejemplo, 22 ° C para D. . pseudoobscura y D. subobscura y 25 ° C para D. melanogaster). </li><li> Mueva las hembras a viales individuales (containing ~ 20 ml de alimento) 1 día antes de la prueba de apareamiento para la aclimatación al vial de apareamiento. Marque estos viales a fin de que los viales se pueden diferenciar. Tenga cuidado para cegar el experimento mediante el uso de etiquetado neutro (es decir, de 1 - 150) por lo que no es posible adivinar la identidad de las moscas en cualquier vial. Nota: La persona que ponga las moscas en cada vial tendrá que conocer la identidad de las moscas colocados en cada vial, ya que se tenga en cuenta que el tratamiento estaba manchada. Sin embargo, el observador que mira el apareamiento no debe conocer su identidad. Para ello se necesitarán esto por lo menos dos experimentadores, uno de configurar y uno de observar. </li><li> Comience los ensayos de apareamiento entre 10-12 am, o en un momento que coincide con la luz que entra en el ciclo luz / oscuridad de las moscas están expuestos a (&quot;amanecer&quot; para las moscas). Añadir dos moscas macho a cada tubo de acoplamiento (que contiene una sola mosca femenino) utilizando un aspirador. Asegúrese de que los dos hombres son de diferentes tratamientos (anestesia ocontrol) y que uno tiene tinción intestinal para que sea posible diferenciarlos unos de otros, y tenga en cuenta que masculina está manchado. </li><li> Si se produce la cópula, registrar el estado del macho que se acopla (ya sea de color o no - de color). Si los ensayos tienen una duración de 2 horas, asumen la hembra no se acoplará. Nota: 2 horas es adecuado para estas especies, pero aparte de Drosophila puede necesitar más o menos tiempo. </li></ol> 3. Individual Masculino ensayos de apareamiento <ol><li> Para los ensayos individuales masculinos, repita Protocolo 2 con dos cambios: <ol><li> En el paso 2.3 no guarde los hombres en los alimentos de color. </li><li> En el paso 2.7, añadir un solo macho a cada vial. </li></ol></li><li> En el paso 2.8, registrar el tiempo se añade la marcha para el vial, el tiempo de los apareamiento comienza y la hora del apareamiento terminado deben ser registrados. A partir de estos valores, calcular el éxito de apareamiento, la latencia y duración. </li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Utilice paquete estadístico adecuado para analisis. Si los datos son normales y sólo tienen dos tratamientos, utilizar pruebas t o equivalente Modelo Lineal Generalizado (GLM). Durante dos experimentos masculinos, utilizar pruebas binomiales o un GLM binomio que están disponibles en cualquier paquete básico de estadísticas. Nota: Para obtener los datos de ejemplo, todos los análisis se llevaron a cabo en R versión 3.0.3 19. </li><li> Compruebe los datos de latencia de apareamiento y duración de apareamiento de normalidad, por el trazado de histogramas de frecuencia de latencia y duración para cada tratamiento 20, y el uso de una prueba de normalidad como de Shapiro-Wilk. Si no es normal, transformarlo, o utilizar las estadísticas equivalentes no paramétricas 20. Nota: Para los datos del ejemplo de los experimentos individuales masculinos registran transformación cumplía con los requisitos de la normalidad y la igualdad de las diferencias. </li><li> Si los datos pueden ser normalizada, utilice pruebas t para examinar las diferencias entre la latencia de apareamiento y la duración de los ensayos individuales de apareamiento masculino cuando se utilizan dos tratamientos 21. Si se utilizan varios tratamientos,intentar un análisis de varianza (ANOVA) 20. Si los datos no se pueden normalizar, trate de pruebas no paramétricas equivalentes 21. </li><li> Utilice pruebas binomiales para la prueba de un efecto de cualquiera de colorante de alimentos o de CO 2 anestesia en el éxito de apareamiento de los machos que compiten 20. Si se utilizan varios tratamientos, como es el caso con los datos de ejemplo, utilizar un GLM con estructura de error binomial 21. </li><li> Para los dos ensayos masculinos en los datos de ejemplo, utilice GLM con estructuras de error binomial. Uno GLM examinó color como variable de respuesta (a color = 0 e incoloros = 1) con las especies, estado de gas, y el tratamiento de gas equipada como explicativas variables.One GLM examinado CO 2 como variable de respuesta (gaseados = 0 y no gaseados- = 1) con las especies, estado de color, y el tratamiento de gases instaladas. En cada caso, producir el modelo de máxima, y llevar a cabo la simplificación modelo basado en AIC 20. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Estos datos muestran que el impacto de la anestesia CO 2 es inconsistente entre especies, con dos de las tres especies que muestran poco impacto. Nuestros resultados sugieren etiquetado con colorante de alimentos tuvo un menor impacto en el éxito de apareamiento masculino de CO 2 anestesia para D. melanogaster. Estos experimentos demuestran que los colorantes de alimentos se pueden utilizar fácilmente y barato para las moscas de la etiqueta para ensayos de apareamiento que involucran múltiples machos. De las especies de Drosophila tres modelos examinados, solamente D. melanogaster mostró un efecto del CO 2 anestesia en el rendimiento de apareamiento en una situación de competencia. En contraste, ninguna de las especies mostró un efecto de la colección en el gas en los ensayos de apareamiento individuales en términos de latencia de apareamiento, contrariamente a los resultados previos para D. melanogaster 5. Por tanto, el efecto de la competencia podría destacar aptitud efectos más sutiles de la anestesia de CO 2, que sólo son detectablesen situaciones donde hay competencia entre machos. La exposición a la recolección temprana y un día antes del juicio, tienen un efecto negativo en la capacidad de los machos de D. melanogaster para obtener un apareamiento. Exposición dos días antes del juicio, sin embargo, no mostró ningún efecto. Tanto D. pseudoobscura y D. subobscura no mostró ningún efecto de la exposición al gas en ninguno de los ensayos. Una explicación es que D. melanogaster era vulnerable a la exposición temprana a CO 2, ya que debe ser recogido antes en la vida (0-6 horas de edad) que las otras especies para asegurar los machos son vírgenes. Por lo tanto masculina D. melanogaster de esta edad puede ser más sensible como la cutícula de la mosca todavía se está endureciendo, en comparación con las otras especies que han tenido más tiempo para su cutícula a endurecerse. En general, esto apoya la idea de que los efectos del CO 2 anestesia son especies específicas y los investigadores deben probar adecuadamente el efecto en sus especies objetivo. Currently, la mayoría de los trabajos sobre el efecto del CO 2 anestesia se ha realizado en Drosophila melanogaster 5,11,22 y por lo tanto pueden no ser apropiados para aplicar a otras especies relacionadas. El método no invasivo alternativa presentada para diferenciar las moscas es colorante alimenticio. Los resultados sugieren que este tratamiento no tuvo efecto en el otro lado de todas las especies examinadas. Sin embargo, aunque su uso ha sido satisfactoria en el suministro de un marcador barato y fácilmente visible para distinguir entre los individuos debe tenerse en cuenta que el colorante era más fácil de distinguir en D. pseudoobscura y D. subobscura que en D. melanogaster. Anterior autores han utilizado varios colores (rojo, verde y azul) 4,6. Encontramos coloración azul que es el más fácil de distinguir en todas las especies, en particular D. pseudoobscura y D. subobscura. El uso de varios colores que potencialmente permitir experimentos más complejos con muchos flie marcados individualmentes. Sin embargo, las pruebas preliminares de diferentes tintes son esenciales, ya que algunos colorantes alimentarios no pueden colorear las moscas, posiblemente, ser digerido cuando se consume. Otros colorantes pueden tener efectos tóxicos y reducir la supervivencia de las moscas, y deben evitarse 14). Métodos de coloración de alimentos alternativos que utilizan las manchas más caras también se han utilizado para examinar la integridad intestinal para D. melanogaster 23. Estos pueden ser una alternativa, aunque más caro, método de teñido 23. El método de tintura es tan rápido como el CO 2 recorte de alas como las moscas se pueden almacenar en la comida teñido de la colección. La absorción de la comida fue rápida (~ 3 h), de modo de almacenamiento de O / N en la comida de color también sería suficiente para marcar moscas, tal como se utiliza en otros estudios 6. Sin embargo, la duración de la coloración es relativamente corto (~ 4 - 5 horas) en comparación con el recorte ala (permanente) o polvo fluorescente marcado (10 - 12 días), 24. Como especie Drosophilavarían en apariencia, diferentes tintes serán más o menos eficaces para las diferentes especies, y como algunas cepas (por ejemplo, los mutantes knock-out) pueden ser vulnerables a los cambios en la dieta, cualquier uso de tinte requiere una prueba preliminar de su eficacia sobre todo si ya La exposición prolongada a los tintes pueden ser tóxicos 14. En contraste con el estudio de Kalaw et al. 14, no encontramos una mortalidad significativa después del almacenamiento durante varios días en los alimentos de colores para D. melanogaster (3 días), D. pseudoobscura (5 días), o D. subobscura (7 días), probablemente debido a la diferencia de colorante utilizado. El paso crítico para el uso con éxito de la técnica de tinte es el paso 1.5, la validación de que el colorante elegido funciona bien con la especie y la cepa que se utiliza. Una técnica alternativa implica la aplicación de polvo de color hacia el exterior de la mosca antes de su uso en experimentos de campo 24. Este método ha sido utilizado para el seguimiento de individuos en el campo debido to la duración de marcado y la facilidad de los medios de marcado moscas 24. Aunque no hemos probado explícitamente este método en los ensayos de apareamiento, sería importante examinar los efectos que el polvo podría tener sobre los sentidos importantes en el apareamiento, particularmente en Drosophila 25, 26. En las especies, sin embargo, donde el teñido intestinal no es posible, estos métodos podrían ser adecuados. En conclusión, se encontró que en dos de las tres especies estudiadas (D. pseudoobscura y D. subobscura) no hubo ningún efecto encontrado de cualquiera de CO 2 anestesia o colorante de alimentos en la capacidad de apareamiento de los machos. Para D. melanogaster un efecto negativo de CO 2 anestesia fue detectado, pero colorante de alimentos no afectó el éxito de apareamiento de esta especie. En general, el método del colorante proporciona un método no invasivo sencillo y barato para la identificación de individuo Drosophila que es equivalente o mejor que los métodos que requieren CO 2 anestesia. Ellaes probable que este método funciona a través de una variedad de especies.

Durante las últimas décadas se ha producido un creciente interés en la forma en la selección sexual y la competencia entre los machos impacto en la evolución 1,2. Los experimentos sobre el comportamiento de apareamiento han jugado un papel importante en el desarrollo y prueba las teorías de la selección sexual 3,4. En particular las especies, investigación usando del género Drosophila, ha contribuido en gran medida a la comprensión de la selección y el comportamiento sexual. Sin embargo, es importante investigar si las técnicas comúnmente utilizadas pueden sesgar artificialmente los resultados de experimentos de apareamiento estándar 5,6. Anestesia se usa a menudo para la manipulación y la identificación en los experimentos 7. Por ejemplo, las moscas se recogen comúnmente antes del apareamiento, o clasifican en genotipos o tratamientos experimentales utilizando dióxido de carbono (CO 2) anestésico. En experimentos en los que hay que distinguir dos o más personas, es una práctica común para anestesiar la flies y clip de parte del ala de identificar cada grupo individual o tratamiento 5,8. Es vital, sin embargo, para entender cómo CO 2 tratamiento afectará el comportamiento. El efecto del CO 2 anestesia ha sido examinado en Drosophila melanogaster en la que machos expuestos a CO 2 tomó mucho más tiempo para aparearse y en general tuvimos éxito de apareamiento más bajo que los hombres o los hombres no anestesiado anestesiado mediante la exposición al frío 5. Este efecto se observó tanto cuando se aplicó anestesia en el día del experimento y cuando las moscas se les dio un día para recuperarse. Sin embargo, este estudio fue limitado en los ensayos que examinaban donde un solo macho se presentó a cada mujer 5. Un escenario más realista es para una mujer encontrar varios machos 9,10, lo que permite la competencia entre los machos, que podrían permitir la detección de pérdidas más sutiles de la aptitud masculina debido a la anestesia. El uso de anestesia CO 2 también ha seres encontrado para reducir la fecundidad y la longevidad de los adultos de D. melanogaster cuando se exponen poco después de la eclosión, como es común en la recogida de virgen vuela 11. Una alternativa a CO 2 anestesia es marcar moscas alimentándolos coloreado con colorante 4,6,10,12,13 alimentos. Este colorante entra en los intestinos de la marcha y es visible a través del abdomen, lo que permite moscas de colores para distinguir de moscas incoloro, o de las moscas marcados con un color diferente. Los métodos difieren en la forma en que esto puede ser aplicado: se añade directamente a la comida 12, a través de teñido de pasta de levadura suplementaria 6, o mediante la exposición a una novela teñido sustrato alimenticio 13. Estas técnicas de marcado parecen mostrar ningún efecto sobre 4,6 capacidad de apareamiento. Sin embargo, un documento de examinar directamente los efectos de la misma colorante de alimentos en adultos de D. melanogaster encontró una fuerte reducción de la vida útil 14. El trabajo previo se ha centrado también almost enteramente en D. melanogaster, tanto con respecto a los efectos de la anestesia de CO 2 5,11 y alimentos para colorear 14 métodos. Actualmente, hay poca información sobre cómo CO 2 anestesia o el uso de coloración intestinal afecta al comportamiento de apareamiento de otra Drosophila. El siguiente estudio evalúa el efecto del CO 2 anestesia en el comportamiento de apareamiento de tres especies de Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura y D. subobscura). El efecto de la recolección de moscas en CO 2 fue examinado tanto en dos ensayos de apareamiento masculino individual y. El efecto de CO 2 también se ha encontrado a variar en D. melanogaster 5 y así diferentes períodos de latencia entre la exposición a CO 2 y el apareamiento se pusieron a prueba. Un método para recorte de la anestesia y el ala marcado alternativa: Se evaluó también el uso de los colorantes de alimentos para teñir las moscas.

<table><tbody><tr><td>Plastic tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>TWT-200-061G</td><td>Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip.</td></tr><tr><td>Fine mesh</td><td>Any haberdashery</td><td>-</td><td>Fine curtain mesh is suitable</td></tr><tr><td>1 ml pipette tips</td><td>VWR</td><td>83007-376</td><td>Various brands of pipette tips would be suitable</td></tr><tr><td>Plastic Vials</td><td>Sarstedt</td><td>58.49</td><td>Larger vials or bottles could also be used.</td></tr><tr><td>Cotton Balls</td><td>Lewis Medical Solutions</td><td>28170</td><td>The size of cotton will vary depending on the size of vials used</td></tr><tr><td>Blue Food colouring</td><td>Thesugarcraftcompany</td><td>-</td><td>Other dye colours and brands can have variable results.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Tank</td><td>BOC</td><td>BOC 40VK</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie Markers</td><td>Steadtler</td><td>Lumocolor 313 S</td><td>Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness</td></tr><tr><td>Stopwatch</td><td>Salter</td><td>SL3920</td><td>Any stopwatch with a good digital display would be fine</td></tr></tbody></table>

dyeing insects for behavioral assays: the mating behavior of anesthetized drosophila

Experimentos de apareamiento utilizando Drosophila han contribuido en gran medida a la comprensión de la selección y el comportamiento sexual. Los experimentos a menudo requieren métodos sencillos, fáciles y baratas para distinguir entre los individuos en un juicio. Una técnica estándar para esto es CO 2 anestesia y luego etiquetar o ala de recorte cada marcha. Sin embargo, esto es invasivo y se ha demostrado que afecta el comportamiento. Otras técnicas han utilizado coloración para identificar moscas. En este artículo se presenta un método simple y no invasivo para el etiquetado de Drosophila que les permita ser identificados individualmente dentro de experimentos, utilizando colorante de alimentos. Este método se utiliza en los ensayos en los dos machos compiten para aparearse con una hembra. Teñido permitió la identificación rápida y fácil. Hubo, sin embargo, alguna diferencia en la intensidad de la coloración a través de las tres especies ensayadas. Los datos se presentan mostrando el tinte tiene un menor impacto en el comportamiento de apareamiento de CO 2 en Drosophila melanogaster. El impacto de la anestesia CO 2 se muestra a depender de las especies de Drosophila, con D. pseudoobscura y D. subobscura mostrando ningún impacto, mientras que D. machos melanogaster habían reducido el éxito de apareamiento. El método de colorante presentada es aplicable a una amplia gama de diseños experimentales.

Dos ensayos de apareamiento masculino - El efecto del CO 2 anestesia en la conducta de apareamiento El mejor modelo encontrado para explicar la variación en el efecto de CO 2 anestesia contenía especies como un factor (con D. pseudoobscura y D. subobscura fusionado ya que no mostraron diferencias entre sí). En D. pseudoobscura y D. subobscura no hubo un efecto significativo de CO 2 anestesia en el éxito de apareamiento en dos pruebas masculinas (Z 1589 = 0,087, P = 0,931). Para D. melanogaster, machos expuestos a CO 2 anestesia tuvieron éxito en el apareamiento significativamente menor (Z1,589 = 2,467, P = 0,014). También hubo una interacción significativa entre las especies y tratamiento (χ 2 1589 = 6,83, P = 0,009) con un mayor efecto ser visto cuando D. melanogaster fueron expuestos a gas en la colección o 1 día antes de los ensayos (Tabla 1). Sin embarer, D. machos melanogaster expuestas a CO 2 dos días antes de la prueba experimental no mostró un efecto de CO 2. Dos ensayos de apareamiento masculino - El efecto de coloración intestinal en la conducta de apareamiento Modelo simplificación no mostró efectos significativos de colorante de alimentos se encuentra en cualquiera de las tres especies (P&gt; 0,1). Cuando el tratamiento o el estado de gas se incluyeron en el análisis también estos no fueron significativos (P&gt; 0,1). Las proporciones de apareamientos exitosos para moscas de colores a través de los tratamientos se muestran en la Tabla 2. La diferencia de coloración entre las moscas mantiene en color y la comida sin color se puede ver en la Figura 1. La intensidad de la coloración de alimentos intestinal fue mayor en D. pseudoobscura y D. subobscura que en D. melanogaster. Ensayos de apareamiento individuales - El efecto del uso de CO 2 anestesia en mcomportamiento CIONES No hubo diferencia en la latencia de apareamiento para cualquiera de las tres especies cuando se utilizó CO 2 anestesia para recoger recientemente surgido adultos. Un efecto se encontró para la duración de apareamiento en D. subobscura cuando se expuso a CO 2 dos días antes de los ensayos de apareamiento (Figuras 2 y 3, Tabla 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig1.jpg" /> Figura 1. Fotografía que muestra viales de color y no color Mosca de Alimentos (A) y la Fortaleza de Intestinal coloración en Male D. Subobscura (B). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig2.jpg" /> Figura 2. La media y el 95% intervalos de confianza para Cópula Latencia para las tres especies investigado en ensayos individuales masculinos, cuando los machos eran Anestesiard (barras claras) o no anestesiados (barras oscuras) cuando se cobran como vírgenes antes de la madurez sexual. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig3.jpg" /> Figura 3. La media y el 95% intervalos de confianza para la cópula Duración de las tres especies investigado en ensayos individuales masculinos, cuando los machos fueron anestesiados (barras claras) o no Anestesiados (barras oscuras) cuando se cobran como vírgenes antes de la madurez sexual. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tratamiento </td><td> Especies </td><td> Ensayos No. </td><td> No. moscas de color que se aparearon </td><td> p-valor </td><td> No. moscas gaseados que se aparearon </td><td> p-valor </td></tr><tr><td rowspan="3"> Colección de CO 2 </td><td> D. mel </td><td> 73 </td><td> 36 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 0.0344 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td>79 </td><td> 41 </td><td> 0.8221 </td><td> 44 </td><td> 0.3682 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 71 </td><td> 40 </td><td> 0.3425 </td><td> 33 </td><td> 0.6353 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Expuestos a CO 2 18 horas antes </td><td> D. mel </td><td> 57 </td><td> 28 </td><td> 1 </td><td> 19 </td><td> 0.0163 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td> 65 </td><td> 32 </td><td> 1 </td><td> 31 </td><td> 0.8043 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 68 </td><td> 38 </td><td> 0.3961 </td><td> 35 </td><td> 0.9036 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Expuestos a CO 2 2 días. </td><td> D. mel </td><td> 56 </td><td> 19 </td><td> 0.0222 </td><td> 32 </td><td> 0.3497 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td> 70 </td><td> 32 </td><td> 0.5504 </td><td> 33 </td><td> 0.7202 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 56 </td><td> 29 </td><td> 0.8939 </td><td> 26 </td><td> 0,6889 &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table> Tabla 1. Los resultados de dos experimentos Hombre Choice para todas las especies y tratamientos examinados. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Especies </td><td> Rasgo </td><td> df </td><td> t-valor </td><td> p-valor </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. melanogaster </td><td> Estado latente </td><td> 58 </td><td> 1,379 </td><td> 0,174 </td></tr><tr><td> Duración </td><td> 58 </td><td> 1,243 </td><td> 0,221 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. pseudoobscura </td><td> Estado latente </td><td> 109 </td><td> 0,419 </td><td> 0,676 </td></tr><tr><td> Duración </td><td> 109 </td><td> 0,436 </td><td> 0,664 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. subobscura </td><td> Estado latente </td><td> 83 </td><td> 0,098 </td><td> 0,922 </td></tr><tr><td> Duración </td><td> 83 </td><td> 1,767 </td><td> 0,081 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Los resultados de experimentos de apareamiento individuales examinar el efecto de la colección de CO 2 anestesia en la latencia de acoplamiento y duración. Las pruebas se llevaron a cabo en tres especies de Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura y D. subobscura).

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Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Teñido Insectos de la Conducta ensayos: el comportamiento de apareamiento de anestesiada<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

9.8K vistas.  University of Liverpool. This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

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A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors remains poorly understood. In Drosophila melanogaster, environmental cues, such as food availability, affect mating activity offering a tractable system to investigate the mechanisms modulating sexual behavior. In D. melanogaster, environmental cues are often sensed via the chemosensory gustatory and olfactory systems. Here, we present a method to test the effect of environmental chemical cues on mating behavior. The assay consists of a small mating arena containing food medium and a mating couple. The mating frequency for each couple is continuously monitored for 24 h. Here we present the applicability of this assay to test environmental compounds from an external source through a pressurized air system as well as manipulation of the environmental components directly in the mating arena. The use of a pressurized air system is especially useful to test the effect of very volatile compounds, while manipulating components directly in the mating arena can be of value to ascertain a compound's presence. This assay can be adapted to answer questions about the influence of genetic and environmental cues on mating behavior and fecundity as well as other male and female reproductive behaviors.

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

We demonstrate an assay to analyze the environmental and genetic cues that influence mating behavior in the fruit fly Drosophila melanogaster.

Un método para probar el efecto de las señales ambientales sobre el comportamiento de apareamiento en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

Investigación

Comportamiento

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Neurociencias

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Un ensayo de una sola mosca por el comportamiento de forrajeo en<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but effective method to observe and document the behavior or morphology of flies. Flies were placed in a translucent observation chamber c.a. &#216;15 x 5mm (no food inside) or &#216;15 x 12 mm (with an 8 mm-high piece of food inside). After covering with an ultraviolet (UV)/clear filter with high light transmittance, the chamber was placed under a 5-50x zoom stereo microscope, and mini light-emitting diode (LED) video lights were placed on both sides of the microscope to illuminate the chamber to obtain uniform, soft, bright, and nearly shadow-free light. Then, a compact digital camera with 3-5x optical zoom, which can record 1080 P high-definition or higher resolution video (at a frame rate of &#8805;30 fps), was connected to the eyepiece of microscope through a bracket, and photographs or videos were taken through the eyepiece. By adjusting the zoom knob of the zoom stereo microscope, it was very easy to track the flies and take panoramic or detailed close-up images as needed, while the camera recorded everything under the microscope. Because the flies can stay at any position in the chamber, they can be observed and recorded from all directions. The photographs or videos taken are of good image quality. This method can be used both for scientific research and teaching.

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

This protocol describes how to make a simple adult Drosophila behavior observation chamber, and how to take high-definition photographs/videos of the morphology or behavior of different types of fruit flies in the observation chamber through relatively simple and affordable methods.

Un sistema de imágenes ajustable de alta definición para estudios conductuales de adultos con Drosophila

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Cuantificación de la Drosophila Grooming Comportamiento

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, reductionist, and scalable system for in-depth investigation of motivation using the mating drive of male Drosophila&#160;melanogaster (Drosophila), the methods for which we detail here. The behavioral paradigm centers on the finding that male mating drive decreases alongside fertility over the course of repeated copulations and recovers over ~3 d. In this system, the powerful neurogenetic tools available in the fly converge with the genetic accessibility and putative wiring diagram available for sexual behavior. This convergence allows rapid isolation and interrogation of small neuronal populations with specific motivational functions. Here we detail the design and execution of the satiety assay that is used to measure and alter courtship motivation in the male fly. Using this assay, we also demonstrate that low male mating drive can be overcome by stimulating dopaminergic neurons. The satiety assay is simple, affordable, and robust to influences of genetic background. We expect the satiety assay to generate many new insights into the neurobiology of motivational states.

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

This article describes a behavioral assay that uses male mating drive in Drosophila melanogaster to study motivation. Using this method, researchers can utilize advanced fly neurogenetic techniques to uncover the genetic, molecular, and cellular mechanisms that underlie this motivation.

La medición y la modificación de acoplamiento de unidad en Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Drosophila condicionamiento del corte como una medida de aprendizaje y memoria

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Behavioral Assays for Optogenetic Manipulation of Neural Circuits in Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study introduces easy-to-implement setups for applying optogenetic methods in Drosophila melanogaster. Two optogenetic tools, CsChrimson, a red-light-activated cation channel, and GtACR2, a blue-light-activated anion channel, were employed in four experimental approaches. Three of these approaches involve single-fly experiments: (1) a blue-light optogenetic thermotactic positional preference assay targeting temperature-sensitive heating cells, (2) a red-light optogenetic positional preference assay activating bitter sensing neurons, and (3) a proboscis extension response assay activating the sweet-sensing neurons. The fourth approach (4) is a fly maze setup to assess avoidance behaviors using multiple flies. The ability to manipulate neural activity temporally and spatially offers powerful insights into sensory processing and decision-making, underscoring the potential of optogenetics to advance our knowledge of neural function. These methods provide an accessible and robust framework for future research in neuroscience to enhance the understanding of specific neural pathways and their behavioral outcomes.

This paper presents methods for optogenetic manipulation in Drosophila melanogaster, utilizing CsChrimson and GtACR2 to activate and silence specific neurons. Four experiments are described to utilize optogenetics to explore thermotactic and gustatory behaviors, providing insights into the underlying neural mechanisms governing these processes.

Ensayos conductuales para la manipulación optogenética de circuitos neuronales en Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

Uso del colorante fluorescente, rodamina B, para estudiar la competitividad del apareamiento en mosquitos machos Aedes aegypti

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Teñido Insectos de la Conducta ensayos: el comportamiento de apareamiento de anestesiada

Resumen

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Un método para probar el efecto de las señales ambientales sobre el comportamiento de apareamiento en