This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.

NOTA: Todos los protocolos con animales fueron seguidos de acuerdo con las directrices de cuidado de animales de la Universidad Estatal de Pennsylvania, IACUC # 44057 1. Lentivirus Producción NOTA: El día antes de la transfección, las células LentiX-293 debe ser de al 80% de confluencia. <ol><li> Enjuagar las células con DMEM justo antes de la transfección y se incuban en 10 ml de DMEM / FBS al 10% con penicilina (100 UI / ml) y estreptomicina (100 g / ml) durante 5 min a RT. </li><li> Diluir ADN y polietilenimina (PEI) (1 mg / ml) en relación 1: 3 (1 g de ADN: 3 l de PEI) en 1 ml de DMEM y agitar durante 1 min. El volumen de ADN añadido es dependiente de la concentración del ADN. Incubar a TA durante 10 min. <ol><li> Por ejemplo, utilizar 20 g de ADN plásmido, compuesto por 10 g de plásmido vector, 5 g de psPax2 14 plásmido, 5 g de virus de la estomatitis vesicular (VSV) con 60 l de PEI por plato. </li></ol></li><li&gt; mezclar el ADN y la solución de PEI de nuevo por agitación durante 1 minuto. Incubar a TA durante 10 min. </li><li> Añadir 1 / 10a volumen de medio de cultivo total de DMEM (es decir, 1 ml de medio de cultivo 10 ml en una placa de 100 mm). Añadir 1 ml de DNA-PEI gota a gota la mezcla en el plato y girar el plato alrededor hasta al medio de cultivo es bien mezclado con el ADN. </li><li> Incubar durante 6 hr a RT y eliminar el sobrenadante. Añadir 5 ml de medio de cultivo. </li><li> 48 h después de la transfección, recoger el líquido sobrenadante viral y centrifugado a 627 xg durante 5 min a 4 ° C en un tubo de 50 ml. Filtra 30 ml de sobrenadante viral a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras en un tubo de ultracentrífuga. </li><li> Añadir agua estéril para equilibrar los tubos, y cubrir los tubos con pequeño trozo de parafina. Tubos giran a 11.249 xg durante 120 min a 4 ° C. Retire el líquido usando una punta de vacío. </li><li> Añadir 100 l de PBS frío del tubo. Agite suavemente el tubo a 4 ° CO / N. </li><li> Para volver a suspender el virus, la pipeta tse añadió PBS en el paso 1.8 en los pellets de 10 veces, con cuidado de no tocar el pellet con la punta. El pellet no se volvió a suspenderse hasta que haya terminado. </li><li> Alícuota el virus a 10-20 l por tubo, flash-congelación en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. </li></ol> 2. La inyección estereotáctica 2.1) Preparación de Instrumentos <ol><li> Coloque un par de tijeras, fórceps-extremos romos, un soporte de aguja, bisturí, hisopos de algodón, y un paño en un paquete sellado con un indicador de esterilización, y autoclave antes de la cirugía. Además, obtener 10% de yodo povidona, 70% de alcohol etílico, suturas absorbibles, una almohadilla eléctrica, lágrimas artificiales, un cordón esterilizador de vidrio, taladro, una broca, 2 jeringas desechables, una jeringa de inyección, máquina de afeitar eléctrica, analgésico (ketoprofeno), anestesia (Avertin), guantes, y un aparato estereotáctico con la bomba de inyección. </li><li> Hacer solución 1.25% avertin fresco ese día, el filtro en una campana estéril usando un 0,2 y# 181; m filtro de jeringa estéril, y colóquelo en un vial de suero estéril. Mezclar 2,5 g de alcohol 2,2,2-tribromoetilo en 5 ml de alcohol terc-amilo, luego se disuelven en 200 ml de agua. Mantener el pH por debajo de 5. 15 </li></ol> 2.2) Preparación del ratón <ol><li> Administrar avertin basado en el peso del ratón (375 mg / kg). 15 Inyectar el ratón con el avertin a través de una inyección intraperitoneal (IP) y, a continuación, coloque de nuevo en su jaula hasta que esté totalmente anestesiado. </li><li> Dale un analgésico a través de inyección IP (ketaprofen, 5 mg / kg), y el lugar de lágrimas artificiales en los ojos del ratón para evitar que se seque. </li><li> Asegúrese de que el ratón es completamente dormido pellizcando su pie. Si el ratón responde a la pizca pie, a continuación, dar más anestésico (en dosis de 50 l). Afeitarse la cabeza del ratón usando una máquina de afeitar eléctrica. Afeitarse el área a ser operado (típicamente desde justo detrás de las orejas, en la parte superior del hocico), y sus alrededores. </li><li> Coloque el puntero del ratón into del aparato estereotáxica. Cierre los dientes frontales en la abrazadera anterior, y baje la abrazadera y apriete para que la mandíbula es totalmente seguro. </li><li> Inserte las barras de oído en el canal auditivo para estabilizar por completo la cabeza. Tenga cuidado de no insertar las barras de oído en demasiado, lo que podría dañar el oído interno. Una vez terminado, el cuerpo del ratón debe ser capaz de ser movido ligeramente sin alterar la posición de la cabeza. </li><li> Coloque una almohadilla de calefacción bajo el ratón para regular la temperatura corporal del ratón durante todo el procedimiento. </li><li> Limpie el área quirúrgica a fondo. El uso de un hisopo de algodón, frotar 10% de povidona yodada en un movimiento circular, comenzando desde el centro de la zona quirúrgica y moviéndose hacia el exterior. A continuación, utilice un hisopo de algodón para frotar 70% de alcohol etílico en el sitio quirúrgico de la misma manera. Repetir dos veces. </li></ol> 2.3) La primera incisión <ol><li> Una vez que el ratón está preparada, abra la bolsa de material estéril. Cambiar los guantes antes de touching los instrumentos. Saque el paño estéril y colocar los instrumentos en la tela. Si cualquier instrumento toca una superficie no-estériles, utilice el cordón esterilizador de vidrio durante 15 segundos para esterilizarlo. </li><li> Tome el bisturí en la mano y de gama contundente fórceps dominantes en la mano no dominante. Utilice las pinzas de gama contundente a suavemente agarre la piel del ratón, y hacer una incisión con el bisturí. Comience la incisión alrededor de 1,5 cm encima de las orejas (hacia la nariz) y se extienden a aproximadamente 0,5 cm por debajo de las orejas. Extienda la incisión vertical en la parte media de la cabeza del ratón para exponer bregma (Figura 1). </li><li> Una vez que se visualiza bregma, tome una punta de algodón estéril para eliminar suavemente sangre que cubre la superficie del cráneo. Use dos puntas de algodón para empujar la piel hacia el lado de la cabeza. </li></ol> 2.4) Configuración del equipo <ol><li> Después de cualquier sangre se retira de la superficie del cráneo, y bregma se visualiza claramente, preparar la jeringa (CONcentración de 10 8 TU / ml, volumen de 1 l). En la campana de humos, llenar la jeringa con el virus a inyectar. Asegúrese de que no hay burbujas en el interior. Coloque la jeringa en el aparato estereotáxica, asegurándose de que está completamente asegurada. </li><li> Lentamente baje la jeringa hasta que está justo encima de la superficie del cráneo, de modo que la punta de la aguja de la jeringa estéril se establece en la intersección de la bregma y la línea interaural. Establezca este punto como cero, y determinar las coordenadas de este punto. </li><li> En función del área cerebral de interés, variar las coordenadas estereotáxica. Determinar estas coordenadas mediante la utilización de un atlas cerebral 4. Una vez determinadas las coordenadas, mover la aguja de la jeringa para que coincida con esas coordenadas. Apunte el giro dentado utilizando las coordenadas: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Bajar la aguja a derecha por encima del cráneo para visualizar donde el agujero debe ser perforado. </li><li> Levante ligeramente la jeringa, tome el taladro y coloque la bi taladrot justo encima de la sitio de perforación de destino a aproximadamente un ángulo de 45 ° con el cráneo. Comienza la perforación, y mantener la perforación hasta que el cráneo da paso. Cuando el cráneo da paso, una caída en la resistencia puede ser detectado. Tenga cuidado de no perforar en el cerebro, a fin de evitar daños cortical. </li><li> Tome una punta de algodón estéril, y limpie toda la sangre del agujero. </li><li> Baje la jeringa para que la punta se encuentra justo en la superficie del cerebro (no el cráneo). Ajuste el D / V de coordenadas (profundidad) a 0. Bajo la jeringa a la profundidad deseada, sobre la base de las coordenadas atlas del cerebro. Para alcanzar el giro dentado, ajuste D / V a -1,79 mm. </li><li> Iniciar la inyección a una velocidad de 0,2 l / min. Ver para asegurar que la jeringa no se deslice más baja que la profundidad deseada. Si esto ocurre, elevar suavemente la jeringa hasta la profundidad deseada de nuevo. </li><li> Una vez finalizada la inyección, espere unos 2 minutos para asegurar que cualquier virus residual se haya absorbido. Levante lentamente la jeringa y utilizar una punta de algodón para eliminar cualquier liquid del sitio de inyección. </li><li> Repita para el otro hemisferio. </li></ol> 2.5) La sutura <ol><li> Retire la sutura y aguja estériles de su embalaje y agarre la aguja utilizando los porta-agujas. Cara el borde puntiagudo de la aguja alejada de soporte de la aguja. Mantenga las pinzas de gama contundente en la mano no dominante, y lo utilizan para sujetar la piel en el ratón. Comience con la mano dominante. </li><li> Empuje suavemente la sutura a través de la piel y usar los fórceps-extremos romos para agarrar la piel en el otro lado de la incisión. Tire del material de sutura a través hasta aproximadamente 0,75 pulgadas permanece. </li><li> Suelte la aguja, y utilizar las pinzas de gama contundente para envolver la sutura alrededor del soporte de la aguja una vez, entonces, tomar la sutura restante 0,75 pulgadas con el soporte de la aguja, y tirar de la sutura a través de, por lo que el soporte de la aguja y la aguja terminar en el lado de la cabeza opuesta a la que estaban en un principio. Esto debería formar un nudo. </li><li> Repita este pasotres veces más, alternando el lado de la cabeza el soporte de la aguja termina en cada momento. </li><li> Cortar la sutura y repita los pasos 2.5.1-2.5.3 hasta que se cierra la incisión. </li></ol> 2.6) Cuidados después de la operación <ol><li> Retire con cuidado las barras de oreja de ratón, y retire la mandíbula de la pinza anterior. </li><li> Mantenga el puntero del ratón sobre el cojín eléctrico hasta que se despierta y se mueve alrededor de su propio. Monitorear el ratón a diario, y mantener los ojos a los síntomas de dolor, como no arreglarse, comer o beber. Dé analgésico adicional cuando se considere necesario. </li></ol> 3. Prueba de campo abierto 3.1) Configurar <ol><li> Obtener una plaza vacía, arena de plástico con dimensiones de 50 cm x 50 cm, con 50 cm altos muros (pero puede ser un poco más grande). Limpiar la arena con 70% de alcohol etílico antes del comienzo del experimento. Asegúrese de que el alcohol etílico se haya secado completamente antes de colocar un ratón en la arena. </li><li> Coloque la arena en lapiso, y tratar de garantizar la iluminación se ajusta para minimizar las sombras y reflejos. </li><li> Si utiliza software de seguimiento, coloque la cámara directamente sobre la cabeza del campo abierto, aproximadamente 1,5 pies por encima del campo abierto (lo suficientemente lejos para plena abarcan toda la arena, pero lo suficientemente cerca para tener una visión clara del ratón). </li><li> Establecer una zona en el centro de la caja (aproximadamente una superficie de 30 cm x 30 cm). 16 Para establecer una zona, haga clic en la pestaña de la zona 1 en el panel lateral. <ol><li> Seleccione un esquema forma en el panel superior, y delinear el perímetro de la zona centro. Seleccione añadir zona y haga clic en el interior de la zona centro. Usando las instrucciones del programa, el nombre de la zona (esto se conoce como &quot;centro&quot; para este procedimiento). Si la prueba de comportamiento se anotó a mano, asegúrese de que la parte inferior del campo se divide en 10 cm x 10 cm cuadrados, marcado con cinta. </li></ol></li><li> Configure el software para que los ajustes son correctos, y el ratón es fácilmente visible en la pantalla. Lograr esto mediante el ajuste de la configuración de detección de la máquina para ser compatible con la arena de pruebas (iluminación) y color ratón. NOTA: Cuando los ajustes son correctos, el sistema debe realizar un seguimiento sólo el ratón, y no cualquier sombra o la orina / materia fecal. La configuración de software específicos dependen de la iluminación de la arena, y el color del ratón. </li></ol> 3.2) aclimatación y de ensayo <ol><li> Mueva los ratones experimentales en el comportamiento sala 1 hora antes de la prueba con el fin de aclimatarse a su entorno. Deja los ratones en su jaula para la aclimatación. </li><li> Encienda la cámara para grabar la tarea conductual y colocar el puntero del ratón hacia la parte frontal medio de la arena para que el ratón se enfrenta a la pared. </li><li> Ajuste el temporizador de 5 minutos, y alejarse de la arena. Si es posible, salir de la habitación para no influir accidentalmente el ratón. </li><li> Una vez 5 minutos son, retire el ratón y colocarlos en su jaula. </li><li> Utilice 70% de alcohol etílico para limpiar a fondo de todo el campo antes de proceder a la siguiente ratón. Asegúrese de que el alcohol etílico se haya secado completamente. </li></ol> 3.3) Puntaje <ol><li> Considere el ratón como estar en el centro del campo, cuando las cuatro patas están dentro del medio 30 cm x 30 cm. </li><li> Cuantificar la cantidad de tiempo que el ratón pasa en el centro. Por otra parte, determinar esta vez utilizando software de seguimiento (como Noldus ethovison). <ol><li> Para ello, vaya a la ficha de análisis, y haga clic en &quot;movimiento&quot; en los perfiles de análisis. Eliminar las categorías establecidas en la actualidad y, a continuación, seleccione &quot;en la zona&quot; en la ficha ubicación. Seleccione la zona centro. A continuación, seleccione &quot;Salida de análisis&quot; (bajo la etiqueta de resultados) para ver los resultados. Una tabla con el tiempo pasó inmóvil durante debería aparecer cada ensayo. </li></ol></li><li> De lo contrario, la puntuación de la OFT a mano. El campo abierto debe tener 25 plazas 10 cm x 10 cm esbozados en la parte inferior de la opecampo n (como se indica en el paso 3.1.3). Cuantificar la cantidad de tiempo que el ratón pasa en el centro, además de el número de entradas en el centro de la arena. 16 NOTA: El centro de 30 cm x 30 cm área es considerada el centro del campo abierto. Un ratón se considera que habita la región centro si las cuatro patas se encuentran dentro del área de 30 x 30 cm. </li></ol> 4. Forzada prueba de natación NOTA: Permita un mínimo de cinco días entre las tareas de comportamiento. 4.1) Configurar <ol><li> Obtener un 2 L claro cubo, y se llenan de 22 ° C el agua. Coloque el cubo sobre una mesa, y tratar de garantizar la iluminación se ajusta para minimizar las sombras y reflejos. </li><li> Si utiliza software de seguimiento, coloque la cámara directamente sobre la cabeza de la cuchara. </li><li> Configure el software de manera que el ratón es fácilmente visible en la pantalla. </li></ol> 4.2) aclimatación y de ensayo <ol><li> Mueva ratones experimentales en el ro conductualom 1 hora antes de la prueba se adapte al entorno. Deja los ratones en su jaula para la aclimatación. </li><li> Encienda la cámara para grabar la tarea conductual. Con cuidado, coloque el ratón en el centro del cubo de agua. Asegúrese de no dejar caer el ratón. Baje lentamente el ratón, por lo que sus patas delanteras toquen el agua primero. Tenga cuidado para evitar que la cabeza de sumergir. </li><li> Ajuste el temporizador durante 6 minutos, y alejarse de la zona de comportamiento. </li><li> Una vez 6 min están arriba, quitar el ratón desde el cubo, y limpie el exceso de agua antes de colocar el ratón de nuevo en su jaula. </li></ol> 4.3) Puntaje <ol><li> Si utiliza software de seguimiento, establecer ciento inmovilidad al 11%, según lo sugerido por Noldus (este debe ser el ajuste predeterminado), para cuantificar el tiempo flotando frente a la natación. </li><li> Para cuantificar utilizando el sistema de seguimiento, vaya a la ficha de análisis, y haga clic en movimiento bajo perfiles de análisis. Eliminar las categorías establecidas en la actualidad, a continuación, seleccione el estado de movilidad, enel panel lateral izquierdo (en el comportamiento individual). Establecer la inmovilidad a 11%. </li><li> Seleccione la visualización de pista, en la pestaña Resultados. Seleccione la salida de análisis (en la ficha resultados) para ver los resultados. Una tabla con el tiempo pasó inmóvil durante debería aparecer cada ensayo. </li><li> Si la puntuación parte, medir el tiempo que el ratón pasa la natación o la escalada, y la cantidad de tiempo que el ratón pasa inmóvil. Además, medir la latencia a la primera inmóvil tiempo. Consulte la Figura 2 en la sección Resultados. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Inyecciones estereotáxicas exitosas se basan en tres factores: mantener el ratón vivo, estableciendo el punto cero correcto para las coordenadas (punta de la aguja en la intersección de bregma y la línea interaural) y ajuste de la profundidad adecuada para el punto cero (punta de la aguja apenas tocando el exterior del tejido cerebral). La viabilidad de los ratones es importante. Supervivencia cirugía puede ser ayudado por asegurarse de que el ratón es anestesiado correctamente y recibe analgésica adecuada. El do...

El ratón ha sido ampliamente utilizado en la neurobiología, porque es fácil de manipular genéticamente. Técnicas knockout de genes permiten a los investigadores para investigar cómo cada factor genético da forma a los comportamientos del ratón. Por otra parte, el sistema cre-loxP proporciona una valiosa herramienta para tejidos y tipo de células knockout de genes específicos en ratones, lo que permite a los investigadores estudiar la función de genes en diferentes tejidos. 1 Sin embargo, en la práctica, los patrones de expresión de los promotores cre son difíciles de controlar , y hasta ahora muchos conductores cre establecidos no han logrado específica de la región de expresión. 2,3 Alternativamente, inyección estereotáctica es un método que se dirige a regiones específicas del cerebro del ratón adulto. Mediante la inyección de virus manipulados genéticamente que expresan ADNc o shRNA, específica de la región de modulación de la expresión génica se puede lograr. Aunque el tamaño del cerebro de cada ratón varía, la localización de regiones específicas del cerebro se puede determinar usando coor estereotácticanates ajustar desde puntos de referencia en el cráneo del cerebro del ratón. Los puntos de referencia más utilizados son bregma, lambda, y la línea interaural. Usando coordenadas obtenidas de un atlas del cerebro, 4 la ubicación exacta de cada área del cerebro puede ser identificado por la antero-posterior (A / P), medial-lateral (M / L), y ventral-dorsal (D / V) de los ejes bregma / intersección línea interaural. Normalmente los virus se inyecta en el cerebro de ratones etiquetados, ya sea con la proteína fluorescente de color rojo o verde (RFP o GFP), por lo que las inyecciones pueden ser confirmados por microscopía fluorescente. Evaluaciones de comportamiento de los ratones son especialmente necesarias para la investigación básica de los trastornos psiquiátricos. Los síntomas de los trastornos psiquiátricos en pacientes típicamente involucran comportamientos anormales. Algunos de estos comportamientos humanos son evolutivamente conservados y pueden ser imitado directamente observado en el ratón. Por ejemplo, la depresión puede ser modelado en el ratón mediante la medición de la desesperación conductual. Las personas con depresión oftes sentir como si nada lo hacen jamás ayudar, un síntoma que eventualmente puede conducir al suicidio. En los roedores, esto puede ser modelado utilizando la prueba forzada Swim (FST), que mide la cantidad de tiempo que un ratón nadando contra flotando en un charco de agua (vista como renunciar). Este paradigma se valida mediante el rescate del fenotipo con antidepresivos. 7,8,9 Los ratones que han recibido antidepresivos pasará significativamente menos inmóvil tiempo en comparación con los controles no tratados. Otra prueba de comportamiento, la prueba de campo abierto (OFT) está diseñado para evaluar la locomoción en ratones, y, además, puede ser utilizado para analizar el fenotipo de ansiedad en ratones. 5,6 Esta prueba se basa en la premisa de que los ratones se sienten más seguros cuando están cerca a la pared en un campo abierto novela. Ratones de tipo salvaje finalmente explorar la novela medio ambiente, ya que son animales curiosos. Sin embargo, gastar menos tiempo en el centro del campo indica la ansiedad en el ratón, como el ratón no será capaz de superar la initial miedo provocado por un nuevo entorno. La ansiedad del ratón, tal como se cuantifica por la cantidad de tiempo gastado en el centro de un campo abierto, se puede comparar a la ansiedad clínica en humanos, que está presente en muchos trastornos psiquiátricos. La combinación de inyecciones estereotáxicas con paradigmas de comportamiento es una nueva manera de alterar la expresión de un gen específico en un área del cerebro específica. El efecto de la expresión génica modulada en los comportamientos del ratón se puede determinar. En contraste con knockout de todo el cerebro, este método es particularmente útil, ya que sólo se dirige a áreas específicas del cerebro. Además, las inyecciones estereotáxicas se realizan típicamente en el adulto tipo salvaje del ratón, por lo tanto, la expresión del gen endógeno se ha mantenido a lo largo de las etapas de desarrollo. Este método evitará el efecto confundir si se requiere el gen para la supervivencia durante la etapa embrionaria o postnatal de desarrollo. Una limitación importante es que los ratones experimentales necesitan ir through una cirugía invasiva, en la que los cráneos de ratones tienen que abrirse. Por otra parte, el grado de modulación gen se determina por el título y la eficiencia del virus. El virus necesita para ser inyectada en la región correcta usando coordenadas estereotácticas, que requiere instrumentos especiales. Verificación del sitio de inyección correcta sólo se puede completar post mortem. Este método ha sido utilizado previamente para probar la implicación de un gen específico en diversas enfermedades neurológicas. Por ejemplo, viral RNAi mediada por la orientación del gen Th (que permite la dopamina a ser sintetizado) se inyectó en la sustancia negra compacta, y se llevó a cabo el análisis del comportamiento locomotor. 10 Otro estudio utilizó inyección estereotáctica de un DISC1 silenciamiento lentivirus para evaluar el comportamiento del ratón en relación a la esquizofrenia. Derribo de DISC1 llevó a un aumento de la locomoción en respuesta a la novedad (paralelismos síntomas positivos en la esquizofrenia), y una mayor inmovilidad en elFST. 11 De manera similar, un estudio adicional encontró que 5-HT 1B sobreexpresión condujo a un aumento de comportamiento exploratorio en el OFT, consistente con un fenotipo anti-ansiedad usando este método. 12 inyecciones estereotácticos pueden entregar virus para inducir recombinación cre en ratones cre-loxP . Este método se utiliza para eliminar selectivamente el receptor Y2 en la amígdala y el núcleo lecho de la estría terminal. Tras el análisis del comportamiento, estos ratones se encontraron a un fenotipo anti-depresivo cuando el gen fue suprimido en la amígdala central, pero sin fenotipo cuando el gen fue suprimido en la amígdala basolateral o la cama núcleo de la estría terminal. 13 Por lo tanto, esta técnica proporciona una herramienta única para estudiar el efecto genético sobre los comportamientos de los animales.

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			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
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			<td style="width:107px;">Stoelting co.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51725</td>
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		</tr>
		<tr height="42">
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		</tr>
		<tr height="21">
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		</tr>
		<tr height="21">
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		</tr>
		<tr height="42">
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			<td align="right" style="width:119px;">23966</td>
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		</tr>
		<tr height="42">
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		</tr>
		<tr height="42">
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			<td style="width:107px;">Fine Surgical Tools</td>
			<td style="width:119px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
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			<td style="width:107px;">Fine Surgical Tools</td>
			<td style="width:119px;">12001-13</td>
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		</tr>
		<tr height="84">
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			<td style="width:119px;">Microtorque control box, Tech2000 handpiece</td>
			<td>with pedal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass bead sterilizer</td>
			<td style="width:107px;">Inotech&#160;</td>
			<td style="width:119px;">IS-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
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			<td style="width:107px;">Unify</td>
			<td style="width:119px;">M-K518r19</td>
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		</tr>
		<tr height="21">
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			<td style="width:119px;">89031-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
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			<td style="width:107px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">T-pump TP-500 PN11184-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Artificial tears</td>
			<td style="width:107px;">Rugby</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0536-6550-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable syringe</td>
			<td style="width:107px;">BD Syringe</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloth</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
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			<td style="width:107px;">Ansell</td>
			<td style="width:119px;">Senseitouch #7823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Avertin or other anesthetic</td>
			<td style="width:107px;">see recipe citation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ketoprofen or other analgesic</td>
			<td style="width:107px;">see veternarian&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tracking software</td>
			<td style="width:107px;">Noldus</td>
			<td style="width:119px;">Ethovision XT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tracking Camera</td>
			<td style="width:107px;">Noldus</td>
			<td style="width:119px;">Media Recorder</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying stereotactic injection technique to study genetic effects on animal behaviors

Inyección estereotáctica es una técnica útil para entregar los lentivirus de alto título a áreas del cerebro específicas en ratones. Los lentivirus pueden o bien sobreexpresan o la expresión de genes caída en una región relativamente centrado sin daño significativo al tejido cerebral. Después de la recuperación, el ratón inyectado puede ser probado en diversas tareas de comportamiento tales como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST). El OFT está diseñado para evaluar la locomoción y el fenotipo de ansiedad en ratones mediante la medición de la cantidad de tiempo que un ratón pasa en el centro de un campo abierto novela. Un ratón más ansiosos pasará un tiempo significativamente menor en el centro del campo novela comparación con los controles. El FST evalúa el fenotipo anti-depresivo mediante la cuantificación de la cantidad de tiempo que los ratones pasan inmóvil cuando se coloca en un cubo de agua. Un ratón con un fenotipo anti-depresivo pasará significativamente menos inmóvil tiempo en comparación con los animales control. El objetivo de este protocolo es usar el sterinyección eotactic de un lentivirus, en relación con las pruebas de comportamiento para evaluar cómo los factores genéticos modular comportamientos animales.

<html> Inyección estereotáctica exacto se basa principalmente en el establecimiento de las coordenadas correctas. La punta de la aguja usada para inyectar el virus debe establecerse directamente en la intersección de la bregma y la línea interaural (Figura 1). Es útil usar un microscopio estereoscópico para determinar si la aguja se coloca correctamente. Al mirar a través del microscopio, la aguja debe colocarse de modo que si se inyecta el virus, sería aterrizar directamente en la intersección ...

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Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Inyección estereotáctica de lentivirus que expresan los ADNc o shRNAs pueden modular la expresión génica en áreas específicas del cerebro de los ratones. A continuación, presentamos un protocolo para combinar inyecciones estereotáxica con las tareas de comportamiento, como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST).

Aplicando estereotáctica Técnica de Inyección para el Estudio de los efectos genéticos sobre Comportamientos animales

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

applying-stereotactic-injection-technique-to-study-genetic-effects-on

Research

JoVE Journal

Behavior

14.0K vistas.  The Pennsylvania State University.  Inyección estereotáctica de lentivirus que expresan los ADNc o shRNAs pueden modular la expresión génica en áreas específicas del cerebro de los ratones. A continuación, presentamos un protocolo para combinar inyecciones estereotáxica con las tareas de comportamiento, como la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST). 

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Investigación

Comportamiento

A Within-subjects Experimental Protocol to Assess the Effects of Social Input on Infant EEG

Despite the importance of social interactions for infant brain development, little research has assessed functional neural activation while infants socially interact. Electroencephalography (EEG) power is an advantageous technique to assess infant functional neural activation. However, many studies record infant EEG only during one baseline condition. This protocol describes a paradigm that is designed to comprehensively assess infant EEG activity in both social and nonsocial contexts as well as tease apart how different types of social inputs differentially relate to infant EEG. The within-subjects paradigm includes four controlled conditions. In the nonsocial condition, infants view objects on computer screens. The joint attention condition involves an experimenter directing the infant's attention to pictures. The joint attention condition includes three types of social input: language, face-to-face interaction, and the presence of joint attention. Differences in infant EEG between the nonsocial and joint attention conditions could be due to any of these three types of input. Therefore, two additional conditions (one with language input while the experimenter is hidden behind a screen and one with face-to-face interaction) were included to assess the driving contextual factors in patterns of infant neural activation. Representative results demonstrate that infant EEG power varied by condition, both overall and differentially by brain region, supporting the functional nature of infant EEG power. This technique is advantageous in that it includes conditions that are clearly social or nonsocial and allows for examination of how specific types of social input relate to EEG power. This paradigm can be used to assess how individual differences in age, affect, socioeconomic status, and parent-infant interaction quality relate to the development of the social brain. Based on the demonstrated functional nature of infant EEG power, future studies should consider the role of EEG recording context and design conditions that are clearly social or nonsocial.

This novel protocol is designed to assess the neural bases of social interaction in infants. The paradigm is designed to tease apart how various social inputs such as language, joint attention, and face-to-face interaction relate to infant neural activation. Infant EEG power is recorded during both social and nonsocial conditions.

Un intra-sujetos Protocolo experimental para evaluar los efectos de entrada Social sobre EEG infantil

Despite the importance of social interactions for infant brain development, little research has assessed functional neural activation while infants ...

Testing Animal Anxiety in Rats: Effects of Open Arm Ledges and Closed Arm Wall Transparency in Elevated Plus Maze Test

The elevated plus maze test is a behavioral test for assessing animal anxiety in rodents. Although this test is widely applied in the field of behavioral science, conflicting outcomes are often provided from different laboratories. To identify reasons for the different outcomes, we previously focused on arm features, which differ between laboratories, most notably the presence/absence of ledges at the sides of open arms and the transparency/opaqueness of closed arm walls. In a previous report, we used a custom designed container to compare rat behavior on different combinations of open and closed arm designs under otherwise identical experimental conditions, and showed that differences in arm features interfere with experimental outcomes. In brief, open arm ledges significantly increased anxiety-like behavior in rats, while transparent arms may also have decreased this behavior. Furthermore, we verified a higher detection sensitivity of the effect of an anxiolytic drug in a combination of no-ledged open arm + opaque walled closed arm compared with a combination of ledged open arm + transparent walled closed arm. In this report, we introduce our protocol for the elevated plus maze test, together with discussion of the key results from the previous report and our experimental experience. We believe this report will provide useful information for researchers who have employed or who plan to use the elevated plus maze in their studies.

Rats' anxiety-like behavior tested by the elevated plus maze varies highly depending on the testing environment. Here we show how apparatus settings, especially arm structure, affect behavior on the maze, and we explain a reliable protocol to detect effects of anxiolytic drugs. This report will contribute to anxiety research.

Prueba de ansiedad Animal en ratas: efectos de bordes de brazo abierto y cerrado brazo pared transparencia en elevado mas Test de laberinto

The elevated plus maze test is a behavioral test for assessing animal anxiety in rodents. Although this test is widely applied in the field of behavioral ...

Assessment of Social Transmission of Food Preferences Behaviors

Olfactory recognition deficits are suggested to be able to serve as clinical marker to differentiate Alzheimer&#39;s disease (AD) subjects from healthy aging groups. For example, olfactory dysfunction in AD can present as impairment in olfactory recognition, emerging during early stages of the disease and worsening while the disease progresses. The social transmission of food preferences (STFP) task is based on a rudimentary form of communication between rodents concerning distant foods dependent on the transmission of olfactory cues. Healthy wild-type mice would prefer to eat a novel, flavored food that was previously cued by a conspecific, and this food preference would be hampered in transgenic AD mice, such as the APP/PS1 model. Indeed, a strong preference for the cued food in C57Bl6/J mice of 3 months of age was found, and this was reduced in 3 months old transgenic APP/PS1 mice. In summary, STFP task could be a powerful measure to be integrated in present subclinical detection assays of AD.

This paper presents a protocol for the investigation of social transmission of food preference in mice. The advantages and possible applications for this procedure, for instance, in detecting early changes in AD mouse models, are highlighted. To conclude, interpretation of the results in light of critical details are discussed.

Evaluación de la transmisión Social de comportamientos de preferencias de alimentos

Olfactory recognition deficits are suggested to be able to serve as clinical marker to differentiate Alzheimer&#39;s disease (AD) subjects from healthy ...

Tickling, a Technique for Inducing Positive Affect When Handling Rats

Handling small animals such as rats can lead to several adverse effects. These include the fear of humans, resistance to handling, increased injury risk for both the animals and the hands of their handlers, decreased animal welfare, and less valid research data. To minimize negative effects on experimental results and human-animal relationships, research animals are often habituated to being handled. However, the methods of habituation are highly variable and often of limited effectiveness. More potently, it is possible for humans to mimic aspects of the animals&#39; playful rough-and-tumble behavior during handling. When applied to laboratory rats in a systematic manner, this playful handling, referred to as tickling, consistently gives rise to positive behavioral responses. This article provides a detailed description of a standardized rat tickling technique. This method can contribute to future investigations into positive affective states in animals, make it easier to handle rats for common husbandry activities such as cage changing or medical/research procedures such as injection, and be implemented as a source of social enrichment. It is concluded that this method can be used to efficiently and practicably reduce rats&#39; fearfulness of humans and improve their welfare, as well as reliably model positive affective states.

This article demonstrates the standardized application of playful handling, a tickling technique designed to mimic rat rough-and-tumble play. This technique is effective at reducing fearful reactions to humans and generating positive affect when rats are handled for common husbandry activities and medical and research procedures such as injection.

Cosquillas, una técnica para la inducción de afecto positivo al manipular las ratas

Handling small animals such as rats can lead to several adverse effects. These include the fear of humans, resistance to handling, increased injury risk ...

Using a Classroom-Based Deese Roediger McDermott Paradigm to Assess the Effects of Imagery on False Memories

Associated word list procedures can elicit false memories in predictable ways by inducing associative processing, thus making it harder to monitor the accuracy of memories. The purpose of the method presented here was to induce false memories using lists of either semantically or phonologically related words and to assess the effects of imagery instructions on the recall and recognition of those false memories. To do this, we used a modified version of the Deese Roediger McDermott (DRM) paradigm. We adapted word lists from previous DRM studies to suit imagery procedures and created an automated presentation to present the word lists in classroom settings. We then recruited undergraduate classes and instructed some of the classes to create mental images of the list words as they were being presented, while instructing the other classes to simply remember the words. The automated presentation presented word lists to participants, one word at a time, alternating between phonologically and semantically related lists. Participants used paper-pencil recall packets to immediately recall list items, complete a distractor activity, and take a subsequent final recognition test. Often, participants immediately recalled and later recognized words that were related to the list items but were not actually presented; these are known as critical lures and indicate a false memory. The protocol detailed here describes a four-step procedure - list presentation, immediate recall, distractor phase, and final recognition - that can assess the effects of list type and imagery instruction within the DRM paradigm on memory. The automated nature of the list presentation provides the ability to systematically vary variables of interest, and the paper and pencil method of data collection affords an easily accessible method for collecting data in classroom settings. The protocol also offers options to modify the procedure to a more traditional DRM paradigm without imagery and/or list type manipulations. The use of this protocol can provide results relevant to both classroom learning and cognitive science principles.

The method presented here induced false memories using lists of related words and also assessed the effects of imagery instructions on the recall and recognition of those false memories. This protocol details a modified version of the Deese Roediger McDermott (DRM) paradigm.

Utilizando un paradigma de McDermott en el aula Deese Roediger para evaluar los efectos de imágenes en recuerdos falsos

Associated word list procedures can elicit false memories in predictable ways by inducing associative processing, thus making it harder to monitor the ...

Assessing the Coherence of Parents' Short Narratives Regarding their Child Using the Five-Minute Speech Sample Procedure

Valid and efficient measures for assessing the quality of parent-child relationships are needed to facilitate research and evidence-based practice with parents. This paper focuses on such a method, namely Five-Minute Speech Sample-Coherence (FMSS-Coherence). In this method, a parent is asked to speak for five uninterrupted minutes about her/his child and their relationship. The resulted narrative is coded for coherence, namely the extent to which the parent provides&#160;in the narrative&#160;a clear, consistent, multidimensional and well-supported portrayal of the child. FMSS-Coherence is based on attachment research that shows that the coherence of parents&#8217; narratives is indicative of the quality of the parent-child relationship and child adjustment. It overcomes the limitations of attachment narrative measures which are typically labor intensive. FMSS-Coherence is less nuanced than extant attachment narrative measures. Yet, studies of families from different cultural backgrounds, across different child ages and in the context of typically developing children as well as children with special needs suggest that coherence can be reliably evaluated using the FMSS procedure. Furthermore, parents&#8217; FMSS-Coherence is associated with parenting quality and children&#8217;s socio-emotional adjustment. Thus, it holds promise for researchers and practitioners who seek a relatively time- and cost-effective method for assessing the coherence of parents&#8217; narratives regarding their child.

Assessing the Coherence of Parents&#039; Short Narratives Regarding their Child Using the Five-Minute Speech Sample Procedure

This paper introduces a method for assessing the coherence of parents' short narratives regarding their child and their relationship using the five-minute speech sample procedure.

Evaluar la coherencia de las narrativas cortas de los padres con respecto a su hijo utilizando el procedimiento de muestra de habla de cinco minutos

Valid and efficient measures for assessing the quality of parent-child relationships are needed to facilitate research and evidence-based practice with ...

Applying an eMASS Customization Program as a Research Tool to Evaluate Consumer Benefits

As many scholars and practitioners study personalization and relationship marketing, it is important to provide personalization such as mass customization through marketing technology. The purpose of this study is to examine how to conduct consumer research using an online survey and analysis of data. This study examines consumers&#39;&#160;perceived benefits while customizing a product as well as emotional product attachment, attitudes toward a customization program, and loyalty intentions in the context of online retailing. In addition, this study investigates how consumer responses are different based on individual characteristics such as fashion innovativeness. An online survey company in South Korea recruited 290 female apparel shoppers who purchased apparel online. To enhance external validity, this study used an existing retail website with a well-established mass customization program. After completing the customization program, participants complete the online questionnaire. Structural equation modeling (SEM) and latent mean analyses (LMAs) are then performed for analyses. This study stresses the importance of testing measurement invariance for mean comparisons. Before the SEM and LMA, this study follows the hierarchy of invariance tests (configural invariance test, metric invariance test, and scalar invariance test), which are not considered by traditional approaches such as ANOVA. These statistical analyses provide applicability of the invariance test procedures and LMA to consumer behaviors. The conclusions of mean differences have integrity and validity because they are guided by a sophisticated statistical procedure to ensure measurement invariance.

Presented here is a protocol to examine consumer responses toward mass customization in the context of online retailing. The protocol details the online survey procedure and how to analyze data using structural equation modeling and group differences using latent mean analyses.

Aplicación de un programa de personalización de eMASS como herramienta de investigación para evaluar los beneficios del consumidor

As many scholars and practitioners study personalization and relationship marketing, it is important to provide personalization such as mass customization ...

An Experimental Paradigm for Measuring the Effects of Ageing on Sentence Processing

Previous studies have found that older adults have greater difficulties in processing syntactically complex sentences than younger adults. However, the exact regions where the difficulties arise have not been fully identified. In this study, a maze task was implemented to investigate how older adults and younger adults differentially processed two types of sentences with different levels of syntactic complexity, namely subject relative clauses and object relative clauses. Participants were asked to choose between two alternatives at each segment of the sentences. The task required participants to engage in a strictly incremental mode of processing. The reading times for each segment were recorded, allowing the quantification of the difficulty of sentence reading. The task allowed us to identify the exact locations of the processing difficulty and thus facilitate a more accurate assessment of the age-related decline in sentence processing. The results indicate that the effect of ageing was found mainly at the head nouns, but not at other regions of the sentences, a finding which suggests that the maze task is an effective method to identify the exact location of the ageing effect on sentence processing. The implications of this experimental paradigm for investigating the effect of ageing on sentence processing are discussed.

Here, we present a protocol to examine the age-related decline in sentence processing using a maze task that allowed us to localize the processing difficulty at each word of the sentences during reading.

Un paradigma experimental para medir los efectos del envejecimiento en el procesamiento de sentencias

Previous studies have found that older adults have greater difficulties in processing syntactically complex sentences than younger adults. However, the ...

The Use of Traditional Fear Tests to Evaluate Different Emotional Circuits in Cattle

Animal temperament is complex and has implications for productivity and economic profitability. Quantifying an animal&#39;s response to differing stimuli may facilitate breeding selections and identify animals that are better suited to specific management strategies. Multiple tests have been developed to evaluate cattle temperament (e.g., exit velocity, chute score, pen score, open field test, startle test, bovine zero maze), but each of these tests evaluates the animal&#39;s response to different stimuli (e.g., isolation, novel environment, startle, willingness to enter an enclosed area). Cattle temperament has been observed to be relatively stable over time. However, the evaluation of temperament has the potential to be influenced by current conditions, previous experiences, and observer bias. Many of these temperament tests have been improperly categorized as fear tests and have also been criticized for being subjective. This paper provides a framework for standardizing behavioral tests for cattle and suggests that these different evaluations assess different aspects of the animal&#39;s overall temperament.

Here, we present a protocol to conduct a variety of behavioral tests in cattle that have been designed to evaluate emotions. A battery of behavioral tests (open field test, startle test, bovine zero maze, exit velocity, pen score, and chute score) were conducted to evaluate different components of animal temperament.

El uso de pruebas tradicionales de miedo para evaluar diferentes circuitos emocionales en el ganado

Animal temperament is complex and has implications for productivity and economic profitability. Quantifying an animal&#39;s response to differing stimuli ...