El objetivo general de este protocolo es examinar y cuantificar la regeneración muscular en un modelo de pez cebra de enfermedad muscular. Este método proporciona una tubería de alto rendimiento que no solo es rentable, sino también altamente reproducible para calificar el potencial regenerativo de un músculo enfermo en un entorno in vivo. Demostrando el procedimiento conmigo estará Avnika Ruparelia, investigadora del Instituto Australiano de Medicina Regenerativa.
Para el genotipado de embriones vivos, pele la película protectora transparente de la superficie superior de un chip de extracción de ADN de 24 cámaras y use una punta de filtro de 20 microlitros con una punta cortada para transferir un solo embrión anestesiado en 13 microlitros de medio embrionario a cada cámara del chip. Cuando todos los embriones hayan sido cargados, monte suavemente el chip en la plataforma de genotipado de embriones de pez cebra colocando un lado en primer lugar, seguido por el resto del chip. Coloque la tapa de la plataforma magnética sobre el chip para evitar la evaporación del medio embrionario durante el protocolo de extracción de ADN y cierre la tapa.
Configure la unidad base a 2,4 voltios, 0,051 amperios y 0,12 vatios e inicie el protocolo de extracción de ADN. La plataforma debe comenzar a vibrar, lo que se puede evaluar tocando suavemente la tapa. Mientras se ejecuta el programa, prepare una placa de 24 pozos agregando un mililitro de medio embrionario a cada pozo y etiquete los tubos de tira de ocho pozos que se utilizarán para la recolección de material de ADN de cada embrión.
Después de ocho minutos de extracción, presione el botón de encendido / apagado para detener la vibración de la plataforma, retire suavemente la tapa magnética y levante el chip de la plataforma. Transfiera 10 microlitros de medio embrionario de una cámara al pozo apropiado del tubo de tira de ocho pozos e inmediatamente agregue dos gotas de medio embrionario fresco a las cámaras. Transfiera el embrión de la cámara a un pozo apropiado de la placa de 24 pozos previamente preparada.
Cuando todos los embriones hayan sido transferidos, coloque la placa en una incubadora de 28 grados centígrados. Realizar los ensayos de genotipado aguas abajo apropiados sobre el material genético recogido en los tubos de tira de ocho pozos para determinar el genotipo de cada embrión. Una vez identificado el genotipo de cada embrión, transferir los embriones a placas de Petri de 90 milímetros que contengan 25 mililitros de agua media e incubar las placas a 28 grados centígrados hasta la lesión muscular.
A los cuatro días después de la fertilización, use una pipeta para transferir una larva anestesiada a una nueva placa de Petri y retire cuidadosamente cualquier exceso de medio de la placa bajo un microscopio de disección. Oriente el pez de tal manera que la cabeza esté a la izquierda, la cola esté a la derecha, la región dorsal esté hacia arriba y la región ventral hacia abajo, y use una aguja de calibre 30 para hacer una puñalada rápida y precisa en uno o dos somitas en el músculo epaxial por encima del poro anal y horizontal al mioseptum. Aplique una gota de medio embrionario al pez cebra lesionado y transfiera cuidadosamente la larva a un pozo de una placa de 24 pozos que contenga un mililitro de medio embrionario fresco por pozo.
Cuando todas las larvas se hayan lesionado, coloque la placa en la incubadora de 28 grados Celsius hasta que se tome la imagen del pez cebra. Para cuantificar la regeneración muscular, abra una imagen de un día después de la lesión en un programa de software de análisis de imágenes apropiado y use la herramienta de polígono para dibujar una forma alrededor del sitio de la herida. Utilice el software para medir el área y la intensidad media de birrefringencia de la región y copie estos valores en las celdas D3 y E3 de la plantilla proporcionada.
Dibuje dos regiones adicionales, cada una de las que abarque de uno a dos somitas ilesos y mida el área y las intensidades medias de birrefringencia de cada una de estas regiones. Copie estos valores en las celdas D4 y D5 y E4 y E5 de la plantilla. Luego repita la medición para las mismas regiones en la imagen de tres días después de la lesión.
Cuando la birrefringencia se haya medido de la misma manera en todas las imágenes, calcule la birrefringencia normalizada para cada región dividiendo la intensidad media de birrefringencia de cada región por su área. Para cada punto de tiempo, calcule la birrefringencia normalizada promedio de las dos regiones no lesionadas para proporcionar un punto de referencia para el músculo no lesionado. Para determinar el alcance de la lesión muscular en el primer día después de la lesión, divida la birrefringencia normalizada de la región de la lesión por la birrefringencia normalizada promedio de las regiones no lesionadas.
Para determinar el grado de regeneración muscular, divida la birrefringencia normalizada de la región de la lesión en la imagen de tres días posterior a la lesión por la intensidad normalizada promedio de las regiones no lesionadas en esta etapa. Finalmente, calcule el índice regenerativo dividiendo el valor de la extensión de la regeneración muscular en el tercer día después de la lesión por el valor de la extensión de la lesión muscular en el primer día después de la lesión. En este análisis representativo, una nidada de embriones de un cruce entre dos peces cebra heterocigotos Lama2 se transfirió a un chip de extracción de ADN y posteriormente se genotipó.
Mientras que la lesión muscular resulta en una reducción en la intensidad de la birrefringencia en el primer día después de la lesión, la regeneración exitosa del músculo resulta en un aumento de la birrefringencia dentro de la misma región. También es digno de mención que mientras que las larvas de tipo silvestre muestran una intensidad de birrefringencia uniforme debido a un patrón muscular normal, la intensidad de birrefringencia en el músculo de las larvas knockout de Lama2 es desigual y altamente esporádica probablemente debido a una integridad muscular reducida. Como se observó, tanto las larvas de tipo silvestre como las deficientes en Lama2 demuestran un aumento significativo de la intensidad de birrefringencia en el sitio de la herida a los tres días posteriores a la lesión en comparación con un día después de la lesión, lo que indica que el músculo se ha regenerado.
La determinación del índice regenerativo revela que las larvas deficientes en Lama2 muestran un aumento sorprendente en la regeneración muscular en comparación con los animales de tipo salvaje. Si bien este protocolo nos permitirá identificar cualquier alteración en la capacidad del músculo para regenerarse en modelos de enfermedad muscular, es necesario realizar análisis celulares y moleculares aguas abajo para identificar los mecanismos que son responsables de los cambios observados. Este método nos ha permitido identificar cómo la función deteriorada de las células madre musculares y un deterioro en los elementos de nicho asociados contribuyen a la patogénesis de la enfermedad muscular, lo que nos permite identificar nuevos mecanismos de enfermedad.
