Name: capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy
Uploaded: 2015-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy at JoVE.com

We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense &#8211; USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.

Zebrafish (ceppo madreperla) sono stati allevati e cresciuto secondo i protocolli stabiliti. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza, con 0,4 Tricaine mM per l&#39;anestesia e 1 Tricaine mM per l&#39;eutanasia. Zebrafish embrioni e larve sono state gestite in stretto accordo con le buone pratiche animale come approvato dalla commissione competente (Laboratorio MDI Biological animale nucleo IACUC numero 13-20). Questo studio è stato approvato dall&#39;Istituto Human Genome Research cura degli animali e uso Comitato Nazionale, MDIBL istituzionale Assurance # A-3562-01 sotto protocollo # 14-09. Nota: La procedura di imaging in grado di catturare la rigenerazione pinna zebrafish larvale è riassunta nei seguenti punti: 1. Raccolta di Zebrafish di stadi larvali <ol><li> Raccogliere le uova e mettere circa 50 uova in una capsula di Petri di 100 x 25 mm contenente 0,03% di sale Ocean istantanea in acqua deionizzata integrato con 0,00004% blu di metilene. Incubare O / N in un incubatore a 28.5 °. </li> &lt;li&gt; Il mattino dopo rimuovere gli embrioni morti con una pipetta di vetro e lavare le uova in un colino con il 0,03% di sale Ocean istantanea in acqua deionizzata (medio dell&#39;embrione chiamato). Nota: Media come Ringers 18, Hanks 18, E2 19, E3 20, e Danieau 21 può essere preferibile. </li><li> sup&gt; Aggiungi medio embrione fresco al piatto. Se utilizzando ceppi pigmentati, opzionalmente aggiungere 0,2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU), come PTU impedirà melanogenesi e quindi la pigmentazione delle larve. Lasciate che gli embrioni si sviluppano ulteriormente in incubatrice fino a 2 giorni dopo la fecondazione o qualsiasi altra fase larvale desiderato. </li></ol> 2. Preparazione di sezione Imaging <ol><li> Metodo 1: Imaging camere in PVC o tubi in Teflon (Figura 1) Nota: Questo metodo è simile a Concha e Adams (1998) 22. <ol><li> Acquisire grado di plastica di acqua potabile o di tubi in Teflon da un negozio di ferramenta con una esterna 25 millimetrida 20 millimetri di diametro interno. Tagliare il tubo per fare anelli di circa 10 mm di spessore con una superficie piana su ogni lato. Utilizzare&gt; 200 carta vetrata a grana per lisciare i bordi. </li><li> Pulire gli anelli con acqua calda e il 70% di etanolo e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Con un puntale, applicare grasso al silicone alla metà di un anello e fissare l&#39;anello a x 25 mm vetrino di vetro 75 mm. In alternativa, utilizzare una siringa da 3 ml riempita con grasso al silicone al posto di una punta della pipetta. Nota: Poiché è difficile inserire il grasso siliconico nella siringa 3 ml, aggiungere il grasso al silicone in una siringa da 30 ml prima e di utilizzare per il riempimento della siringa 3 ml. </li></ol></li><li> Metodo 2: Preparazione di un piatto Petri come camera di imaging. <ol><li> Acquisire 35 o 60 mm di diametro Petri con un coprioggetto di vetro fissato al coperchio (Figura 2A). In alternativa, come illustrato nella figura 3 Distel &amp; Koester (2007) 23, praticare un&#39;apertura piccola abbastanza da hvecchio un coprioggetto nel coperchio di una piccola capsula di Petri e applicare grasso al silicone all&#39;esterno con una siringa 3 ml. Usando una pipetta pulita, applicare accuratamente una rotonda o quadrata coprioggetto di spessore desiderato verso l&#39;esterno (Figura 2B). </li></ol></li><li> Per garantire che l&#39;agarosio utilizzato per soggiorni saldamente attaccati durante la procedura di imaging di montaggio, collegare una rete di plastica multa all&#39;interno dell&#39;anello. In primo luogo, tagliare la maglia fatta di schermo di finestra ottenuto da un negozio di ferramenta, nella dimensione del diametro dell&#39;anello interno con le forbici bene con un angolo. Poi tagliare un piccolo rettangolo&gt; due volte la dimensione della larva al centro della maglia (figura 1, 2). </li><li> Applicare quattro piccoli punti di grasso al silicone non tossico per l&#39;interfaccia tra il vetrino e l&#39;anello camera (Figura 1A). </li><li> Usare pinze per fissare la maglia saldamente al fondo del vetrino di vetro. </li></ol> 3. Montaggio e imaging del Pre-injrato Larva (questo passaggio è facoltativo) Nota: Questo passaggio è adatto per il confronto tra la lunghezza della pinna amputata e rigenerata, mentre l&#39;aereo amputazione dopo la rigenerazione pinna non è riconoscibile in larve di zebrafish. <ol><li> Preparare una soluzione di agarosio 0.5-1.2% bassofondente nel mezzo embrioni per l&#39;immobilizzazione del campione. </li><li> Riscaldare l&#39;agarosio in un forno a microonde e trasferire il liquido in agarosio 1,5 ml tubi che vengono pre-riscaldato a 42 ° C in un blocco di riscaldamento. </li><li> Sia l&#39;agarosio calda raffreddare a 42 ° C, che può essere mantenuta per diverse settimane a questa temperatura. Cercate di evitare pipettare le larve in agarosio sopra 42 ° C, in quanto questo sarà dannoso per gli animali. </li><li> Anestetizzare vari larve utilizzando 10 ml di 0,4 Tricaine mM (pH 7) in mezzo embrione in un piatto Petri del diametro di 60 mm. Preparare il Tricaine secondo le Zebrafish libro Ricette 18. <ol><li> In alternativa, utilizzare 10 ml di una diluizione 1: 1000 99% 2-fenossietanolo in un piatto Petri del diametro di 60 mm. Poke le larve con una punta microloader pipetta capped per valutare la loro risposta al tocco prima di procedere. Utilizzare solo le larve non risponde. </li></ol></li><li> Trasferire una larva nel C soluzione di agarosio 42 ° con una pipetta Pasteur di vetro. Non trasferire il liquido eccessivo nella agarosio, altrimenti il ​​agarosio sarà troppo diluito e non solidificare. </li><li> Eliminare il liquido rimanente dalla pipetta e trasferire la larva con una goccia di agarosio in una piccola scatola di Petri (35 o 60 mm di diametro). Posizionare la larva su un lato per l&#39;imaging della pinna caudale. </li><li> Lasciare che il agarosio solidificare. Valutare l&#39;agarosio con una pipetta di plastica; la punta si immergono nel agarosio se è troppo liquido. Una volta che l&#39;agarosio si è solidificato, una piccola rientranza sarà visibile dopo aver toccato con la punta della pipetta. A seguito di solidificazione, aggiungere la soluzione Tricaine e procedere alla stereomicroscopio che verrà utilizzato in seguito per l&#39;imaging time-lapse. <li> Utilizzare uno stereomicroscopio con software time-lapse. Selezionare un obiettivo e l&#39;ingrandimento del caso, che sarà utilizzato in seguito per l&#39;imaging time-lapse. Qui, utilizzare un 3.5 x 16 millimetri, distanza di lavoro lente obiettiva su uno stereomicroscopio. Come desiderato, utilizzare microscopi alternativi e lenti dell&#39;obiettivo, ma scegliere un ingrandimento adeguato per tenere conto di potenziali xy-drift e la crescita della pinna durante la procedura di imaging. </li><li> Selezionare la modalità di rilevazione telecamera sul microscopio. </li><li> Nel software, selezionare la modalità &#39;live&#39; per vedere la larva sullo schermo. </li><li> Aprire la finestra &#39;Proprietà&#39; per rilevare automaticamente la luminosità. </li><li> Regolare manualmente il contrasto al microscopio trans-illuminazione di base. </li><li> Spostare la larva fuori del campo visivo e selezionare la funzione Correzione Shading per minimizzare sfondo noise. </li><li> Posizionare la larva di nuovo nel campo visivo e scattare una foto. Salvare l&#39;immagine. </li><li> Rimuovere l&#39;agarosio dalla larva dalla prima raschiando il agarosio la testa. In questo modo la larva può essere scivolato fuori dal agarosio tirando delicatamente la testa dal agarosio rimanente con una ridotta punta microloader pipetta o un perno insetto. </li><li> Con una pipetta Pasteur di vetro trasferire la larva in soluzione Tricaine fresco. </li></ol> 4. Amputazione Assay <ol><li> Preparare una soluzione di agarosio 1,5% con media embrione e versare uno strato sottile in una capsula di Petri. Lasciate che il agarosio solidificare. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, posizionare il sideward larva sul agarosio solidificato e amputare la pinna di coda con un G siringa 23 con una leggera pressione (Figura 3A). </li></ol> 5. Montaggio del Larva per Time-lapse imaging <ol><li> Procedere come descritto nei passaggi 3,1-3,5 (Figura 3B). </li><li&gt; Trasferire un calo del 0,5-1,2% agarosio liquido a 42 ° C contenente la larva nell&#39;anello camera di imaging (passo 2,1), orientare la larva e lasciare che il agarosio solidificare. Riempire l&#39;anello con soluzione Tricaine. In alternativa, se la camera di scatola di Petri (punto 2.2) è utilizzato, montare la larva sul vetrino coperchio e riempire il coperchio con la soluzione Tricaine. </li><li> Per consentire una corretta guarigione della ferita o la rigenerazione dei tessuti a verificarsi, raschiare con cura l&#39;agarosio circonda la pinna caudale distale con un tappo tip microloader pipetta o un perno insetto. Cercate di non danneggiare la pinna ripetutamente (Figura 3C). </li><li> Decantare la soluzione Tricaine contenente il rimosso agarosio e riempire l&#39;anello da camera con soluzione Tricaine fresca. </li><li> Applicare grasso al silicone all&#39;inizio dell&#39;anello camera e collegare un x 25 mm vetrino 75 mm. Cercate di evitare sacche d&#39;aria nella camera, in quanto interferiscono con l&#39;imaging campo chiaro e essiccare la larva nel tempo. </li><li> Se si utilizza una capsula di Petri comeuna camera di imaging, applicare grasso al silicone al bordo superiore della camera inferiore e riempire la camera inferiore con soluzione Tricaine. Decantare attentamente la soluzione Tricaine nel coperchio e ruotare il coperchio verso immergere la larva nella soluzione Tricaine della camera inferiore con una leggera angolazione per evitare sacche d&#39;aria. La camera viene sigillato a causa del grasso al silicone. </li></ol> 6. Time-lapse imaging <ol><li> Assemblare una camera di incubazione riscaldata come descritto in 23,24 (figura 4) .Rimontare camera umida intorno al microscopio e accendere il calore. Regolare la temperatura a 28 ° C per circa 10 - 20 min o fino a quando la temperatura si è stabilizzata. </li><li> Aprire la parte anteriore della camera di incubazione riscaldata e posizionare la camera di imaging sul supporto microscopio con coprioggetto rivolto verso l&#39;alto verso l&#39;obiettivo. </li><li> Posizionare la pinna larvale in modo che 2/3 del campo visivo rimane non occupato. Questo assicura la cattura delcrescita e la rigenerazione della pinna nel corso della procedura di imaging senza dover riposizionare la larva. <ol><li> Regolare la larva montato a 28 ° C per ~ 30 minuti prima di iniziare la registrazione time-lapse di evitare cambiamenti di intensità campo chiaro o potenziali spostamenti della agarosio. In alternativa, utilizzare buffer di pre-riscaldato per avviare l&#39;imaging dopo tempo di regolazione più brevi. </li></ol></li><li> Per impostare la registrazione time-lapse, aprire la finestra 6D Multidimensionale acquisizione nel software AxioVision e selezionare l&#39;opzione z-stack e time-lapse. </li><li> Opzionale) Nella scheda z-stack e modalità Slice, selezionare lo spessore della fetta e quindi selezionare la modalità di Start / Stop. </li><li> Definire la posizione superiore e inferiore della pila. </li><li> Nella scheda time-lapse, selezionare l&#39;intervallo e la durata del film e quindi avviare il filmato premendo il pulsante di avvio. Abbiamo scoperto che intervalli di 30 min sono sufficienti e questo intervallo non genera dati eccessivo; tuttavia shortepossono essere utilizzati intervalli r. </li><li> Controllare le dimensioni di posizione e z-stack durante la prima ora, se la larva non è stato pre-regolato. Se necessario, riposizionare la larva dopo un giorno, come la larva può essere spostato. </li><li> Salvare il file alla fine della registrazione time-lapse e procedere con la post-elaborazione e quantificazioni utilizzando disponibili software di analisi dell&#39;immagine, come ad esempio Imaris 25 o l&#39;open source software Immagine J 26 e 27 Fiji. </li></ol> Analisi 7. I dati <ol><li> Determinare la lunghezza della pinna. <ol><li> Aprire il filmato time-lapse nel software di imaging e salvare i file nel formato file proprietario per migliorare le prestazioni del software. </li><li> Selezionare la vista ortogonale per visualizzare le sezioni individuali come stack proiettate. Per la correzione della deriva, sotto il menu Fiji, selezionate Plugin, quindi registrazione, e &#39;corretto deriva in 3D&#39;. Si aprirà una finestra Fiji ed effettuare le correzioni di deriva. Correttoderiva di rotazione in funzione Spots Imaris. In alternativa, installare i plugin StackReg e TurboReg in immagine J e importare a Fiji. Scegliere l&#39;algoritmo trasformazione desiderata nel plugin StackReg. </li><li> Per misurare le distanze (ad esempio, diametro della ferita o lunghezza fin), selezionare l&#39;opzione &#39;aggiungere nuovi punti di misura &quot;nella barra degli strumenti in alto a sinistra. <ol><li> Sotto &#39;lista Configura Statistiche visibili valori&#39; nel menu in basso a sinistra, selezionare i valori delle statistiche da visualizzare. </li><li> Nella &#39;Modalità Line&#39; nella scheda Impostazioni selezionare &#39;Pairs (AB, CD ...). </li><li> In &#39;Etichette Proprietà&#39; select &#39;Nome&#39; e &#39;Distance&#39;, per mostrare la distanza tra i punti A e B accanto alla linea di misura. </li><li> Passare alla modalità &#39;Modifica&#39; e tenere premuto il tasto Maiusc per selezionare il primo punto alla fine della notocorda. Quindi utilizzare la stessa configurazione per selezionare il secondo punto sul margine distale della pinna. </li><li> Nella scheda &#39;Statistiche&#39;, selezionare il pulsante del disco (Esporta tutto) in basso a destra per visualizzare ed esportare la distanza nell&#39;immagine. </li><li> Ripetere le misurazioni a volte selezionati spostando il cursore sotto l&#39;immagine a destra. Invece di creare nuovi punti di misura, quelli precedenti possono essere riposizionati selezionando prima il punto con il tasto sinistro del mouse, quindi contemporaneamente premendo il cambio e il tasto sinistro del mouse nella nuova posizione. </li></ol></li><li> In alternativa all&#39;opzione punti di misura, utilizzare lo spettatore fetta per misurare le distanze. Nella modalità di visualizzazione fetta, scorrere fino alla posizione desiderata e fare clic sulla prima e seconda posizione con il tasto sinistro del mouse. Verrà visualizzata la distanza. Questa opzione però non consente l&#39;esportazione di dati. </li></ol></li><li> Determinare la lunghezza della pinna e l&#39;area in ImageJ. <ol><li> Aprire il filmato time-lapse in ImageJ utilizzando un plugin che riconosce il formato di file .zvi. In alternativa, caricare in un Qufile di ickTime o una sequenza tiff. Nota: Se si utilizza un formato di file TIFF non compresso, le dimensioni dell&#39;immagine non devono essere specificati. </li><li> Se l&#39;apertura di un formato di file diverso senza le informazioni sul file, selezionare &#39;Set Scale&#39; nel menu &#39;Analizza&#39; per definire prima la distanza dell&#39;immagine e l&#39;unità. Nel &#39;Set menu Scala&#39;, digitare il &#39;Distanza in pixel&#39;, sotto digitare la &#39;distanza nota&#39; per il valore di pixel (questo può essere ottenuto misurando il numero di pixel su una barra di scala che è stato aggiunto all&#39;immagine , quindi fare clic su Misura per ottenere il risultato), e la &#39;Unità di lunghezza&#39; (tipicamente &#39;micron&#39;). Quindi fare clic su OK. </li><li> Per pinna misurazioni dell&#39;area selezionare lo strumento &#39;selezione a mano libera&#39; nella barra degli strumenti e delineano l&#39;area fin tenendo premuto il tasto sinistro del mouse mentre si disegna lungo il contorno della pinna. Per le misure di lunghezza pinna, selezionare la &#39;dritta&#39; strumento linea e tracciare una linea tra i punti desiderati per esseremisurata. </li><li> Selezionare l&#39;opzione &#39;Misura&#39; sotto &#39;Analizza&#39; per visualizzare l&#39;area e la lunghezza della pinna. Ripetere questo passo con la frequenza necessaria per più punti di tempo del film. </li></ol></li><li> Utilizzando le statistiche software i dati possono essere visualizzati graficamente. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo presentato permette di osservare la guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti nel vivere larve zebrafish con in vivo time-lapse imaging su uno stereomicroscopio chiaro, con un relativamente semplice set-up. Questa procedura richiede alcuni aspetti importanti che abbiamo testato, che ottimizzano il risultato: 1) Basse concentrazioni agarosio (~ 0,5%) ridurrà al minimo gli ostacoli di crescita della continua crescita zebrafish larvale, 2) Rimozione del agarosio intorno alla pinna è importante non oscurare il processo di guarigione, 3) Trapping l&#39;agarosio in una maglia di plastica mantiene l&#39;agarosio e animale in una posizione stabile durante la procedura, e 4) un ambiente a temperatura controllata corretta, che è essenziale per la vitalità delle larve. Abbiamo adattato una camera riscaldata incubazione 23,24, che utilizza involucro di bolla che viene registrato sul cartoncino, e un riscaldatore cupola cablata per controllare la temperatura e la corretta circolazione dell&#39;aria con fluttuazioni minime durante laprocedura di imaging. Questa camera semplice e conveniente può essere preparato per adattarsi a qualsiasi microscopio. Un simile camera di incubazione riscaldata è stato anche utilizzato per i topi di imaging e sviluppo pulcino 24,29. Suggeriamo che le larve pre-amputato sono montati per un&#39;immagine pre-amputazione, smontati per amputazione, e rimontati per l&#39;imaging time-lapse. Anche se è fattibile per eseguire queste operazioni in un unico passo nella camera di imaging finale, nella nostra esperienza abbiamo scoperto che amputare la pinna di coda su un vetrino di vetro non è ottimale, in quanto si strappa il tessuto e non comporta un taglio netto. Il metodo di amputazione basato agarosio-usando un ago della siringa è stato originariamente descritto da Kawakami e colleghi (2004) 16, ed è anche, nella nostra esperienza, ideale per eseguire le amputazioni. Così, la serie piuttosto complessa di passaggi che abbiamo presentato è ben giustificata e garantisce un risultato ottimale rigenerazione. Abbiamo dimostrato che larval zebrafish a 2 dpf può essere ripreso fino a 1,5 giorni in agarosio e soluzione Tricaine. Abbiamo usato pH della soluzione ottimizzata Tricaine (pH7) preparato con sale Instant Ocean, che non interferisce con la salute delle provino per il periodo di imaging presentato. Abbiamo precedentemente però anche dimostrato che l&#39;uso di Tricaine in Danieau medio permette time-lapse imaging di 2,5 dpf zebrafish larvale su un microscopio confocale per almeno 2 giorni 30. Pertanto, le condizioni ottimali tampone possono estendere salute larvale e la lunghezza di imaging. In alternativa, le concentrazioni tricaine inferiori possono essere utilizzati per l&#39;anestesia, o 2-fenossietanolo, che abbiamo trovato è ben tollerata durante stadi larvali e adulti a 28 ° C per almeno 60 ore. Per evitare difetti di rigenerazione pinna, abbiamo rimosso il agarosio dalla pinna caudale prima di imaging. Nostri dati mostrano che entro 1,5 giorni pinna ha rigenerato a circa il 60%. Questo tasso di rigenerazione è coerente con uno studio precedente che definisce 3 giorni as un tempo medio per la rigenerazione pinna caudale in larve di zebrafish fino a 6 dpf 16. Metodi alternativi per agarosio potrebbero comunque essere utilizzate per montare il pesce per imaging. Ad esempio, il plasma sottile coagula 31 o fluorurati etilene propilene (FEP) tubi rivestiti di metilcellulosa e riempiti di concentrazioni molto basse agarosio (0,1%) sono stati raccomandati per foglio microscopia ottica 32 e può essere adatto per il nostro metodo presentato. Tuttavia, non è consigliabile metilcellulosa e 0,1% agarosio, in quanto richiedono che i campioni sono montati nella parte inferiore della camera a causa della mancanza di solidificazione di questi mezzi. Molto alte concentrazioni di metilcellulosa saranno inoltre generare bolle d&#39;aria sulla base della nostra esperienza, e questi possono interferire con la procedura di imaging. Se questi mezzi sono preferiti con utilizzando la camera inferiore, è importante che un&#39;opportuna distanza di lavoro tra la lente obiettivo e il campione è presente. Va notato che metilcellulosa come mezzo di montaggio è consigliato solo per un massimo di 1 giorno, in quanto potrebbe interferire con la salute larvale 32. Montaggio il campione del coperchio può provocare una lenta deriva gravitazionale verso il basso. Si raccomanda pertanto di immagine più sezioni in ogni tempo, che può essere proiettata in un unico piano o solo immagini che si trovano nel piano focale può essere estratto per il montaggio del filmato finale. Imaging il campione alla camera inferiore potrebbe essere un metodo alternativo per evitare potenziali deriva verso il basso. Coaguli plasma potrebbero essere utili al fine di evitare la deriva, come il plasma si attacchi allo strato avvolgente esterna (EVL, periderm) 31 e, pertanto, possono stabilizzare i campioni. Questo però deve essere testato, così come per quanto tempo zebrafish larvale può essere mantenuta in grumi plasma senza interferire con la salute delle larve o la rigenerazione della pinna. Il nostro film è stato assemblato utilizzando singole sezioni (26 micron)di z-stack registrata, che copriva l&#39;intero spessore della pinna (~ 10 micron) e che rappresenta il potenziale z-drift della pinna durante la procedura di imaging. Al fine di conservare le informazioni 3-D, è anche possibile proiettare z-stack in immagini singole. Poiché questo può causare sfocatura dell&#39;immagine, campo chiaro deconvoluzione può desiderare. Software, come Deconvolve o X3 Autoquant potrebbe essere utilizzato per questo scopo. In alternativa, algoritmi matematici (descritti in Tadrous 33) possono essere applicati per ottenere una funzione point-diffusione di alto rapporto segnale-rumore (SNR). Ottenere un elevato SNR rappresenta uno dei principali ostacoli nel campo chiaro deconvoluzione. Anche se questo metodo richiede un elevato contrasto e spessore del campione sottile, sarebbe opportuno per l&#39;imaging della pinna caudale causa della sua larghezza ridotta. Un chiaro vantaggio del metodo di imaging presentato è che è rapidamente adattabile a qualsiasi stereomicroscopio dotato di una telecamera CCDd software time-lapse e offre un basso costo un&#39;alternativa ai sistemi di imaging confocale più costosi. Mentre questo metodo non utilizza fluorescenza per il rilevamento delle cellule, può essere esteso per tali applicazioni utilizzando un sistema automatico per il controllo dell&#39;otturatore e post-immagini software deconvoluzione 34. Ciò consentirebbe agli utenti di osservare ulteriormente i processi di riparazione e rigenerazione della ferita con singola cella o risoluzione subcellulare su periodi di tempo più lunghi. La chiarezza ottica e la facilità con cui embrionale e larvale zebrafish possono essere gestiti, e l&#39;adattabilità di questo metodo per qualsiasi stereomicroscopio lo rende adatto per l&#39;insegnamento della biologia dei vertebrati di base in classe. Questo metodo può fornire agli studenti una migliore comprensione dei processi biologici fondamentali sottostanti riparazione dei tessuti e la rigenerazione. Altri processi biologici che sono stati catturati con un metodo simile sono zebrafish sviluppo embrionale 23,34 e cardiacafunzione (inedito). Questo metodo offre anche la possibilità per la riparazione e rigenerazione monitoraggio della ferita in larve geneticamente e farmacologicamente manipolato.

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bullseye Agarose</td><td>MidSci</td><td>BE-GCA500</td><td></td></tr><tr><td>Low-melt agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1360-100</td><td></td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Aquarium Salt</td><td>Pet store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue (0.1% solution)</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10505</td><td></td></tr><tr><td>2-Phenoxyethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 35 x 15 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 x 15 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 100 x 25 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351013</td><td></td></tr><tr><td>5.75 inch boroschillate glass pipets</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (Glass: 0.085-0.115mm)</td><td>MatTek Corporation</td><td>D35-20-0-TOP</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus microscope slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>72191-75</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-18R15</td><td></td></tr><tr><td>Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48&quot;</td><td>Home Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips 20 &amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharply Angled Up</td><td>Fine Science Tools</td><td>14037-10</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Luer-Lok&amp;trade; disposable syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Luer-Lok&amp;trade; disposable syringe</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>23 G syringe needles</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LabDoctor Mini Dry Bath</td><td>MidSci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Discovery.V12 compound microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo S 3.5X objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

La tecnica presentato è adatto per chiarire dinamiche riparazione tissutale in risposta all&#39;amputazione. Il film dimostra che amputazione della pinna innesca inizialmente un effetto a borsa di caratterizzata da contrazioni tramite cavi actina-miosina presenti nella pinna volte 28 (Figura 5 A, B). Contemporaneamente, le cellule vengono estrusi dalla ferita (vedi filmato). La contrazione può quindi essere un mezzo per espellere cellule che sono probabilmente destinati a subire morte cellulare. I nostri risultati dimostrano inoltre che la crescita dello sviluppo della larva si verifica indipendentemente rigenerazione (film), mentre la rigenerazione pinna non avvia fino a circa 14 ore dopo l&#39;amputazione, misurata in base alla lunghezza della pinna e l&#39;area nel corso tempo di 36 ore dopo l&#39;amputazione (Figura 5C , D). La crescita fin rigenerativa totale dopo 1,5 giorni è stato circa il 60% della lunghezza della pinna originale (Figura 5E). Presi insieme, questi risultati dimostrano che l&#39;amputazione tr<html> Iggers contrazione pinna, estrusione di cellule dalla ferita, e una risposta rigenerativa temporalmente ritardata. Mentre le cellule estrusi sono probabilmente destinate a subire la morte delle cellule, la natura di queste cellule deve essere ulteriormente chiarita. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig1.jpg" /> Figura 1. Imaging gruppo anello di camera (A) si riporta un anello di plastica che è collegato a un coprioggetto con grasso al silicone. Una maglia di plastica è attaccato all&#39;interno della camera con quattro piccoli punti di grasso al silicone. (B) La camera contenente la larva montato è riempito con una soluzione Tricaine e un vetrino è attaccato alla parte superiore. (C) Un sospesa 2 giorni di età larva (freccia) è mostrato un ingrandimento maggiore per descrivere la sua dimensione in relazione alla mesh.&quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig2.jpg" /> Figura 2. Camera Imaging montaggio fatto da piastre di Petri. (A) si riporta un bicchiere top bottom capsula di Petri di vetro commerciale con una rete di plastica attaccato al coprioggetto di vetro. (B) mostrato è un piatto Petri camera di auto-costruito con un foro nel coperchio e un coprioggetto attaccato dall&#39;esterno con grasso siliconico. La rete e la larva sono montati all&#39;interno della camera contenente soluzione Tricaine. Per sigillare la camera, grasso siliconico è applicato alla tomaia, bordo esterno della camera di fondo e il coperchio superiore fissato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig2large.jpg" target="_blank">Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.654 / 52654fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Schema di amputazione e il montaggio di una larva per l&#39;imaging. (A) per amputazione, posizionare un larva anestetizzato su un piatto Petri agarosio rivestite e amputare la pinna di coda con un ago della siringa. (B) Per il montaggio, trasferire la larva con una pipetta di trasferimento in una provetta da 1,5 ml riempito con 42 ° C agarosio liquido e pipetta una goccia contenente la larva nella camera di imaging, orientare il pesce e coprire il solidificato agarosio con media embrione. (C) Raschiare il agarosio dalla pinna caudale con una microloader pipetta punta ridotta o un attrezzo simile e sostituirlo media embrione con terreno fresco. (D) Immagine pinna caudale allo stereomicroscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 4. Self-costruito camera di incubazione riscaldata. (AC) si riporta una camera di incubazione riscaldata in cartone, pluriball e velcro. Un riscaldatore cupola cablata (originariamente progettato per uova di gallina incubazione) è collegato alla camera con del nastro di alluminio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig5.jpg" /> Figura 5. dinamiche di rigenerazione Fin. (A) Schema del metodo amputazione analisi e quantificazione pinna caudale utilizzato per determinare la lunghezza della pinna (freccia rossa) e l&#39;area (contorno rosso della pinna). (B) Tail amputazione fin innesca inizialmente contrazione della pinna, seguito da Regeescrescenza tessuti nerative. La pinna subisce anche la crescita dello sviluppo, come dimostra l&#39;aumento delle dimensioni laterali. (C) è riportata la pinna di lunghezza in funzione del tempo, rivelando una partenza crescita rigenerativa lineare a ~ 14 hpa. (D) Quantificazione dell&#39;area fin rivela un inizialmente diminuire in dimensioni, che può essere attribuito alla contrazione della pinna. Dopo ~ 14 ore, gli aumenti pinna dimensioni a una velocità lineare. (E) Il confronto della lunghezza pinna prima amputazione e dopo 36 ore mostra ~ 60% ricrescita. Scala bar: 100 micron Abbreviazioni: pre-amp, pre-amputazione; ore dopo l&#39;amputazione, hpa; rigenerazione, rigenerazione; amp, amputazione <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/movie1.mp4">Movie</a> . Fin rigenerazione nel corso del tempo 36hr. Mostrato è una pinna coda di un 2,5 giorni vecchia larva nel corso della rigenerazione. Avvio di 30 min dopo l&#39;amputazione crescita rigenerativa è ripreso in 30 min intervalli su uno stereomicroscopio utilizzando una lente obiettivo 3.5x.

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Views.  MDI Biological Laboratory. We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

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Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Visualizzare il Tissue interrenale Steroidogenic e la sua Vascolare Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biologia

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage where they execute crucial antimicrobial functions. Their trafficking to these loci is orchestrated by several inflammatory chemoattractants, including chemokines. At the molecular level, chemoattractant signaling is regulated by the intracellular trafficking of the corresponding receptors. However, it remains unclear how subcellular changes in chemokine receptors affect leukocyte migration dynamics at the cell and tissue level. Here we describe a methodology for live imaging and quantitative analysis of chemokine receptor dynamics in neutrophils during inflammatory responses to tissue damage. These tools have revealed that differential chemokine receptor trafficking in zebrafish neutrophils coordinates neutrophil clustering and dispersal at sites of tissue damage. This has implications for our understanding of how inflammatory responses are self-resolved. The described tools could be used to understand neutrophil migration patterns in a variety of physiological and pathological settings and the methodology could be expanded to other signaling receptors.

Here we describe protocols to perform live imaging and quantitative analysis of chemoattractant receptor dynamics in zebrafish neutrophils

Imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili zebrafish durante le risposte alle ferite

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Immunologia e infezioni

Analisi della contrazione cardiaca del pesce zebra con l'interazione della realtà virtuale

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

Autore in primo piano: Imaging 4D Light-Sheet ad alta risoluzione e realtà virtuale in zebrafish per l'analisi di singole cellule della funzione cardiaca

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

Visualizzare il Tissue interrenale Steroidogenic e la sua Vascolare Microenvironment in Zebrafish

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili zebrafish durante le risposte alle ferite

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra