Nuestro protocolo nos permite estudiar cómo los tejidos, como el músculo esquelético, regulan su tamaño, que sigue siendo una cuestión clave en la biología celular y del desarrollo con importantes implicaciones fisiológicas y médicas. La principal ventaja de nuestra técnica es que el crecimiento celular se puede observar y medir en animales vivos in vivo con un alto grado de precisión espacial y temporal. El progreso en la comprensión básica del crecimiento muscular temprano puede resaltar los orígenes del desarrollo de los problemas musculares tempranos y conducir al descubrimiento de Novo Therapeutics para proteger contra la pérdida muscular en ancianos y pacientes con trastornos de desgaste muscular.
Prepare 1% LMA en un tubo de 1.5 mililitros y manténgalo en un bloque de calor de 37 grados centígrados para uso repetido. Seleccione los peces que se montarán y anestesie transitoriamente a cada pez. Para evitar el choque térmico, retire la alícuota LMA del bloque de calor y deje que se enfríe justo por encima de la configuración.
Tome una placa de Petri de 60 mililitros que haya sido recubierta con una capa de 1% de LMA y colóquela en el escenario de un microscopio de disección. Transfiera la larva con una pipeta Pasteur de plástico de un mililitro a una placa de Petri recubierta de 60 milímetros y retire la mayor cantidad posible de medio transferido. Luego, todavía usando la pipeta Pasteur, coloque unas gotas de LMA sobre el pez y oriente rápidamente la larva cerca de la superficie superior de la LMA con sus ejes anteroposterior y dorsoventral dentro de los 10 grados de la horizontal, usando fórceps o una aguja de vidrio fino pulida al fuego antes de que la LMA se asiente.
Alternativamente, utilice una pipeta Pasteur de plástico de un mililitro. Recoger las larvas con un mínimo de medio de pescado y transferir las larvas a la alícuota de LMA enfriada. Deje que la larva se hunda durante cinco segundos para quedar completamente rodeada por LMA.
Luego recupere la larva y transfiérala en una gota de LMA a la placa de Petri recubierta de agarosa. Coloque rápidamente la larva como se demostró anteriormente. Si las larvas no están correctamente montadas horizontalmente cerca de la superficie de la gota de agarosa, retire y vuelva a incrustar, las larvas se pueden recuperar fácilmente mediante una succión suave con una pipeta Pasteur de plástico de un mililitro y la LMA se puede eliminar suavemente con toallitas químicas.
Espere unos 10 minutos hasta que se establezca LMA. Inunde el plato con alrededor de 10 mililitros de medio de pescado que contenga tricaína. Para capturar pilas confocales, deje que los peces montados descansen durante al menos 10 minutos antes de escanear, ya que se produce la hinchazón de agarosa.
Cargue el plato de muestra en la etapa del sistema confocal. Localiza las larvas y concéntrate en el somite deseado. Se puede elegir Somite 17 debido a su facilidad de localización cerca del respiradero anal y facilidad de obtención de imágenes.
Verifique contando somitas desde el anterior. Para capturar imágenes YZ, configúrelas como si fuera a capturar una pila Z. Comience definiendo los puntos superior e inferior de los peces.
Tanto el lado izquierdo como el derecho se pueden capturar como se desee, asegurando que todos los escaneos rápidos de YZ capturen las regiones deseadas. Oriente el área de escaneo para los peces según lo permita el software confocal. Coloque el pez con el eje anteroposterior, paralelo al eje dex de la imagen y el eje dorsoventral paralelo al eje Y con somita 17 en el centro del campo.
Concéntrese en un plano de nivel medio en el miotomo superior, en el que todas las mitades de somite epaxial e hipaxial, junto con los mioseptos verticales y horizontales son visibles y capturan una imagen XY de alta resolución. Asigne un nombre al archivo y guarde la imagen. Para capturar las imágenes de YZ, dibuje una línea dorsal a ventral precisa a través del somita elegido, perpendicular al eje anteroposterior del pez.
Agregue una posición anteroposterior seleccionada y, a continuación, realice un escaneo de línea de pila Z. Repita la exploración de la línea YZ tres veces en posiciones anteroposteriores definidas a lo largo del miotomo seleccionado para capturar YZA, YZM e YZP. Asigne un nombre a estas imágenes y guárdelas con la imagen XY relacionada.
Este protocolo se ha denominado como el método de cuatro cortes y las imágenes se pueden analizar utilizando el software Zen o ImageJ. Para crear una cámara de estimulación, tome una placa de pocillo de seis por 35 milímetros y cree dos aberturas pequeñas de menos de cinco milímetros de diámetro, separadas por un centímetro a cada lado de cada pocillo con un soldador estrecho. Una vez creada, la cámara de estimulación puede ser reutilizada.
Enhebra un par de alambres de plata o platino a través de las aberturas de cada pozo. El material adhesivo reutilizable se puede aplicar cerca de las aberturas para mantener los cables en su lugar y garantizar una separación de un centímetro entre los cables. A los tres días después de la fertilización, divida los peces en tres condiciones, medio de control de peces, inactivo e inactivo más tallo.
Para grupos inactivos e inactivos más tallo, anestesiar las larvas a las 72 horas después de la fertilización con tricaína 0.6 milimolar. Para los peces de control medio, déjelos sin anestesia. Preparar 60 mililitros de agarosa al 2% en pescado medio.
Derrítelo bien usando un microondas y deja que se enfríe. Luego agregue tricaína y vierta al menos cuatro mililitros en cada pocillo de la cámara de estimulación. Agregue inmediatamente peines de cuatro pocillos hechos a medida entre los electrodos.
Espere 10 minutos para que el gel se asiente. Retire los peines con cuidado para crear cuatro pozos rectangulares. Llenar cada pocillo con agua tricaína y colocar una sola larva anestesiada, inactiva más tallo en cada pocillo utilizando una micropipeta, con su acceso anteroposterior perpendicular a los electrodos.
Verifique bajo el microscopio fluorescente de disección si cada pez está completamente anestesiado dentro de cada pozo de cámara. Conecte un estimulador electrofisiológico ajustable generador de patrones a la cámara a través de un controlador de polaridad, utilizando clips de cocodrilo conectados a cada electrodo en un lado de la cámara. Luego estimule a los peces como se describe en el texto manuscrito.
Verifique regularmente bajo el microscopio para confirmar que los peces están siendo estimulados. El estímulo eléctrico debe inducir una contracción bilateral visible y un ligero movimiento una vez cada cinco segundos siguiendo los parámetros descritos. Después de la estimulación, retire cuidadosamente los peces de cada pocillo enjuagándolos suavemente con una pipeta de plástico y devuélvalos a la incubadora en un medio de pescado fresco que contenga tricaína.
Vierta el agua tricaína desde dentro de la cámara y use fórceps para cortar y eliminar la agarosa de cada pozo, enjuague los pozos con agua del grifo y deje que se sequen. Para el análisis del tamaño muscular, denominado método de cuatro cortes, se obtuvieron imágenes XY e YZ del músculo larvario del pez cebra y se calculó el volumen de somita. Se observó una fuerte correlación entre los métodos de cuatro cortes y pila completa, aunque el método de cuatro cortes dio una estimación de volumen ligeramente mayor.
El análisis volumétrico de los miotomos adyacentes de los somitas 16 y 18 reveló que cada somita era aproximadamente un 7% más grande que la que estaba detrás. Investigaciones posteriores revelaron que un método de dos cortes, que requería solo una medición YZ, proporcionaba una estimación razonablemente precisa del volumen del miotoma. El miotomo creció detectablemente en longitud y el área transversal entre dos y cinco días después de la fertilización, lo que llevó a un aumento constante en el volumen.
El músculo inactivo por el anestésico tricaína entre el tercer y cuarto día después de la fertilización había reducido significativamente el volumen, lo que indica que el crecimiento muscular larvario dependía de la actividad. Se observó una mayor variación en la reducción del tamaño del miotoma al medir el volumen del miotoma a los cuatro días después de la fertilización, en comparación con la medición de cada pez individual a los tres y cuatro días después de la fertilización. No obstante, no se observaron diferencias significativas en el volumen del miotoma entre ninguno de los métodos de medición del miotoma.
La medición del número de fibras dentro del miotomo, así como el volumen promedio de fibra, reveló que la actividad controla ambos aspectos celulares del crecimiento. Asegúrese de que las larvas estén completamente anestesiadas con tricaína recién preparada. La anestesia parcial conduciría a un resultado variable.
Como sabemos, las larvas responden más vigorosamente a la estimulación eléctrica. Este método, combinado con transcriptómica posterior y experimentos farmacológicos, ha revelado nuevos conocimientos sobre cómo la detección de fuerza impulsa el crecimiento en el músculo esquelético.
