We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense &#8211; USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.

Peixe-zebra (nácar cepa) foram nascidos e criados de acordo com os protocolos estabelecidos. Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento, usando tricaina 0,4 mM para anestesia e tricaina 1 mM para a eutanásia. Embriões de peixes-zebra e larvas foram tratadas em estrita conformidade com as boas práticas de animais, tal como aprovado pela comissão competente (Laboratório Biológico MDI animais núcleo número IACUC 13-20). Este estudo foi aprovado pelo Instituto de Pesquisa do Genoma Humano Animal Care e Use Comitê Nacional, MDIBL Institucional Assurance # A-3562-01 sob o protocolo nº 14-09. Nota: O procedimento de imagiologia que capta a regeneração da barbatana no peixe-zebra larval é resumido nas seguintes etapas: 1. Criação de peixe-zebra para estágios larvais <ol><li> Recolher os ovos e coloque cerca de 50 ovos em um prato 100 x 25 mm Petri contendo 0,03% de sal Instant Ocean em água deionizada suplementado com 0,00004% de azul de metileno. Incubar O / N em uma incubadora de 28,5 ° C. </li> &lt;li&gt; Na manhã seguinte, retire os embriões mortos com uma pipeta de vidro e lave os ovos em uma peneira com 0,03% de sal Instant Ocean em água deionizada (médio embrião denominado). Nota: Média de Ringer como 18, 18 de Hanks, 19 E2, E3 20, e Danieau 21 pode ser preferido. </li><li> sup&gt; Adicionar meio embriões frescos para o prato. Se utilizando estirpes pigmentadas, adicionar opcionalmente 0,2 mM de 1-fenil-2-tioureia (PTU), como propiltiouracil irá impedir a melanogénese e, assim, a pigmentação das larvas. Deixe os embriões desenvolver na incubadora até a fertilização dois dias post ou qualquer outra fase larval desejado. </li></ol> 2. Preparação da câmara de imagem <ol><li> Método 1: câmaras de imagem feitos de PVC ou tubagem de Teflon (Figura 1) Nota: Este método é semelhante ao Concha e Adams (1998) 22. <ol><li> Adquirir plástico grau de água potável ou tubo Teflon de uma loja de hardware com um 25 milímetros um exteriorDA 20 mm de diâmetro interior. Cortar o tubo para fazer anéis de aproximadamente 10 mm de espessura, com uma superfície uniforme de cada lado. Use&gt; 200 lixa para suavizar as bordas. </li><li> Limpe os anéis com água morna e 70% de etanol e deixe-os secar ao ar. </li><li> Com uma ponta de pipeta, aplique graxa de silicone para a metade de um anel e anexar o anel para a 75 milímetros x 25 mm deslizamento tampa de vidro. Como alternativa, use uma seringa de 3 ml preenchido com graxa de silicone em vez de uma ponteira. Nota: Porque é difícil de inserir a massa de silicone para dentro da seringa de 3 ml, adicionar a gordura de silicone para uma seringa de 30 ml primeiro e usar esta para encher a seringa de 3 ml. </li></ol></li><li> Método 2: Preparação de uma placa de Petri como uma câmara de imagem. <ol><li> Adquirir 35 ou 60 mm de diâmetro de placas de Petri com uma lamela de vidro fixada na tampa (Figura 2A). Em alternativa, como mostrado na Figura 3 de Distel &amp; Koester (2007) 23, perfurar uma abertura suficientemente pequeno para huma lamela de idade na tampa de uma pequena placa de Petri e aplicar gordura de silicone para o exterior com uma seringa de 3 ml. Utilizando uma ponta de pipeta limpa, cuidadosamente anexar uma forma redonda ou quadrada lamela da espessura desejada para o exterior (Figura 2B). </li></ol></li><li> Para garantir que a agarose sendo usado para a montagem mantém firmemente ligado durante o procedimento de imagem, coloque uma malha de plástico fino dentro do ringue. Em primeiro lugar, cortar a malha feita de tela de janela obtidos a partir de uma loja de hardware, no tamanho do diâmetro do anel interior, utilizando uma tesoura fina com um ângulo. Em seguida, corte um pequeno rectângulo&gt; duas vezes o tamanho da larva para o meio da malha (Figura 1, 2). </li><li> Aplicar quatro pequenos pontos de gordura de silicone não-tóxico para a interface entre a cobertura de vidro e o anel de câmara (Figura 1A). </li><li> Use uma pinça para ligar a malha firmemente a parte inferior da lamela de vidro. </li></ol> 3. Montagem e imagem do Pré-injured Larva (este passo é opcional) Nota: Esta etapa é apropriado para comparações entre o comprimento da nadadeira amputada e regenerado, como o plano de amputação após a regeneração fin não é reconhecível em larvas do peixe. <ol><li> Prepara-se uma solução de agarose a 0,5-1,2% de baixo ponto de fusão em forma embrião para a imobilização do espécime. </li><li> Aquecer a agarose, num forno de microondas e transferir o líquido de agarose em tubos de 1,5 ml que são pré-aquecidas a 42 ° C num bloco de aquecimento. </li><li> Deixe a agarose quente arrefecer para 42 ° C, que pode ser mantida ao longo de várias semanas a esta temperatura. Tente evitar a pipetagem as larvas em agarose acima de 42 ° C, pois isso será prejudicial para os animais. </li><li> Anestesiar várias larvas usando 10 ml de tricaina 0,4 mM (pH 7) em forma de embriões em uma placa de Petri de diâmetro de 60 mm. Prepare o tricaina de acordo com as Receitas Livro Zebrafish 18. <ol><li> Em alternativa, utilizar 10 ml de uma diluição de 1: 1000 99% 2-fenoxietanol em uma placa de Petri de diâmetro de 60 mm. Pique as larvas com uma ponta microloader pipeta tampada, para avaliar a sua resposta ao toque antes de prosseguir. Use apenas larvas não-responsivos. </li></ol></li><li> Transferir uma larva na solução de agarose a 42 ° C utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro. Não transferir o líquido excessivo no agarose, caso contrário, a agarose será muito diluída e não solidificar. </li><li> Descartar o líquido restante a pipeta de transferência e a larva com uma gota de agarose numa pequena placa de Petri (35 ou 60 mm de diâmetro). Posicione a larva em seu lado para geração de imagens da barbatana caudal. </li><li> Permitir que a agarose solidificar. Avaliar a agarose com uma ponta de pipeta de plástico; a ponta vai mergulhar no agarose, se for muito líquido. Uma vez que a agarose solidificou, um pequeno recuo será visível ao tocar com a ponta da pipeta. Após a solidificação, adicionar solução tricaina e siga para o microscópio estereoscópico que será usada mais tarde para geração de imagens de lapso de tempo. <li> Use um microscópio estereoscópico com software time-lapse. Selecione um objectivo adequado e ampliação, que será utilizado mais tarde para imagens de lapso de tempo. Aqui, use um 3,5 x 16 milímetros, objectiva de distância trabalhando em um microscópio estereoscópico. Como desejado, utilizar microscópios alternativos e lentes objetivas, mas escolher uma ampliação adequada para explicar potencial xy-drift e crescimento da barbatana durante o procedimento de imagem. </li><li> Escolha do modo de detecção de câmara no microscópio. </li><li> No software, selecione o modo &quot;ao vivo&quot; para visualizar a larva na tela. </li><li> Abra a janela &quot;Propriedades&quot; para detectar automaticamente o brilho. </li><li> Ajustar manualmente o contraste ao microscópio base de trans-iluminação. </li><li> Mova a larva para fora do campo de visão e selecione o recurso Correção Shading para minimizar fundo nãoise. </li><li> Posicione a larva de volta para o campo de visão e tirar uma foto. Salve a imagem. </li><li> Retire a agarose da larva pela primeira raspando a agarose fora da cabeça. Desta forma, a larva pode ser deslizado para fora da agarose, puxando levemente a cabeça longe do restante agarose com uma ponta microloader pipeta tampado ou um pino de insetos. </li><li> Com uma pipeta de Pasteur de vidro transferir a larva em solução tricaina fresco. </li></ol> 4. Amputação Assay <ol><li> Prepare uma solução de agarose a 1,5%, utilizando meio de embrião e despeje uma camada fina em uma placa de Petri. Deixe o agarose solidificar. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, coloque o sideward larva para a agarose solidificada e amputar a nadadeira caudal com uma agulha de seringa de 23 G com uma ligeira pressão (Figura 3A). </li></ol> 5. Montagem da Larva para tempo-lapso <ol><li> Proceder como descrito nos passos 3,1-3,5 (Figura 3B). </li><li&gt; Transferir uma gota de 0,5-1,2% de agarose líquido a 42 ° C contendo a larva no anel câmara de imagem (passo 2.1), orientar a larva e deixar solidificar a agarose. Encha o anel com solução tricaina. Alternativamente, se a câmara de caixa de Petri (passo 2.2), é utilizada, para montar a larva da lamela tampa e preencher a tampa com solução tricaina. </li><li> Para permitir a cicatrização adequada ou regeneração de tecidos a ocorrer, com cuidado raspar a agarose em torno da barbatana caudal distal utilizando uma ponta microloader pipeta tampado ou um pino de insetos. Tente não ferir o fin repetidamente (Figura 3C). </li><li> Decantar a solução tricaina contendo o removido agarose e preencher o anel de câmara com solução tricaina fresco. </li><li> Aplique graxa de silicone para o topo do anel de câmara e anexar com 75 mm x 25 mm lâmina de vidro. Tentar evitar bolsas de ar na câmara, à medida que vão interferir com as imagens de campo claro e desidratar a larva ao longo do tempo. </li><li> Se estiver usando uma placa de Petri comouma câmara de imagem, aplique graxa de silicone para a borda superior da câmara de fundo e encher a câmara inferior com solução tricaina. Decantar cuidadosamente a solução tricaina na tampa e gire a tampa sobre a mergulhar a larva na solução tricaina da câmara de fundo em um pequeno ângulo para evitar bolhas de ar. A câmara será selado devido à graxa de silicone. </li></ol> 6. tempo-lapso <ol><li> Montar uma câmara de incubação aquecida como descrito no 23,24 (Figura 4) .Colocar a câmara de incubação em torno do microscópio e ligar o aquecimento. Ajustar a temperatura para 28 ° C durante cerca de 10 - 20 minutos ou até que a temperatura tenha estabilizado. </li><li> Abra a parte frontal da câmara de incubação aquecida e colocar a câmara de imagem no suporte da lamela de microscópio com voltada para cima no sentido do objectivo. </li><li> Posicionar o fin de larvas de uma maneira que 2/3 do campo de visão permanece desocupado. Isto assegura a captura docrescimento e regeneração da barbatana ao longo do procedimento de imagiologia, sem ter de reposicionar a larva. <ol><li> Ajustar a larva montada a 28 ° C durante ~ 30 min antes de se iniciar a gravação de lapso de tempo para evitar mudanças na intensidade de campo claro ou potenciais alterações de agarose. Em alternativa, utilizar tampão pré-aquecido para começar imagem após curto tempo de ajuste. </li></ol></li><li> Para configurar a gravação de lapso de tempo, abra a janela 6D Multidimensional Aquisição no software Axiovision e selecione a opção z-stack e time-lapse. </li><li> Opcional) Na guia z-stack e Modo Slice, selecione a espessura de corte e, em seguida, selecione o modo de Start / Stop. </li><li> Definir a posição superior e inferior da pilha. </li><li> Na guia de lapso de tempo, selecione o intervalo e a duração do filme e, em seguida, iniciar o filme pressionando o botão de partida. Descobrimos que a intervalos de 30 minutos são suficientes e neste intervalo não gera dados excessiva; no entanto Shortepode ser utilizado o intervalo r. </li><li> Verificar as dimensões de posição e z-stack durante a primeira hora, se a larva não foi pré-ajustado. Se necessário, reposicionar a larva de novo depois de um dia, como a larva pode ter deslocado. </li><li> Salve o arquivo no final da gravação de lapso de tempo e continuar com o pós-processamento e quantificações usando software de análise de imagem disponíveis, tais como Imaris 25 ou o open source pacotes de software Imagem J 26 e 27 de Fiji. </li></ol> Análise 7. Dados <ol><li> A determinação do comprimento da aleta. <ol><li> Abra o filme de lapso de tempo no software de imagem e salvar os arquivos no formato de arquivo proprietário para melhorar o desempenho do software. </li><li> Selecione a vista ortogonal para exibir seções individuais como pilhas projetadas. Para a correção de deriva, sob o menu de Fiji, selecione Plugins, em seguida, Registro, e &#39;deriva 3D correcta&#39;. Isto irá abrir uma janela de Fiji e realizar as correções de deriva. Corretodesvio rotacional no Spots função Imaris. Como alternativa, instalar os plugins StackReg e TurboReg em Imagem J e importar para Fiji. Escolha o algoritmo de transformação desejada no plugin StackReg. </li><li> Para medir distâncias (por exemplo, diâmetro da ferida ou comprimento fin), selecione a opção &quot;adicionar novos pontos de medição&quot; na barra de ferramentas superior esquerdo. <ol><li> Em &#39;lista Configurar de Estatísticas visíveis Valores &quot;no menu inferior esquerdo, selecione os valores de estatística a ser exibido. </li><li> No &quot;Modo de linha &#39;, na guia configurações, selecione&#39; Pairs (AB, CD ...) &#39;. </li><li> Em &#39;Labels Propriedades&#39; selecionar &#39;Name&#39; e &#39;Distância&#39;, para exibir a distância entre os pontos A e B ao lado da linha de medição. </li><li> Alternar para o modo &quot;Editar&quot; e mantenha pressionada a tecla Shift para selecionar o primeiro ponto no final da notocorda. Em seguida, use a mesma configuração para selecionar o segundo ponto na margem fin distal. </li><li> Na aba &quot;Estatísticas&quot;, selecione o botão de disco (Export All) no canto inferior direito para exibir e exportar a distância na imagem. </li><li> Repita as medições em momentos selecionados movendo o controle deslizante abaixo da imagem para a direita. Em vez de criar novos pontos de medição, os anteriores podem ser reposicionados selecionando primeiro o ponto com o botão esquerdo do mouse, em seguida, pressionando simultaneamente a mudança e com o botão esquerdo do mouse na nova posição. </li></ol></li><li> Em alternativa à opção de pontos de medição, utilizam o espectador fatia para medir distâncias. No modo de exibição fatia, vá até a posição desejada e clique na primeira e segunda posição com o botão esquerdo do mouse. A distância será exibida. Essa opção, entretanto, não permitem a exportação de dados. </li></ol></li><li> Determinando comprimento da nadadeira e área em ImageJ. <ol><li> Abra o filme de lapso de tempo em ImageJ usando um plugin que reconhece o formato de arquivo .zvi. Em alternativa, carregue em um Quarquivo ickTime ou seqüência tiff. Nota: Se estiver usando um formato de arquivo TIFF, as dimensões da imagem não precisa ser especificado. </li><li> Se abrir um formato de arquivo diferente, sem as informações do arquivo, selecione &#39;Definir Scale&#39; no menu &#39;Analisar&#39; para primeiro definir a distância e unidade de imagem. No &quot;Menu Scale&quot;, digite o &#39;Distância em pixels&#39;, abaixo do tipo na &quot;distância conhecida &#39;para o valor de pixel (isso pode ser obtido através da medição do número de pixels em uma barra de escala que foi acrescentado à imagem e clique em Medir para obter o resultado), e os &#39;Unidade de comprimento &quot;(tipicamente&#39; mm &#39;). Em seguida, clique em OK. </li><li> Para a medição da área fin selecione a ferramenta &#39;Seleção Freehand &quot;na barra de ferramentas e delinear a área fin, segurando o botão esquerdo do mouse pressionado enquanto desenha ao longo do contorno da barbatana. Para medições de comprimento da nadadeira, selecione a ferramenta &#39;Straight&#39; linha e desenhar uma linha entre os pontos desejados para sermedido. </li><li> Clique na opção &quot;Measure&quot; em &quot;Analisar&quot; para exibir a área e comprimento da nadadeira. Repita este passo quantas vezes for necessário para vários pontos no tempo do filme. </li></ol></li><li> Usando estatísticas software os dados podem ser apresentados graficamente. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture.">et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li><li>Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-2+controls+directional+chain+migration+of+cerebellar+granule+neurons.">Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons.</a> PLoS Biol. 7, e1000240 (2009).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. 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Os autores não têm nada a revelar.

O método apresentado permite observar a cicatrização e regeneração de tecidos em viver com larvas do peixe in vivo time-lapse de imagens em uma lupa estereoscópica brightfield, usando um relativamente simples set-up. Este procedimento requer alguns aspectos importantes que nós testamos, que irão otimizar o resultado: 1) as concentrações de agarose de baixo (~ 0,5%) irá minimizar os impedimentos de crescimento do contínuo crescimento do peixe-zebra larval, 2) A remoção do agarose em torno do fin é importante não a obscurecer o processo de cura, 3) Trapping a agarose numa malha de plástico mantém a agarose e animal numa posição estável durante o procedimento, e 4) Um ambiente de temperatura controlada adequada, o que é essencial para a viabilidade das larvas. Temos adaptado numa câmara aquecida incubação 23,24, que utiliza bolha que é gravado no cartão, e uma cúpula de aquecedor fios para controlar a temperatura e correcta circulação de ar com flutuações mínimas durante oprocedimento de imagem. Esta câmara simples e eficiente em termos de custo pode estar preparado para se adaptar a qualquer microscópio. A câmara de incubação aquecida semelhante foi também utilizado para ratos de imagem e desenvolvimento pintinho 24,29. Sugerimos que as larvas pré-amputado são montadas uma imagem de pré-amputação por, desmontado para a amputação, e remontado para geração de imagens de lapso de tempo. Embora seja possível para executar essas etapas em um único passo na câmara de imagem final, em nossa experiência, descobrimos que amputar a nadadeira da cauda em uma lamela de vidro não é o ideal, uma vez que rasga o tecido e não resulta em um corte limpo. O método baseia-amputação de agarose utilizando uma agulha de seringa foi originalmente descrito por Kawakami et al (2004) 16 e é também, na nossa experiência, ideal para executar as amputações. Assim, a série um pouco complicado de passos que apresentamos é bem justificada e garante um resultado regeneração ideal. Nós mostramos que LarVal zebrafish em 2 dpf pode ser trabalhada até 1,5 dias em agarose e solução tricaina. Nós solução optimizado-tricaina pH (pH 7), preparado com sal Instant Ocean, que não interfere com a saúde da amostra para o período de imagem apresentada utilizado. Anteriormente, no entanto, também demonstrou que o uso de tricaina em meio Danieau permite time-lapse de imagens de 2,5 dpf zebrafish larval em um microscópio confocal para pelo menos 2 dias 30. Assim, as condições óptimas de tampão pode estender saúde das larvas e a duração das imagens. Em alternativa, as concentrações mais baixas tricaina podem ser utilizados para anestesia, ou 2-fenoxietanol, o que foi bem tolerado durante as fases de larvas e de adultos, a 28 ° C durante pelo menos 60 horas. Para evitar defeitos de regeneração fin, nós removemos o agarose a partir da barbatana caudal antes da imagem. Os nossos dados indicam que no intervalo de 1,5 dias, a aleta tem regenerada até cerca de 60%. Esta taxa de regeneração é consistente com um estudo anterior que define 3 dias poré um tempo médio de regeneração barbatana caudal em larvas do peixe até 6 dpf 16. Métodos alternativos à agarose poderia, contudo, ser utilizados para montar o peixe para a imagem latente. Por exemplo, o plasma fina coagula 31 ou etileno propileno fluorado (FEP) com tubos revestidos de metilcelulose e encheram-se com concentrações muito baixas de agarose (0,1%) foram recomendadas para a microscopia de luz folha 32 e pode ser adequado para o nosso método apresentado. No entanto, não é recomendável metilcelulose e 0,1% de agarose, em que exigem que a amostra são montados na parte inferior da câmara, devido à falta de solidificação destes meios. Concentrações muito elevadas de metilcelulose, além disso, irá gerar bolsões de ar com base em nossa experiência, e estes podem interferir com o processo de criação de imagens. Se estes meios são os preferidos com a utilização da câmara inferior, é importante que uma distância de trabalho adequado entre a lente objetiva ea amostra está presente. Deve notar-se que metilcelulose como um meio de montagem é recomendada apenas para até 1 dia, pois pode interferir com a saúde larval 32. Montando o modelo na tampa pode resultar em um desvio gravitacional para baixo lento. Portanto, é recomendável a imagem várias seções em cada ponto de tempo, que pode ser projetada em um único avião ou apenas imagens que estão no plano focal pode ser extraído para a montagem do filme final. Imaging o espécime na câmara inferior poderia ser uma metodologia alternativa para evitar o potencial de deriva para baixo. Coágulos de plasma pode ser útil para evitar a deriva, como o plasma vai ficar com a camada envolvente exterior (EVL, periderme) 31 e, portanto, pode estabilizar o espécime. Este no entanto tem de ser testada, bem como o tempo de larvas de peixe-zebra pode ser mantida em coágulos de plasma sem interferir com a saúde das larvas ou a regeneração da barbatana. Nosso filme foi montado utilizando seções individuais (26 mm)de uma pilha de z-gravada, que cobria a totalidade da espessura da aleta (~ 10 mm) e que representava potencial z deriva da barbatana durante o procedimento de imagiologia. A fim de reter a informação em 3-D, é também possível projectar-z pilhas em imagens individuais. Porque isto pode resultar em desfocagem da imagem, desconvolução de campo claro podem ser desejada. Software, tais como deconvoluir ou X3 Autoquant poderia ser utilizado para este fim. Alternativamente, os algoritmos matemáticos (descritos em Tadrous 33) pode ser aplicado para a obtenção de um ponto de função propagação de elevada relação de sinal-para-ruído (SNR). A obtenção de um elevado SNR representa um dos principais obstáculos em campo claro de desconvolução. Embora este método requer alto contraste e espessura da amostra fina, que seria adequado para a imagiologia da barbatana da cauda, ​​devido à sua largura reduzida. Uma clara vantagem do método de imagem apresentada é que é rapidamente adaptável a qualquer um estereomicroscópio equipado com uma câmara CCDd software time-lapse e oferece uma alternativa de baixo custo para sistemas de imagem confocal mais caros. Embora este método não utiliza fluorescência para a detecção de células, ele pode ser estendido para tais aplicações, utilizando um sistema automatizado de controle do obturador e pós-imaging software deconvolution 34. Isso permitiria que os usuários observem ainda mais os processos de reparação de feridas e regeneração com única célula ou resolução subcelular durante períodos de tempo mais longos. A claridade óptica e facilidade com que embrionário e zebrafish larval pode ser tratada, e da capacidade de adaptação do método para qualquer microscópio estereoscópico o torna adequado para o ensino de biologia básica vertebrado em uma sala de aula. Este método pode proporcionar aos alunos uma melhor compreensão dos processos biológicos básicos subjacentes reparo e regeneração tecidual. Outros processos biológicos que foram capturados com um método semelhante são o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra 23,34 e cardíacafunction (não publicado). Este método também oferece a possibilidade de reparação de feridas e a regeneração de monitorização em larvas que foram geneticamente manipulados e farmacologicamente.

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48&#34; (Home Depot)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING&#174; HIGH VACUUM GREASE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips 20 &#181;l (Eppendorf, Cat. No. 930001007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe&#160;(BD, Cat. No. 309657)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Discovery.V12 compound microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Plan Apo S 3.5X objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

A técnica apresentada é adequada para elucidar dinâmica de reparação de tecidos, em resposta à amputação. O filme demonstra que a amputação da barbatana inicialmente desencadeia um efeito em bolsa, caracterizado por contracções por meio de cabos de actina-miosina que estão presentes na aleta 28 vezes (Figura 5 A, B). Concomitantemente, as células são extrudados da ferida (ver filme). A contracção pode assim constituir um meio para expulsar as células que são susceptíveis destinados a sofrer morte celular. Os nossos resultados mostram ainda que o crescimento de desenvolvimento da larva ocorre independentemente de regeneração (filme), enquanto a regeneração de aleta não iniciar até cerca de 14 horas após a amputação, conforme medido pelo comprimento da aleta e a área ao longo do tempo de 36 horas após a amputação (Figura 5C , D). O crescimento total de barbatana regenerativo após 1,5 dias foi de cerca de 60% ​​do comprimento da aleta original (Figura 5E). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que tr amputação<html> Iggers contracção barbatana, extrusão de células a partir da ferida, e uma resposta regenerativa temporalmente retardada. Enquanto as células são extrudidos provável destinado a passar por morte celular, a natureza destas células tem de ser clarificado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig1.jpg" /> Figura 1. Imagem conjunto do anel de câmara (A) é mostrado um anel de plástico que está ligado a uma lamela com massa de silicone. Uma malha de plástico é fixada no interior da câmara com quatro pequenos pontos de gordura de silicone. (B) A câmara contendo a larva montado é cheio com solução tricaina uma lâmina de vidro e está conectado à parte superior. (C) A 2 dias de idade larva (seta) é mostrado em maior ampliação para descrever o seu tamanho em relação à malha montado.&quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem câmara montagem feita a partir de placas de Petri. (A) É mostrado um copo comercial tampo de vidro placa de Petri de fundo com uma malha de plástico ligado à lamela de vidro. (B) é mostrado um prato de Petri câmara auto-construída com um buraco perfurado na tampa e uma lamela ligado do lado de fora com massa de silicone. A malha de larva e estão montados no interior da câmara que contém a solução tricaina. Para selar a câmara, graxa de silicone é aplicado na borda superior externa da câmara de fundo e tampa superior em anexo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52654 / 52654fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Esquema de amputação e montagem de uma larva para a imagem latente. (A) para a amputação, coloque uma larva anestesiados em uma placa de Petri revestidas de agarose e amputar a nadadeira caudal com uma agulha de seringa. (B) Para a montagem, transferir a larva com uma pipeta para um tubo de 1,5 ml cheio com 42 ° C de agarose e pipetar um líquido contendo a larva gota na câmara de imagiologia, orientar o peixe e cobrir o solidificado de agarose com forma embrião. (C) Raspar a agarose a partir da barbatana caudal usando uma ponta tapada pipeta microloader ou ferramenta semelhante e substituir médio embrião por meio fresco. (D) Imagem da barbatana caudal sob microscópio estereoscópico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 4. construído Self-câmara de incubação aquecida. (AC) É mostrada uma câmara de incubação aquecida feita de papelão, plástico bolha e Velcro. Um aquecedor de cúpula com fio (originalmente projetado para incubação de ovos de galinha) está ligado à câmara usando fita de alumínio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig5.jpg" /> Figura 5. dinâmica da regeneração Fin. (A) Esquema do método de ensaio de amputação e quantificação barbatana caudal utilizado para determinar o comprimento da nadadeira (seta vermelha) e área (contorno vermelho da fin). (B) Cauda amputação fin inicialmente desencadeia a contração da barbatana, seguindo-se regeexcrescência tecido nerative. A barbatana também passa por crescimento, de desenvolvimento, como evidenciado pelo aumento de tamanho lateral. (C) É mostrado o comprimento da aleta como uma função do tempo, revelando uma partida crescimento regenerativo linear em ~ 14 hPa. (D) Quantificação da área revela uma barbatana inicialmente diminuir em tamanho, o que pode ser atribuído à contracção da barbatana. Depois de ~ 14 horas, o tamanho aumenta fin a uma taxa linear. (E) Comparação do comprimento da nadadeira antes da amputação e depois de 36 horas mostra ~ 60% rebrota. Barra de escala: 100 um Abreviaturas: pré-amplificador, pré-amputação; horas após a amputação, hpa; regen, regeneração; amp, amputação <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig5large.jpg" target="_blank">por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/movie1.mp4">Filme</a> . A regeneração da barbatana sobre o curso de tempo de 36hr. É mostrada uma aleta da cauda de um velho larva 2,5 dias durante o curso de regeneração. A partir de 30 min pós amputação crescimento regenerativo é fotografada em intervalos de 30 min em um microscópio estereoscópico usando uma lente objetiva de 3,5x.

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

capturing-tissue-repair-zebrafish-larvae-with-time-lapse-brightfield

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K visualizações.  MDI Biological Laboratory. We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.