Recientemente descubrimos que muchas células B en LCK GFP pez cebra expresa bajos niveles de GFP. Esto hace de esta línea una herramienta útil para estudiar las células B, así como las células T. La principal ventaja de esta técnica es que ahora podemos estudiar células B y células T de LCK GFP zebrafish o podemos estudiar células B-ALL y T-ALL de peces con cáncer.
Estos métodos permiten el desarrollo de células B y estudios B-ALL en peces cebra. Que son relevantes para entender el sistema inmunitario adaptativo y sus neoplasias malignas comunes en el cáncer pediátrico. Si nunca ha hecho estas disecciones antes, es posible que desee refinar su técnica un par de veces hasta que pueda obtener buenas muestras de timo y médula.
La demostración visual ayudará a los espectadores a reconocer fluoroso y B-ALL en peces y a seleccionar la configuración correcta para discriminar las células B y T para su aislamiento. Después de anestesiar con 0.02%Tricaine en el sistema de peces agua utilizar el filtro GFP en un microscopio de epifluorescencia para examinar el pez cebra de dos a seis meses de edad para timi fluorescente en el aspecto medial dorsal de la cavidad ramificada. Después de localizar el timo colocar pescado eutanizado en una placa Petri y utilizar el microscopio fluorescente para eliminar el timi positivo GFP.
Y ajustes de microscopía de campo brillante para cosechar la médula renal y el bazo. Coloque cada órgano recogido en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de medio de clasificación en frío y utilice un homogeneizador de microtubos de peste para homogeneizar los tejidos sobre hielo. Luego, tensa el tejido homogeneizado a través de un filtro de malla de 35 micrómetros para generar una sola suspensión celular y colocar las células sobre hielo.
A partir de dos a cuatro meses, utilice un microscopio fluorescente para examinar el ragnú transgénico doble2: hMYC LCK EGFP fish utilizando ajustes de baja exposición para identificar la leucemia linfoblástica aguda de células T brillantes o T-ALL y ajustes de alta exposición para identificar animales B-ALL tenues. El control de tipo salvaje y los peces pre-leucémicos tienen GFP localizado sólo en el timo. Clasificar el pez en función de la extensión de la fluorescencia GFP utilizando un sistema simple de tres categorías.
Los peces de nivel uno demuestran una señal fluorescente como un tumor timico con una propagación local limitada. Los peces de nivel dos demuestran una señal fluorescente más allá del timo que involucra a menos del 50% del cuerpo. Y los peces de nivel tres demuestran una señal fluorescente que se extiende más allá del 50% del cuerpo.
Separe el pescado con TODOS de los que no tienen cáncer. Y monitorear el pescado pre-leucémico sin tumores positivos GFP una vez al mes para el desarrollo de nuevos ALL. Para el aislamiento celular T o B-ALL, utilice una cuchilla de afeitar para eliminar la cabeza y la región timica de un pez de nivel tres eutanizado y colocar el cuerpo en un plato de petri.
Utilice una pipeta P-1000 para lavar la cavidad peritoneal de pescado con 500 microlitros de medio de clasificación en frío, recogiendo las células y el medio en un tubo de cinco mililitros. Usando una punta de pipeta fresca inyectar de dos a tres volúmenes adicionales de 200 a 300 microlitros de medio de clasificación en frío en la cavidad del cuerpo y utilizar la punta de la pipeta para aplicar una presión suave al cuerpo del pez para extruir las células fuera de la cavidad del cuerpo en el tubo de cinco mililitros. A continuación, tensar la suspensión celular a través de un filtro de malla de 35 microlitrotros.
Y coloque las células sobre hielo hasta su análisis por citometría de flujo. Para la homogeneización de todo el cuerpo utilizar un homogeneizador de microtubo peste para homogeneizar el cuerpo del pez y añadir 300 microlitros adicionales de medio de clasificación en frío al tubo. Filtre la suspensión celular a través de un filtro de malla de 35 micrómetros, lavando el filtro con un medio de clasificación adicional según sea necesario hasta que solo queman restos de tejido en el filtro.
Luego, coloque las células sobre hielo hasta su análisis. Para el análisis citométrico de flujo de las células aisladas, establezca los parámetros del citometro de flujo de acuerdo con las directrices del fabricante. Y adquirir de 10.000 a 50.000 eventos para establecer los parámetros de dispersión hacia adelante y dispersión lateral para definir las compuertas de linfocitos y células progenitoras y excluir los desechos celulares.
Excluya los dobletes celulares y utilice las puertas linfoides y/o precursoras para determinar el número y el porcentaje de las células positivas de la GFP. El uso de fitoerytrina y las intensidades de GFP definen puertas para el GFP negativo frente a GFP bajo versus GFP células altas. Aprender dónde colocar las puertas para aislar las células altas de GFP bajas y GFP es fundamental para obtener poblaciones puras de células B y T.
Dos poblaciones positivas de GFP distintas, células B bajas de GFP y células T altas de GFP se pueden obtener del timo. Las células B que residen en la médula renal de peces cebra de tres meses de edad expresan bajos niveles de GFP. Sin embargo, las células altas de la GFP son escasas, lo que indica que sólo un pequeño porcentaje de linfocitos T están presentes en la médula a los tres meses de edad.
Del mismo modo, las muestras esplénicas muestran porcentajes más altos de GFP bajos que las células altas de GFP. En los peces doble transgénicos que aún no han desarrollado leucemia linfoblástica aguda, la expresión de la GFP en el timo, la médula y el bazo es similar a la observada en los peces LCK EGFP monotransgénicos. Sin embargo, el número de linfocitos por órgano aumenta.
Presumiblemente, debido a la expansión impulsada por la MYC de las poblaciones inmaduras de células B y T en las que el promotor rag2 está activo. En peces doble-transgénicos con B y o T-ALL que han desarrollado cánceres fluorescentes a lo más de seis meses B-ALL son cánceres tenumente fluorescentes que contienen principalmente células bajas de GFP. Por el contrario, los peces fluorescentes brillantes pueden albergar poblaciones aisladas de T-ALL o mixtas de células B-ALL bajas de GFP y T-ALL altas de GFP.
De hecho, según lo evaluado por el análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa, las células bajas de la PFN expresan niveles más altos de transcripciones de células B. Y las células altas de la GFP expresan niveles más altos de genes de células T, LCK y el marcador GFP. Es fundamental aprender a reconocer peces con B-ALL por microscopía.
Y cómo definir correctamente las puertas de citometría de flujo para separar las poblaciones bajas de GFP y GFP altas. Después de este procedimiento, puede aislar el ADN, el ARN o la proteína de las células altas de GFP baja y GFP para PCR, la secuenciación, lo que hay en la sangre o experimentos de trasplante in vivo. Una vez que aprendimos LCK GFB peces tienen células B fluorescentes además de células T podríamos estudiar ambos tipos de células del mismo animal para evaluar B y T-ALL.
