Research supported by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada.

1. Introducción <ol><li> El laboratorio de Macintosh ha estado usando la preparación músculo gemelo medial durante varios años, y antes de eso, toda la preparación de los músculos gemelos, como el desarrollado con el Dr. Phil Gardiner 1. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Adulto ratas Sprague-Dawley (200-300 g) se utilizan normalmente en nuestro laboratorio para el estudio de las propiedades contráctiles en el lugar. La rata se puede restringir en un dispositivo de plexiglás, disponibles en el mercado, o cubriendo con una toalla, y la celebración. </li><li> Usamos la ketamina / xilazina, (100 mg · ml -1, cada uno) mezclados en 85:15, y administrar 0,1 ml por cada 100 g de peso del animal por vía intramuscular 2,3. Pentobarbital sódico (50 a 60 mg · kg -1, intraperiteneal) o isoflurano (2-3,5%, inhalada) también se puede utilizar 4. </li><li> Mientras que la anestesia hace efecto, un peso exacto se puede obtener y se afeitó la izquierda los miembros traseros. Esto también es un buen momento para estar seguro de todos los aparatos electrónicos están encendidos y listos. Esto incluye ordenadores, un amplificador de calibrador de tensión, el calentador de aceite, entre otros. </li><li> Compruebe si hay retorno de respuesta refleja periódicamente y complementar la anestesia cuando sea necesario (0,05 a 0,1 ml por cada 100 g). </li></ol> 3. Inicio de la cirugía <ol><li> Utilizamos una plataforma de plexiglás en la que para inmovilizar la rata para la cirugía. Cinta adhesiva simple hace el trabajo. Asegúrese de que el animal se extendía desde extremidad posterior izquierda de extremidad anterior derecha. Agregar una gota de lubricante para los ojos. Usamos aceite de parafina. De lo contrario, los ojos se secan con anestesia ketamina. </li><li> Una lámpara de quirófano pequeña es útil. Éste emite calor suficiente como para ayudar a mantener al animal caliente. Por otra parte, una manta de calentamiento de agua se puede utilizar. Compruebe que reflejos de la córnea o del pie emergente están ausentes antes de proceder. Técnicas de esterilización no es necesaria, ya que este procedimiento es aguda. El animal no se recupere de la anestesia. Nosotros la eutanasia a la rata con anestesia sobredosis (0,2 ml, intracardíaca) cuando se ha terminado. </li><li> La primera incisión es a través de la piel desde el talón hasta la columna vertebral. Nosotros usamos las tijeras, ya que la profundidad del corte puede ser controlada y las tijeras se utilizan para separar la piel de los tejidos subyacentes. Las ratas tienen una hemostasia excelente, así que el tiempo que evitar los grandes vasos sanguíneos, hemorragia será limitado. Mantenga las superficies expuestas cubiertas con solución salina isotónica una gasa empapada, siempre que sea posible. </li><li> Después se separa la piel del tejido conectivo subyacente, la capa muscular superficial se corta. Asegúrese de no ir demasiado profundo, que no quieren dañar el nervio ciático o los vasos sanguíneos o el músculo de su interés. Comience por los músculos gemelos y el corte proximal, en la misma línea que la incisión de la piel. Por debajo de Peek para localizar y evitar el nervio ciático. Una vez que vea el nervio, puede seguir su camino con la incisión, pero se quedan muy por encima del nervio. Hay una unión clara entre los músculos. Localizar este, y corte en esa unión hacia la rodilla. Vigilar y evitar los vasos sanguíneos. </li></ol> 4. Prepare agujero piloto en el fémur para el pasador de hueso <ol><li> Corte a través de la delgada capa de músculo en la cara caudal del fémur, dejando al descubierto el hueso al descubierto. Usando una mano herramienta rotatoria, perforación, o viceversa, pines, (0,9 mm de acero al carbono fresa), haga un agujero piloto a pequeña escala a través de la corteza, y sólo en la médula. No perforar demasiado profundamente, o sangrado excesivo resultado. Este agujero se usará más adelante para colocar un pin para inmovilizar los huesos del fémur sobre la base de miografía. </li></ol> 5. Aislar a la inervación de los músculos gemelo interno <ol><li> El siguiente paso requiere un microscopio de disección. Busque el lugar donde el nervio poplíteo desaparece detrás del músculo gemelo interno. Suavemente hacia fuera las diversas ramas, y cortar todo lo que no inervan el músculo gemelo interno. Inervación puede ser determinada por microestimulación. En esta etapa, también asegúrese de que las ramas superficiales del nervio ciático se cortan. </li><li> Ahora está claro que el tejido conectivo fuera del nervio ciático, por lo que puede ser deslizado en el manguito de los nervios (más tarde). Asegúrese de tratar el nervio con suavidad. Cualquier tramo del nervio puede llevar a inexcitabilidad, y al final de su experimento antes de tiempo. </li></ol> 6. Aislar el tendón de Aquiles y los músculos gemelos <ol><li> Disección roma, con la ayuda ocasional de unas tijeras, se puede utilizar para separar los músculos gemelos de otros tejidos. El tendón del plantar puede ser sacado de debajo del tendón de Aquiles, atadas y cortadas. El empate se utiliza simplemente para ayudar a sostener el tendón y se puede cortar inmediatamente después de que el tendón se corta y el plantar se separa de los músculos gemelos de una longitud considerable. Colocar una ligadura de seda # 1 alrededor del tendón de Aquiles, y corbata en un nudo cuadrado. No tire demasiado fuerte, o el tendón dañado. Nosotros utilizamos pinzas para cortar hueso calcáneo, dejandoción un pequeño pedazo de hueso todavía adherido al tendón de Aquiles. Mantenga las superficies de corte horizontal para asegurarse de que el hueso se corta, no sólo en el tendón. Esto asegura que el tendón de Aquiles puede ser colocada en el miografía más tarde. </li><li> A lo largo de la parte inferior del gastrocnemio, el sóleo se puede ver. Una vez más, una disección roma se puede utilizar para separar el músculo sóleo de los músculos gemelos. Queremos aislar el gemelo interno, por lo que es el único músculo que todavía unido al tendón de Aquiles. Cortar el tendón del sóleo, cerca del extremo distal. Entonces usted puede separar los músculos gastrocnemio medial y lateral, y cortar el tendón lateral, dejando sólo el músculo gemelo interno unido al tendón de Aquiles. Tire del músculo gastrocnemio lateral lejos de la media, a lo largo de aproximadamente el 50% de su longitud. Más allá de esta longitud, las fibras se cruzan y el daño será el resultado de más tirón. Compruebe que el músculo es el tejido conectivo. </li></ol> 7. Cortar la tibia <ol><li> Colocar una ligadura alrededor del vástago, justo por encima del punto medio. Esto tiene que ser ajustada, sin cortar en el tejido. Un segundo bucle antes de atar ayuda a evitar los resbalones. Una vez más utilizar un nudo cuadrado de seguro. </li><li> Con una sierra pequeña, cortar la pierna de distancia. Este corte debe ser a medio camino a lo largo de la tibia. </li><li> Insertar una sonda aguda en la médula de la tibia. Esta sonda se utiliza para inmovilizar la tibia sobre la base de miografía. </li><li> Adjuntar dos elásticos de la piel, utilizando clips de Michel. Elásticos Estos y otros serán utilizados para mantener la piel alrededor de los músculos para formar un recipiente que se llena con aceite de parafina caliente. </li></ol> [OPCIONAL] 8. Inserte cristales sonometric (paso opcional) 5 <ol><li> Colocar el animal sobre una almohadilla térmica en el nivel bajo. Una sonda rectal, si no se ha insertado se puede insertar en este momento. Use una pequeña gota de aceite de parafina para lubricar. </li><li> Utilizando microestimulación, identificar los extremos de un fascículo en el músculo. Poke una aguja de calibre 21 en el sitio de el origen y la inserción del músculo. </li><li> Deslice un cristal sonometric en el agujero hecho por la aguja, y sellar con pegamento veterinario de bonos quirúrgica. Use una pequeña gota de pegamento, asegurándose de que está situado justo sobre el cristal. Dar la cola a un pedazo de papel cortado con un ángulo agudo ayuda en la aplicación de la cola con precisión. Estamos colocando un cristal adicional en la inserción de los fascículos que fue identificado por microestimulación. </li></ol> [CONTINUAR] 9. Montaje en el aparato (ver Figura 1) <ol><li> Posición de la rata en la base de miografía, con la sonda tibial orientado hacia la palanca. Coloque la sonda en el soporte, para inmovilizar la pierna. </li><li> Tire de la piel a los lados, para formar un recipiente y seguro con elásticos. </li><li> Conjunto broca (1 / 16 de pulgada º) en el fémur, a través del orificio piloto que se creó durante la preparación quirúrgica. Asegúrese de que el apoyo del fémur en la parte anterior como se coloca la broca (en un tornillo pasador) la rotura del fémur puede dar lugar, terminando el experimento antes de tiempo. Fije el pasador de vice a una barra transversal para inmovilizar el fémur. </li><li> Coloque el muñón distal del nervio ciático a través del manguito de los nervios estimulantes (cátodo hacia los músculos) y meter de nuevo cerca del origen del músculo. Conectar el estimulador de estos cables. </li><li> Conecte el tendón de Aquiles de la palanca, que tiene sensores de presión del medidor en la misma. Empate cómodamente, pero deja un cierto margen de ajuste posterior. Asegúrese de que la alineación de los músculos es perpendicular a la palanca. </li><li> Llene el recipiente formado por la piel con aceite de parafina caliente. </li><li> Encender la lámpara de calor y escudos hechos de papel de aluminio puesto sobre la cabeza del animal, y el transductor de fuerza. Escudos de aluminio adicionales pueden ser necesarias para asegurar la temperatura del núcleo del animal no exceda de 38 ° C. La longitud del músculo puede ser ajustada hasta holgura de la cadena se retira de la conexión entre el gemelo interno y el transductor de fuerza. </li></ol> 10. Ajuste de tensión máxima y la longitud de referencia <ol><li> Mientras que el músculo se está calentando, configurar el estimulador y poner a prueba la tensión de la estimulación. Es importante asegurarse de que la estimulación se fija en la duración del pulso muy breve. Usamos 50 ms. Tensión máxima debe ser inferior a 1 V. A partir de 0,5 V, aumentar la tensión hasta que la amplitud de contracción no se incrementa. Tensión máxima es la más baja de voltaje que activa todas las unidades de motor. Por lo general estimulan el doble de la tensión máxima o 3 V que sea mayor. </li><li> Por lo general, los experimentos se iniciará con el músculo en la longitud que da a la contracción de la mayor contracción. Una contracción se obtiene con un pulso único estimulante. La longitud del músculo se incrementa alrededor de 1 mm por otra de contracción. Esto se repite siempre y cuando la amplitud de movimiento es increacantar. Una vez que disminuye la amplitud de contracción, la longitud será devuelto a la que dio la mayor amplitud de contracción. </li><li> Después de esta configuración inicial de longitud, prueba el sistema con lo que nos referimos como &quot;contracción tetánica acondicionado&quot;. El estimulador se ajusta para proporcionar pulsos de 200 Hz para 500 ms. La entrega de este estímulo se traducirá en una contracción tetánica fusionado completamente. La fuerza generada por el músculo se apriete todas las conexiones, incluyendo los nudos en los músculos. Después de un descanso adecuado para la disipación de la potenciación 4, la longitud de referencia del músculo se pone a cero (véase la parte 9.2). Por lo general, la contracción tetánica acondicionado se han permitido algunas acortamiento fascículo, por lo que el músculo tiene que ser estirado un poco para volver a la longitud que le da mayor amplitud de la contracción nerviosa. </li></ol> 11. Iniciar el experimento <ol><li> Un experimento típico se incluyen ajuste de la longitud y / o la estimulación con una variedad de patrones de estimulación. La recolección de datos puede implicar simplemente la fuerza o la fuerza, con la longitud, la longitud fascículo y el electromiograma. </li></ol> [OPCIONAL] 12. Fuerza-frecuencia 2 <ol><li> Establecer la duración del tren el tiempo suficiente para llegar a una meseta de la fuerza en cualquier frecuencia de interés. La fuerza isométrica máxima se alcanza en el músculo gemelo interno de 200 Hz. Duración de los trenes deben ser de al menos 200 ms, ya es mejor para las frecuencias más bajas, pero se traducirá en algo de fatiga, si varias contracciones se utilizan para determinar la gama completa de la relación fuerza-frecuencia. Por lo general utilizan las contracciones a las 0, 20, 40, 60, 80, 100 y 200 Hz.. Este rango de frecuencias permitirá a toda la gama de la relación fuerza-frecuencia que se describe. Un descanso adecuado entre las contracciones se debe permitir para evitar la fatiga (1-10 min). </li></ol> 13. Fuerza-talla 6 <ol><li> Con el tiempo estimado óptimo establecido anteriormente, la relación fuerza-longitud se puede determinar de forma sistemática el ajuste de la longitud del músculo de -4 a 4 mm mm usando un aparato de servo-motor. Esto se debe hacer uso de la estimulación máxima (200 Hz), pero hemos encontrado que las contracciones muy breve dará la misma longitud real óptimo 7. Contracciones submáximas, como tics, se puede utilizar, pero esto dará lugar a una diferente longitud de la dependencia de la fuerza 8. </li><li> Un aspecto importante de la determinación de la relación fuerza-longitud es la necesidad de estimar la fuerza pasiva en la longitud fascículo en el que la fuerza medida se produce. Fuerza activa se calcula como la diferencia entre el total de la fuerza y ​​la fuerza pasiva apropiado. Dado que las estructuras elásticas paralelas tienen la fuerza pasiva y estos están en serie con las estructuras de serie elástica, la contribución de la fuerza pasiva de la fuerza total debe disminuir a medida que las estructuras de la serie elástica se estiran durante una contracción del 3. Una vez que la fuerza pasiva es conocido por todas las longitudes de los músculos correspondientes, la fuerza pasiva adecuada se puede estimar con la medición continua de la longitud de fascículos con sonomicrometría, o por la estimación del cumplimiento del sistema de medición y las estructuras en la serie de la unidad músculo-tendinosa. Si esto no se hace, la duración óptima de la preparación y las fuerzas de pico, están subestimados. </li></ol> 14. Relación fuerza-velocidad 9 <ol><li> Si desea determinar la relación fuerza-velocidad, tendrá que adjuntar los transductores de fuerza a un sistema, que permite el control de cualquiera de la carga o la tasa de cambio de longitud. El método más fácil y más rentable es el uso de la presión del aire para limitar el acortamiento de una carga controlada. En nuestro sistema, el músculo está unido a la palanca de un lado del punto de apoyo y la presión del aire impide el cambio de longitud en el otro lado. Un sensor de longitud debe ser empleado de manera que usted es capaz de detectar el cambio en la longitud muscular durante las contracciones isotónicas. Esta disposición permite contracciones afterloaded con resistencia neumática. Tanques de doble puede permitir la contracción isométrica con la liberación de una carga isotónica. Un total de 15 a 20 contracciones se deben obtener, con cargas que van desde cerca de descarga de la fuerza isométrica máxima. Al colocar los datos en una ecuación, las cargas por encima del 90% de los isométricos no debe ser utilizado 9. </li></ol> 15. Los resultados representativos: Contracciones de la muestra se presentan en la Figura 2. Estas contracciones se obtuvieron para ilustrar la relación fuerza-frecuencia. Cálculo de la fuerza máxima activa de estas contracciones, y el trazado de la fuerza activa de la frecuencia, el rendimiento de la figura 3, la relación fuerza-frecuencia. Los datos presentados en la Figura 2 puede estar en forma para la siguiente ecuación: AF = c / (1 + e ((AF) / b) + d), AF es la fuerza activa, F es la frecuencia y, b, c, yd son constantes. Para el músculo gemelo interno de ratas, la frecuencia media máxima de estimulación suele ser de 50-60 Hz no fatigados músculos 2. Los resultados se ajustan estrechamente a la línea descrita por la ecuación anterior. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig1.jpg" /> Figura 1 Aparato muscular y set-up:. Neumática de configuración se muestra a la izquierda, isométrica a la derecha. El sistema de palanca muestra a la izquierda se une a la tabla de traducción cuando las contracciones dinámicas son deseados (adaptado de 13). El motor paso a paso está controlado por un ordenador (adaptado de 14). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig2.jpg" /> . Figura 2 superpuestas contracciones isométricas: 20, 40, 60, 80, 100 y 200 Hz.. La amplitud de la contracción de 200 Hz es 8,13 N. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg" /> . Figura 3 fuerza-frecuencia: la fuerza activa de las contracciones en la figura 2 se representan y la línea representa la recta de mejor ajuste.

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+recruitment+and+firing+frequencies+of+motor+units+in+electrically+stimulated+muscles+in+the+cat.">Control of the recruitment and firing frequencies of motor units in electrically stimulated muscles in the cat.</a> Medical &#38; Biological Engineering &#38; Computers. 16, 302-308 (1978).</li><li>Bawa, P., Binder, M. D., Ruenzel, P., Henneman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+order+of+motoneurons+in+stretch+reflexes+is+highly+correlated+with+their+axonal+conduction+velocity.">Recruitment order of motoneurons in stretch reflexes is highly correlated with their axonal conduction velocity.</a> Journal of Neurophysiology. 52, 410-420 (1984).</li><li>Dormer, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental Contractil Properties of Skeletal Muscle Following a stroke in a Rat Model. Master's Thesis. , (2008).</li><li>MacNaughton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Length dependence of Fatigue and of Repetitive Contractions. Master's Thesis. , (2005).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Good quality contractile results can be obtained with care in surgical preparation, secure mounting in the apparatus and good quality electronics. When a student is learning this surgery, some common slips include: stretching the sciatic nerve, disrupting the blood flow, and excessive bleeding. The nerve must be handled with care to prevent damage. You will know you have damaged the nerve if the maximal tetanic force at optimal length is substantially less than that shown in Figure 3, or if the stimulation voltage needed to maximally activate all motor units is greater than 5 volts. It is relatively easy to avoid the blood vessels serving this muscle during the surgery. Disruption to these vessels can occur when the drill bit is being placed in the caudal surface of the femur. If the pilot hole is not on the flat surface of the femur, the drill may slip. When this happens, there is a possibility that the popliteal vessels get disrupted. If blood pools around the muscle after set-up, it is a sign that you have disrupted these vessels. Excessive bleeding can also occur if a large vein is cut and not tied. Large veins to watch out for are the ones around the ankle.
The in situ muscle preparation is a valuable approach to the study of muscle contractile properties. Individual motor units can be activated10, but usually all motor units are activated synchronously. This is a disadvantage relative to the normal asynchronous activation that occurs by voluntary motor unit recruitment, so represents a limitation. However, on the positive side, synchronous activation allows quantification of an average response of all motor units. 
There are two approaches that have been used to avoid synchronous activation. One is to use an electrode cuff with several pairs of stimulating wires. This allows activation of a portion of the motor units with each pair, and stimulation can rotate through the pairs to achieve asynchronous activation. This method of activation can be combined with anodal block11to attempt to activate motor units in the appropriate sequence according to the size principle12. In this approach, all motor units are activated with a proximal pair of electrodes, and a block is imposed with direct current stimulation. The amplitude of stimulus for the block can be modulated to inhibit motor units for which activation is not desired. Apparently the block affects large axons at the lowest voltage, and progressively affects smaller units.
The in situ rat gastrocnemius muscle preparation is a valuable physiological approach to the study of skeletal muscle contraction and biochemical properties in health and in disease.

<table border="1">
<tbody>
<tr>
	<th>Name of the equipment</th>
	<th>Company	</th>
	<th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
</tr>
<tr>
	<td>Clippers</td>
	<td>&nbsp;</td>
	<td>&nbsp;</td>
 <td>Good quality pet clippers</td>
</tr>
<tr>
	<td>Surgical lamp</td>
	<td>Dyna-Lume</td>
	<td>&nbsp;</td>
 <td>Any of several will do</td>
</tr>
<tr>
	<td>Myograph</td>
	<td>&nbsp;</td>
	<td>&nbsp;</td>
 <td>Custom built</td>
</tr>
<tr>
	<td>Stimulator</td>
	<td>Grass</td>
	<td>S-88</td>
 <td>Any of several will do</td>
</tr>
<tr>
	<td>Strain gauge amplifier</td>
	<td>CWE</td>
	<td>PM-1000</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>Telethermometer		</td>
	<td>YSI</td>
	<td>YSI-400</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>Robotic platform</td>
	<td>Arrick Robotics</td>
	<td>MD-2</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>Sonometric amplifier</td>
	<td>Sonometrics</td>
	<td>Sonolab</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>Computer and data collection</td>
	<td>PC with NI board</td>
	<td>&nbsp;</td>
 <td>Custom software (labview)</td>
</tr>
<tr>
	<td>Block heater</td>
	<td>Lab-line</td>
	<td>Multi-block</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>Nerve cuff</td>
	<td>&nbsp;</td>
	<td>&nbsp;</td>
 <td>Custom made</td>
</tr>
<tr>
	<td>Microstimulator</td>
	<td>&nbsp;</td>
	<td>&nbsp;</td>
 <td>Custom made</td>
</tr>
</tbody>
</table>

procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties

Hay muchas circunstancias en las que es conveniente para obtener la respuesta contráctil del músculo esquelético en condiciones fisiológicas: la circulación normal, todo el músculo intacto, a temperatura corporal. Esto incluye el estudio de las respuestas contráctiles como la potenciación postetánica, la escalera y la fatiga. Por otra parte, las consecuencias de tratamiento de la enfermedad, falta de uso, las lesiones, la formación y las drogas pueden ser de su interés. Este vídeo demuestra los procedimientos apropiados para instalar y utilizar esta valiosa preparación muscular. Para configurar esta preparación, el animal debe ser anestesiado, y el músculo gemelo interno está aislado quirúrgicamente, con el origen intactos. Se debe tener cuidado para mantener el suministro de sangre y los nervios. Una larga sección del nervio ciático, se elimina el tejido conectivo, y cortó proximal. Todas las ramas del tronco distal que no inervan el músculo gemelo interno se rompen. El tronco del nervio distal se inserta en un puño llena de alambres de acero inoxidable estimulante. El calcáneo es cortada, dejando un pequeño pedazo de hueso todavía adherido al tendón de Aquiles. Sonometric cristales y / o electrodos de electromiografía se puede insertar. La inmovilización de las sondas de metal en el fémur y la tibia evita el movimiento del origen muscular. El tendón de Aquiles se une al transductor de fuerza y ​​la piel suelta se levanta a los lados para formar un recipiente que se llena con aceite de parafina caliente. El aceite distribuye el calor uniformemente y minimiza la pérdida de calor por evaporación. Una lámpara de calor se dirige en el músculo y el músculo y la rata se dejó calentar hasta 37 º C. A pesar de que se está calentando, la tensión máxima y la longitud óptima se puede determinar. Estos son importantes las condiciones iniciales para cualquier experimento en el músculo entero intacto. El experimento puede incluir la determinación del estándar de las propiedades contráctiles, como la fuerza-frecuencia, la fuerza-talla, y la relación fuerza-velocidad. Con el cuidado en el aislamiento quirúrgico, inmovilización del origen del músculo y la alineación de la unidad músculo-tendón con el transductor de fuerza, y el análisis de datos adecuados, mediciones de alta calidad se puede obtener con esta preparación muscular.

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Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procedimientos para la Rata In situ Propiedades contráctiles del músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

28.5K vistas.  University of Calgary. This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&...

Video: Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

En vivo la micro-circulación de medición en el músculo esquelético de Intra-vital Microscopía

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Investigación

Biología

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Con el método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Aislamiento de myofibrils de biopsias de músculo esquelético y determinación de la función contráctil con un transductor de fuerza de resolución Nano-Newton

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Cuantificación de la infiltración grasa del músculo esquelético mediante descelularización

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Autor destacado: Cuantificación basada en la descelularización de la infiltración grasa del músculo esquelético  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.