Las diferencias en cultivos in vitro 2D simplificados frente a entornos similares a tejidos 3D han aumentado el interés en los sistemas 3D para representar la complejidad espacial y química de los tejidos vivos. El proceso de fabricación no requiere instalaciones ni técnicas de fotolitografía. Sin embargo, el dispositivo 3D PDMS incluye los vectores necesarios para aplicaciones de entorno fisiológico 3D.
Para la preparación de dispositivos mesofluídicos, utilice un programa de software de diseño tridimensional adecuado para diseñar la máscara del molde para el dispositivo polidimetilsiloxano o PDMS e imprimir el molde utilizando equipos de litografía estéreo con una resina termorresistente. Cuando el molde esté listo, mezcle aproximadamente tres mililitros de solución monórica PDMS por molde con un agente de curado en una proporción de 10 a 10 y utilice un vacío para desgasificar la mezcla en un desecador de vacío durante una hora. Al final de la desicación, utilice un pedazo de cinta adhesiva para eliminar cualquier polvo de la superficie del molde y llene cuidadosamente el molde con la solución PDMS desgasada.
A continuación, cura el PDMS a 80 grados Centígrados durante dos horas antes de permitir que el molde se enfríe a temperatura ambiente. Cuando el molde se enfríe al tacto, utilice una hoja para cortar el límite entre el molde y PDMS y pelar cuidadosamente los PDMS del molde. Recorte el PDMS para que se ajuste a un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros y haga un agujero en la entrada.
Usando tejidos de pelusa baja y 70%etanol, limpie el dispositivo y cubra y desempolve el dispositivo con una nueva pieza de cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo grandes. A continuación, autoclave el dispositivo PDMS y el cubreobjetos a 121 grados Celsius durante ocho minutos húmedos y 15 minutos secos y tratar la superficie inferior de la parte PDMS y cubreobjetos con una pistola de descarga corona durante cinco minutos en una capucha de cultivo de tejido antes de unir las piezas. Para cargar el dispositivo, primero resuspender las células de interés en un volumen adecuado de medio de crecimiento complementado con 1%penicilina y estreptomicina y 1%insulina-transferrina-selenium-x.
A continuación mezclar 50 microlitros de la suspensión celular de la glándula mamaria con 425 microlitros de solución de colágeno neutralizada recién preparada y llenar una pipeta de 200 microlitros con la suspensión de la célula de colágeno. Inyecte la suspensión a través de la entrada en el dispositivo PDMS hasta que se llene toda la cámara y coloque el dispositivo en la incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante una hora para inducir la gelización antes de llenar los depósitos en ambos lados con medio de crecimiento y devolver el dispositivo a la incubadora hasta que se realicen imágenes confocales. Para la toma de imágenes 3D y la cuantificación, instale una cámara de cultivo de imágenes de células vivas en un microscopio confocal y preestablece la temperatura y el dióxido de carbono a 37 grados centígrados y al 5%, respectivamente.
Agregue agua al depósito de la cámara de imágenes para humidificar la cámara, colocando toallitas húmedas en la cámara según sea necesario y coloque el dispositivo PDMS en la cámara. Añadir factor de crecimiento epidérmico a uno de los reservorios como una fuente del factor en la formación de gradiente dejando el otro reservorio para servir como un sumidero para el desarrollo de la distribución del factor de crecimiento epidérmico clasificado espacialmente. A continuación, establezca el rango de la pila Z que cubre el volumen de organoides de interés e inicie la toma de imágenes.
Al final del experimento, utilice un programa de análisis de imágenes adecuado para medir la longitud y el ángulo de las ramas que se extienden desde los organoides o la migración de células individuales. Tanto en pruebas de silico como in vitro revelaron la formación de un gradiente de factor de crecimiento epidérmico lineal estable a través del área de cultivo celular que duran aproximadamente dos días sin reponer la fuente o los depósitos del fregadero, lo que sugiere que el factor de crecimiento epidérmico, una proteína de 6,4 kilodalton, puede formar un gradiente estable a base de difusión dentro de un gel de colágeno preparado como se ha demostrado durante un período de tiempo relativamente corto. Los organoides mamarios forman múltiples ramas en presencia de un factor de crecimiento epidérmico nanomolar espacialmente uniforme de 2,5 nanomolares sin sesgo direccional durante tres días si se añade factor de crecimiento epidérmico en el gradiente lineal para tener 0,5 nanomolares por mililitro.
Sin embargo, la formación de ramas muestra un sesgo direccional significativo. Cabe destacar que la adición de inhibidores de la unión de brecha suprime la capacidad de los organoides para responder al gradiente. El pH de la solución de colágeno es fundamental para la geleración y la viabilidad celular.
Si el colágeno no se neutraliza antes de mezclar, la viabilidad celular será baja. Este método se puede extender para acomodar el modelado de tejido más realista y podría acomodar la formación de la red vascular a partir de células individuales dentro del gel.
