Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Julie Gordon y el Dr. Nancy Manley por sus consejos útiles con la técnica de cultivo. Este trabajo ha sido apoyado por la Fundación del Niño Glaucoma y Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.

Ratón cultivo de embriones: Todos los procedimientos experimentales se realizaron en estricto acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud siguiendo el protocolo # A2010 07-119, el cual fue revisado y aprobado por la Universidad de Georgia Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión, que mantiene continua supervisión regulatoria. 1. Preparación de medios de cultivo <ol><li> Preparar medio de cultivo utilizando los medios de comunicación y suplementos de células madre disponibles en el mercado en las siguientes cantidades: Maravilla DMEM, Reemplazo golpe de gracia suero (KSR) (10%), N-2 del Suplemento (1x), Albúmina de Suero Bovino (2%), penicilina ( 50 UI / ml), estreptomicina (50 mg / ml) y anfotericina-B (1,25 g / ml). El medio de cultivo preparado es similar a la descrita previamente 15 con los siguientes cambios: la adición de antimicóticos y usando dos veces la concentración de antibióticos (para los detalles de los reactivos y equipos específicos, ver Liº de Materiales). Nota: La concentración de los antibióticos que se utilizó anteriormente (. Moore-Scott, et al 15) fue suficiente para los cultivos de embriones llevaron hasta un 24 período de tiempo hr. Sin embargo, cuando se continuó la cultura más allá de las 24 horas, experimentamos contaminación del cultivo y esto fue controlado con éxito por la duplicación de la concentración del antibiótico. </li><li> Guarde los componentes de los medios a 4 º C o a -20 ° C según las recomendaciones del fabricante. KSR y N-2 Suplemento deben almacenarse en alícuotas a -20 ° C para evitar los ciclos de congelación y descongelación. Golpe de gracia DMEM una vez abierto debe ser utilizada dentro de 30 días de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Antes de su uso, calentar los componentes en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Preparar los medios de comunicación en condiciones estériles. Desinfectar la superficie de todo el equipo y las botellas que contienen los componentes de los medios con un 70% de rociado de alcohol antes de colocarlos en la campana de cultivo. </li><li> Los componentes de medios se pueden mezclar ya sea en un vaso de precipitados estéril o directamente en el sistema de filtro (Corning). Primero se debe agregar el polvo de albúmina para el golpe de gracia DMEM. Mezclar bien agitando suavemente hasta que la albúmina se disuelva completamente. A continuación, añadir el suplemento N-2, KSR y los antibióticos y mezclar bien usando una pipeta. Luego filtrar esterilizar los medios de comunicación utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 micras con succión de vacío. Distribuir el medio en 50 ml tubos cónicos y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. Los medios de comunicación, una vez preparadas se deben usar dentro de 4-5 días para la cultura. </li></ol> 2. Preparación del Equipo de Cultura <ol><li> Esterilizar los frascos de cultivo de vidrio y tapones de goma. Envuelva las botellas de cultivo en una lámina de aluminio y los tapones de goma en un vaso de agua y esterilizar en autoclave. </li><li> Esterilizar la cámara de cultivo (unidad de precisión Incubadora) con 70% de pulverización de alcohol y se calienta a 37 ° C antes de comenzar la cultura. La cámara de cultivo es equipped con un disco de rodadura en el centro que sostiene los frascos de cultivo. El flujo de gas en la cámara está regulada por un medidor de presión y la velocidad de flujo se puede ajustar mediante la observación del flujo de salida de burbujas de aire a través del agua en un tubo de vidrio en el extremo. Este aparato de cultivo botella rodando es una versión modificada del aparato original introducidos por Nueva Cockroft y 17. </li><li> Conectar un cilindro de gas que contiene una mezcla de gases de 95% de O2 / 5% de CO 2 a la cámara de cultivo y ajustar el flujo de gas a &quot;una burbuja de aire por segundo&quot; que da una velocidad de flujo de 50 cc / min y asegura el suministro de oxígeno adecuado para los embriones de cultivo. </li></ol> 3. Embrión de ratón Recogida y preparación para la Cultura <ol><li> Para obtener embriones de ratón de tipo salvaje, hemos utilizado ratones de C57BL/6J y CD-1 (Charles River Laboratories) cepas fondo genético. </li><li> Compruebe los ratones hembra para tapones vaginales cada mañana los días. El mediodía del día de encontrar the tapón vaginal debe ser considerado como E0.5 dpc (días post coito). </li><li> Recoger los embriones de ratón en E10.5 dpc por la eutanasia de los ratones embarazadas siguiendo protocolos estándar. Los ratones fueron sacrificados utilizando un dispositivo de inhalación de CO 2 según lo especificado por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) Directrices para la Eutanasia de los Animales (2013). Para asegurarse de la muerte, la dislocación cervical se realizó después de la exposición al CO 2. </li><li> Pulverizar etanol al 70% en la superficie ventral abdominal para evitar que se pegue de pelo abdominal para los instrumentos. A continuación, abra la cavidad abdominal ventral utilizando un afiladas tijeras contundente de operación y un par de 4-3/4 en microdissecting fórceps para localizar el útero. El uso de un 4 en fórceps microdissecting levantar todo el útero y la separan del cuerpo mediante el corte con una luz de tijeras de funcionamiento en el cuerpo uterino y en las puntas de los cuernos uterinos. </li><li> Enjuagar rápidamente todo el útero en 1x PBS calentó a 37 ° Cpara eliminar cualquier adherencia de sangre hacia el útero y colocar inmediatamente en DMEM calentó a 37 ° C en una placa de Petri. Esterilice los instrumentos en un 70% de pulverización de etanol antes de su uso posterior. Nota: se recomienda el precalentamiento de la soluciones incluyendo la PBS, DMEM y el medio de cultivo y manteniéndolas a 37 ° C durante todo el procedimiento. </li><li> Bajo un microscopio de disección, el útero debe segmentariamente disecado con una luz de tijeras de funcionamiento. Esto da lugar a pequeñas aberturas en cada lado del útero segmentado a través del cual un par de pinzas microdissecting modificados (extremos romos) se puede insertar suavemente para ensanchar la abertura. Esto permite la exposición de la decidua de la placenta, que luego se puede quitar rasgando suavemente con un par de pinzas microdissecting para exponer el saco vitelino parietal (PYS) con la membrana de Reichert. El uso de uno de los bordes de las pinzas perforar suavemente la membrana de Reichert junto con los PYS y separada de la ªe subyacente saco vitelino visceral (VYS) capa para exponer los embriones con VYS intactas. El cono ectoplacentario y los derivados trofoectodermo se pueden eliminar ya sea con la decidua placentaria o con la membrana de Reichert. Se debe tener cuidado para evitar la ruptura de la VYS como los embriones se salgan inmediatamente. </li><li> Los embriones con VYS intactos deben ser transferidos a una placa de Petri que contiene el medio de cultivo se calentó a 37 ° C utilizando una pipeta de transferencia de plástico. Nota: Traslado al medio de cultivo inmediatamente después de la separación del útero ayuda para un mejor desarrollo del embrión en la cultura. </li><li> Una pequeña abertura se debe hacer en el saco vitelino con un par de pinzas microdissecting evitando los vasos sanguíneos principales. Un fuerte par de pinzas se puede utilizar para hacer la abertura por la perforación suavemente en un área adyacente a la región de la cabeza. Alternativamente dos pares de pinzas romas pueden ser usados ​​para sostener el saco vitelino y suavemente romper para hacer una pequeña abertura.Luego ampliar suavemente la abertura mediante la ampliación con las pinzas a un tamaño lo suficiente para que la cabeza embrionaria. La membrana amniótica que está terminando de cerca el embrión se celebrara suavemente lejos del cuerpo y desgarrado utilizando un par de pinzas. La cabeza embrionario y después todo el embrión se deben exteriorizaron suavemente desde el saco vitelino, mientras que el mantenimiento de la integridad de la vasculatura embrionaria con la de la yema de salida 15. Nota: Cualquier daño a la vasculatura del saco vitelino puede afectar potencialmente el desarrollo del embrión en el cultivo. Tales embriones con vasculatura dañada no deben utilizarse para la cultura y pueden ser utilizados para la organización de los embriones que luego pueden ser descartados. </li><li> Criterios de estadificación embrionarias: Examine los embriones bajo el microscopio de disección y agrupar por criterios morfológicos, incluyendo el cuerpo y el tamaño de la cabeza, las extremidades y la morfología de los ojos y el escenario contando el número de somitas (s) durante al menos dos embriones de cada grupo. &lt;strong&gt; Nota: Por lo general, los embriones obtenidos a partir de la misma camada muestran diferencias en el desarrollo en el útero y se diferencian en el tamaño corporal, características morfológicas y número de somitas. Sin embargo, se encontró que los embriones agrupados por nuestros criterios morfológicos generalmente exhiben número somite similares (± 1). Por esta razón, no es necesario contar somitas para cada embrión ya que esto sería retrasar el tiempo para el inicio de la cultura. Nota: No utilizar los embriones que se utilizaron para contar los somitas para la cultura. Contar las somitas después de comenzar el cultivo durante otros embriones con el fin de evitar el retardo de tiempo en el inicio de la cultura. Los embriones que se retrasaron a la cultura después de la separación del útero por lo general presentan un escaso desarrollo. </li><li> La transferencia de los embriones de inmediato a una placa de Petri con medio de cultivo fresco calentado a 37 ° C y llevarlo a la campana de cultivo, donde los embriones de nuevo deben ser transferidos a una placa de Petri con cultur estérilmedios electrónicos antes de ponerlos en los frascos de cultivo con medio para iniciar el cultivo. Nota: Las múltiples transferencias de medios de comunicación para los embriones antes de la cultura ayuda en la prevención de la contaminación como los diferentes pasos de recogida de embriones y la disección se realizaron bajo un microscopio de disección que no fue instalado en la campana de cultivo. Nota: Cuando el tamaño de la camada es grande (&gt; 12 embriones), proceso de la mitad de los embriones y comenzar la cultura o los puso en un plato con medio de cultivo y colocarlo en una incubadora de CO 2 a 37 ° C. Cuando los embriones fueron dejados afuera por períodos más largos (&gt; 35 a 40 min) observamos los latidos del corazón para reducir la velocidad y esto afectará el desarrollo posterior en la cultura. </li></ol> 4. El cultivo de embriones de ratón <ol><li> Abra los frascos de cultivo en autoclave en la campana de cultivo y adecuadamente etiquetarlos. Transferencia de 3 ml de medio de cultivo se calentó a 37 ° C a cada uno de tas botellas y luego los embriones de ratón se deben transferir suavemente en los frascos de cultivo utilizando pipetas de transferencia de plástico estériles. Los frascos de cultivo deben entonces ser tapados con tapones de goma que ayudan a mantener las botellas de cultivo para el disco móvil en el aparato de cultivo. Nota: Los frascos de cultivo con los medios de comunicación se pueden preparar y se colocan en el disco de rodadura del aparato de cultivo antes de la eutanasia de los ratones. Esto acorta el tiempo para la transferencia de embriones en los frascos de cultivo. Nota: Los embriones de ratón se pueden cultivar de forma individual o como cocultivos con dos o tres embriones en la misma botella de cultivo. </li><li> Los frascos de cultivo deben realizarse asépticamente al aparato de cultivo a 37 ° C y herméticamente ellos enganchan en los agujeros en el disco de rodadura con los tapones de goma. Encienda el disco de rodadura para girar a una velocidad constante de 35 revoluciones por minuto (rpm), que permite la flotación libre de la EMBRyos en los medios de comunicación y también ayuda en el intercambio de gases liberados por el tejido embrionario. El gas desde el cilindro conectado a la cámara de cultivo fluye a través del disco de rodadura y los tapones de goma en los frascos de cultivo. </li><li> Cultura de los embriones para 16-40 horas y regularmente comprueban para la salida del gas y la temperatura de la cámara de cultivo. Nota: la manipulación de embriones de ratón en cultivo: Dejad que los embriones consiguen adaptarse a las condiciones de cultivo durante al menos 30 min. Luego los embriones que funcionan mal y que muestra los latidos del corazón débiles pueden ser descartados y los embriones restantes pueden ser utilizados para estudios posteriores de manipulación. Manipulaciones de embriones, tales como 5,9,16 electroporación, microinyección 18, la implantación de bolas 16, el tratamiento de drogas y otros procedimientos se pueden realizar en este momento. Se realizó con éxito la implantación de bolas de agarosa afi-gel tratados con ciertas moléculas de señalización para estudiar su papel en el desarrollo del ojo antes de tiempo. Los embriones después demanipulaciones pueden ser devueltos de nuevo en un medio fresco y continuaron en la cultura. </li><li> Vuelva a colocar los medios de cultivo totalmente con medio fresco a intervalos específicos después de 9-10 horas y 18-19 horas de cultivo en que se continuó el cultivo durante 40 h. Nota: Cultura reemplazo de medios puede no ser necesaria si la cultura es detenido por 16-18 horas. </li><li> Medidas de éxito en la cultura: la supervivencia embrionaria en la cultura debe ser determinado por los latidos del corazón visible y la circulación sanguínea en el cuerpo, mientras que el crecimiento embrionario en la cultura debe ser evaluado por un aumento en el tamaño corporal, el número de somitas y el desarrollo morfológico de la cabeza, las extremidades, el corazón y los ojos. </li><li> En el útero desarrollado embriones en E11.0 dpc (~ 40-41 s) y E12.0 dpc (~ 49-50 s) se debe utilizar como controles para la comparación de los embriones cultivados durante 16-18 horas y 38-40 horas, respectivamente. </li><li> El desarrollo embrionario en diferentes momentos durante el cultivo y para en etapas útero puede CAPTureD bajo microscopio de disección. Software de imágenes al contado se utilizó para capturar las imágenes y luego procesados ​​en el programa de procesamiento de imágenes. </li></ol>

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Nosotros no tenemos intereses financieros en competencia.

Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C. El desarrollo del embrión fuera del útero era críticamente dependientes de varios factores en cada paso durante el procedimiento desde el momento en el útero se aisló a partir de los ratones sacrificados a la finalización de la cultura (Figura 1). El factor más importante que ...

In vitro, utilizando métodos de cultivo de embriones en su conjunto son muy adecuados para estudiar los mecanismos involucrados en la organogénesis embrionaria que son difíciles de acceder en el útero de señalización. Embriones enteros proporcionan la integridad de los tejidos y el apoyo adecuados para las interacciones de tejidos que son cruciales para la aparición oportuna de los mecanismos esenciales de señalización para diferentes procesos celulares durante la organogénesis. Mientras que los cultivos de embriones enteros proporcionan una plataforma para una gran cantidad de aplicaciones, tales como estudios de trasplante, las manipulaciones genéticas y de tejidos, estudios de implantación del grano, los estudios toxicológicos, etc., Los sistemas de cultivo de embriones utilizados actualmente son principalmente dependientes de suero para el crecimiento y mantenimiento de los embriones en la cultura de 1-9. El suero se ha utilizado como uno de los principales componentes que van desde 10-100% de los medios de cultivo 6-8, 10, 11.; Sin embargo, la composición de suero no está bien definida y puede variar de animal a animal y cada vez que se recogió el suero. Si bien la preparación de laboratorio de suero es mucho tiempo e implica procedimientos estrictos, suero adquirido comercialmente exhibe una gran variabilidad entre los distintos lotes y aumenta los costes de experimentación. Sumado a esto, el suero puede contener factores desconocidos, tales como factores de crecimiento, hormonas u otras proteínas, que pueden afectar potencialmente el resultado de ciertos experimentos, especialmente aquellos que involucran el estudio de las moléculas de señalización importantes en las interacciones de tejidos. Los estudios han demostrado que la adición de suero a la cultura puede potencialmente alterar los niveles intracelulares de ciertas moléculas de señalización tales como monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y de las proteínas implicadas en la señalización mitogénica y la fosfoinositida 3 (PI-3)-quinasa vías de señalización 12-14. Contrariamente a esto, un sistema de cultivo libre de suero proporciona las ventajas de ambiente libre de antígenos,abstinencia de enzimas biológicamente activas que pueden alterar los procesos celulares y permite la coherencia entre experimentos. En el presente estudio, se utilizó un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado a la cultura de la etapa de mediados de la gestación de embriones enteros en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C 15,16. Los embriones de ratón cultivados durante 16 a 40 h bajo estas condiciones definidas exhiben la progresión en el desarrollo morfológico de cuerpo y diferentes estructuras embrionarias generales tales como el corazón, las extremidades, el cerebro y los ojos que indica los niveles apropiados de la proliferación celular, la migración, la diferenciación y las interacciones de tejido. El análisis molecular del desarrollo embrionario en el cultivo para uno de los sistemas de órganos complejos como el ojo reveló el desarrollo ocular para ser consistente con la observada en el tejido ocular en EMBRyos en desarrollo en el útero (Kalaskar y Lauderdale, en preparación). Por lo tanto nos muestran que los embriones de ratón en cultivo en la etapa mitad de la gestación, exhiben crecimiento progresivo y el desarrollo morfológico comparable a la observada en los embriones en desarrollo en el útero.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td>Stock: 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td>Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 &#181;g/ml; Amphotericin (250&#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Incubator Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td>
			<td>Id.No. 840-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottles for Rotating Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Rubber Cork</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2/5% CO2 Cylinder</td>
			<td>AirGas Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV6 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td>
			<td>Model: Nu-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IsoTemp205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Balance</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>AG285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube &#8211; 50ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Operating Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Sharp-Blunt Scissors&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps &#8211; 4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) &#8211; 4-3/4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5/45)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5060</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (55)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5063</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray Lid</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087571Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-aid Pipetter</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td>D57849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette-10ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipette-25ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette - 7.7ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron utilizando un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado en un sistema de cultivo de botella de laminación oxigenada. Los embriones de ratón en E10.5 fueron cuidadosamente aislados del útero con saco vitelino intacto y en un proceso que implica la maniobra quirúrgica precisa los embriones se exteriorizaron suavemente desde el saco vitelino, mientras que el mantenimiento de la continuidad vascular del embrión con el saco vitelino. En comparación con los embriones preparados con saco vitelino intacto o con el saco vitelino se eliminan, estos embriones exhiben tasa de supervivencia superior y la progresión del desarrollo cuando se cultivan en condiciones similares. Se demuestra que estos embriones de ratón, cuando se cultivan en un medio definido en una atmósfera de 95% O 2/5% de CO 2 en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C durante 16-40 horas, muestran un crecimiento y desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero. Creemos thes el método será útil para los investigadores que necesitan para utilizar el cultivo de embriones conjunto para estudiar las interacciones de señalización importantes en la organogénesis embrionaria.

Desarrollo de embriones de ratón depende fuera del útero de múltiples factores a partir de la hora del útero está aislado del cuerpo a la vez que los embriones se cultivan. Como se representa en la Figura 1, el procedimiento implica una serie de etapas que incluyen, la separación del útero grávido del cuerpo (Figura 1A), el aislamiento de los embriones con saco vitelino intacta (Figura 1B), exteriorización de los embriones desde el saco vitelino ( <str...

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Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

El suero utilizado en los cultivos de embriones contiene componentes desconocidos que pueden afectar el resultado de los experimentos sobre todo en los estudios que involucran interacciones de señalización. Aquí hemos utilizado un sistema de cultivo oxigenada libre de suero y mostramos que los embriones mitad de la gestación de ratón en cultivo de 16-40 horas exhiben desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero.

Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K vistas.  University of Georgia.  El suero utilizado en los cultivos de embriones contiene componentes desconocidos que pueden afectar el resultado de los experimentos sobre todo en los estudios que involucran interacciones de señalización. Aquí hemos utilizado un sistema de cultivo oxigenada libre de suero y mostramos que los embriones mitad de la gestación de ratón en cultivo de 16-40 horas exhiben desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero. 

Video: Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

La cultura y el mantenimiento de células estaminales embrionarias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Investigación

Biología

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

Cultura de embriones de ratón de pulmón, un sistema para evaluar los mecanismos moleculares de la ramificación

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo</emPollo> Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

El método de cultivo de embriones de roedores enteros utilizando el sistema de tipo de botella rotador Cultura

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Sistema de célula cerrada Cultura protocolo mediante buques HyperStack con la tecnología de materiales permeables al gas

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema de Cultura para estudiar el desarrollo de la tiroides

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades