We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.

<ol>
	<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoding+in+Bacteriophages.">Recoding in Bacteriophages.</a> Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).</li><li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+uncultured+marine+viral+communities.">Genomic analysis of uncultured marine viral communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).</li><li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+population+structure+of+a+near-shore+marine-sediment+viral+community.">Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community.</a> Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+metagenomic+profiling+of+nine+biomes.">Functional metagenomic profiling of nine biomes.</a> Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).</li><li>Vega Thurber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+indicates+that+stressors+induce+production+of+herpes-like+viruses+in+the+coral+Porites+compressa.">Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).</li><li>Pedulla, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+highly+mosaic+mycobacteriophage+genomes.">Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes.</a> Cell. 113 (2), 171-182 (2003).</li><li>Calendar, R., Abedon, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The bacteriophages. , (2006).</li><li>Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+nearly+identical+phage-encoded+DNA+sequences.">Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences.</a> FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).</li><li>Klenk, H. -. P., Palm, P., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Dependent+RNA+Polymerases+as+Phylogenetic+Marker+Molecules.">DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules.</a> Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).</li><li>Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+Vast+Diversity+of+Marine+Viruses.">Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses.</a> Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).</li><li>Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+ecosystems:+bacterial+photosynthesis+genes+in+a+virus.">Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus.</a> Nature. 424 (6950), 741 (2003).</li><li>Mann, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+S-PM2,+a+&#8220;photosynthetic&#8221;+T4-type+bacteriophage+that+infects+marine+Synechococcus+strains.">The genome of S-PM2, a &#8220;photosynthetic&#8221; T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains.</a> Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).</li><li>Lindell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+photosynthesis+genes+to+and+from+Prochlorococcus+viruses.">Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).</li><li>Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+organization+of+the+psbAD+region+in+phages+infecting+marine+Synechococcus+strains.">Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).</li><li>Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Prochlorococcus+cyanophage+genomes:+signature+features+and+ecological+interpretations.">Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations.</a> PLoS biology. 3 (5), e144 (2005).</li><li>Rohwer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genomic+sequence+of+the+marine+phage+Roseophage+SIOI+shares+homology+with+nonmarine+phages.">The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages.</a> Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).</li><li>Miller, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+broad-host-range+vibriophage+KVP40:+comparative+genomics+of+a+T4-related+bacteriophage.">Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage.</a> Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).</li><li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+auxiliary+metabolic+genes+and+the+redirection+of+cyanobacterial+host+carbon+metabolism.">Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).</li><li>Paterson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+coevolution+accelerates+molecular+evolution.">Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution.</a> Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).</li><li>Seguritan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+neural+networks+trained+to+detect+viral+and+phage+structural+proteins.">Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins.</a> PLoS computational biology. 8 (8), e1002657 (2012).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+for+Enterobacteria.">Culture Medium for Enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+expression+of+the+P(BAD)+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter.">Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).</li><li>Cuevas, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+genomic+gaps+using+phenotypic+profiles.">Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles.</a> F1000Research. , (2014).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van&#8217;t Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TagCleaner:+Identification+and+removal+of+tag+sequences+from+genomic+and+metagenomic+datasets.">TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets.</a> BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).</li><li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+and+preprocessing+of+metagenomic+datasets.">Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).</li><li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+identification+and+removal+of+sequence+contamination+from+genomic+and+metagenomic+datasets.">Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets.</a> PloS One. 6 (3), e17288 (2011).</li><li>Welch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+parameters+to+control+synthetic+gene+expression+in+Escherichia+coli.">Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli.</a> PloS One. 4 (9), e7002 (2009).</li><li>Fiehn, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+for+plant+metabolomics:+reporting+MSI-compliant+studies.">Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies.</a> The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).</li><li>Zeng, Q., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+viruses+exploit+their+host&#8217;s+two-component+regulatory+system+in+response+to+resource+limitation.">Marine viruses exploit their host&#8217;s two-component regulatory system in response to resource limitation.</a> Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).</li><li>Shindy, W. W., Smith, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+plant+hormones+from+cotton+ovules.">Identification of plant hormones from cotton ovules.</a> Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).</li><li>Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+metabolism+of+salicylic+acid.">Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).</li><li>Chappell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Isoprenoid+Metabolism.">The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism.</a> Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(a+complete+set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research.</a> DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Baran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+footprinting+of+mutant+libraries+to+map+metabolite+utilization+to+genotype.">Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype.</a> ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A continuación, presentamos los enfoques Phenomic para la caracterización funcional de genes de fagos putativos. Las técnicas incluyen un ensayo desarrollado capaz de metabolismo anabólico monitoreo anfitrión, las placas de ensayo Multi-fenotipo (mapas), además de el método establecido de la metabolómica, capaz de efectos a metabolismo catabólico de medición. Proporcionamos herramientas adicionales para gestionar los grandes conjuntos de datos resultantes de estas tecnologías, lo que permite el procesamiento de alto rendimiento y análisis 24. Por último, a través de la comparación de una proteína de la cápside del fago anotada, tiorredoxina fago, dos genes de fagos metabólicos putativos, y la respuesta experimental promedio proponemos diversas estrategias para interpretar ambos conjuntos de datos y clases de genes, con énfasis en la identificación de las tendencias fenotípicas y la identificación de los valores atípicos. Como se ha mencionado, ambos enfoques medir cuantitativamente sólo la mitad del metabolismo de host. Para interpretar la función relativa de cualquiera de lasnuevas proteínas que se investigan, se requiere los datos de ambos métodos para proporcionar evidencia de la función. Si bien esto no es un foco de nuestro manuscrito actual, salidas de datos de cada método phenomic se someten a análisis combinatorios que se centran en técnicas de agrupamiento como el bosque al azar y análisis de componentes principales. Por otra parte, las hipótesis resultantes del análisis combinado deben ser posteriormente validados por metodologías genéticos tradicionales. Por último, los métodos presentados están fuertemente influenciados por la fisiología bacteriana y, por tanto, seguir las mismas normas. Al llevar a cabo cualquiera de los métodos, las consideraciones deben hacerse para asegurar grupos independientes, clonales están experimentado con; se evita la contaminación; una sola variable se está probando; y los controles adecuados se están corriendo al mismo tiempo. El fracaso para tener en cuenta estos puntos dará lugar a resultados poco claros, similar a cualquier ensayo fisiológico. Las placas de ensayo Multi-fenotipo(MAP) El desarrollo de MAP ofrece un alto rendimiento y ensayo de adaptación en comparación con las tecnologías disponibles en la actualidad (Figura 5A y Tablas 1,2). El ensayo utiliza suministros, equipos y técnicas fundamentales disponibles en todos los laboratorios de microbiología. La incorporación de un oleoducto computacional, PMAnalyzer 24, para su posterior procesamiento y análisis de datos asegura la interpretación de datos rápida. Además, tanto los aspectos experimentales y analíticos del enfoque se puede ajustar o sintonizados con fines personalizados fácilmente. Por ejemplo, si una gran parte de los datos que no logra pasar el filtrado se indica en la sección 4, se puede tamizar manualmente a través de las curvas de crecimiento para identificar problemas. Si el problema surge debido a estrictos parámetros de filtro, se pueden hacer ajustes en el guión. Alternativamente, si los problemas están asociados con el proceso experimental (es decir, la condensación prolongada; inadecuada transferencia de cel bacterianals, etc.), entonces repeticiones adicionales se pueden repetir fácilmente. Como se describe en Cuevas et al. 24, el PMAnalyzer es un solo programa bash escrito como un guión envoltorio que ejecuta los scripts de análisis y análisis como, tubería automatizada cohesiva. Todos los guiones son de libre acceso desde un repositorio Git a 25, tomando el valor medio para cada punto de tiempo a través de los datos por triplicado, y posteriormente se parametriza la curva logística para obtener el tiempo de retardo, la tasa de crecimiento máximo, asíntota, y una novela plazo, nivel de crecimiento. El valor de la mediana fue elegido sobre la media en nuestro estudio para reducir el efecto de grandes valores atípicos, sin embargo, la secuencia de comandos se puede adaptar fácilmente para calcular la media de los datos replicados. Debido a la variación reducida (SE) visto a través de los datos replicados (Figura 2A) mantuvimos el uso de la mediana en el PMAnalyzer para el ajuste de una curva logística. Además, el corte para el crecimiento en este estudio (GL ≥ 0,4) fue determined comparando cómo los datos separados en todo nivel de crecimiento y tasa de crecimiento máxima (Figura 1A, B). Dependiendo del sistema de instrumentos y el modelo utilizado este término puede variar, lo que requiere una redefinición de este valor de corte. Una ventaja importante de nuestro ensayo es la capacidad de comparar fenotipos utilizando un único parámetro que caracteriza el crecimiento microbiano en general, que definimos como nivel de crecimiento (GL). GL es una media armónica, y por lo tanto mitiga los efectos de grandes valores atípicos en los datos. El uso de una media armónica con los valores logísticos equipado desplazado para proporcionar un resumen de crecimiento se llegó a través de ensayo y error. Otros métodos intentaron diferenciar el crecimiento incluye: tiempo que tardó en llegar a los parámetros específicos de la curva (media μ max, μ max, y capacidad de carga), el coeficiente de determinación (R 2), y combinaciones de los R 2 multiplicado por parámetros de la curva específicos. Usando una media armónica con desplazadovalores logística-ajuste para el GL proporcionan el rango mayor en la evaluación de crecimiento, por lo que se convirtió en el método de elección. Una consideración a tener en cuenta es que los patrones de la curva de crecimiento dinámicos tienen el potencial de estar perdido cuando se utiliza un solo parámetro o un modelo ajustado. Por ejemplo, los parámetros de la curva individuales de la curva logística y el GL son incapaces de representar el crecimiento bifásica. En un entorno de carbono solo, este efecto sobre el crecimiento implica la mediación de la proteína viral en cualquiera de conversión del sustrato o cambio en la utilización de sustratos. Efectos adicionales potencialmente perdidos al no considerar múltiples parámetros de crecimiento incluyen: tiempo de latencia prolongada, proponiendo un aumento de la carga viral de la maquinaria o productos; acelerando rápidamente la fase exponencial, lo que sugiere proteínas virales acopladas a acoger las vías de producción de energía; niveles o superiores de formación de la biomasa, lo que implica apoyo viral en la absorción de nutrientes anfitrión y el anabolismo (datos no mostrados). Por lo tanto, el trazado de las curvas de crecimiento nacientes ( <strong&gt; Figura 2A, B) proporciona información sobre tendencias en el tiempo mientras que el GL tiene en cuenta las principales variables del modelo logístico, proporcionando un único número cuantitativa para representar el éxito global de un clon. Al considerar las diferentes respuestas aportadas por los genes estructurales y metabólicos en los mapas, se observa que las diferentes clases de sustrato en cuestión proporcionan la evidencia más grande para la función de la proteína. Por ejemplo, las proteínas metabólicas están a menudo asociados con la adquisición de nutrientes limitantes, que son inespecíficos para acoger 16,32 metabolismo central. Los experimentos preliminares MAP revelar que los clones que albergan genes putativos de fagos metabólicos tienen un aumento de la fase de retardo cuando se cultivan en fuentes de carbono metabolismo central (Figura 2a). Por el contrario, los clones que llevan genes estructurales putativas, que requieren una gran proporción de las piscinas de energía anfitrión y dNTP, dan lugar a una respuesta positiva falsa en el crecimiento de cientosustratos de carbono metabolismo RAL y de aminoácidos. Esto es probablemente debido a la acumulación de proteínas insolubles resultantes en filamentation huésped y / o cuerpos de inclusión, como se observa a través de microscopía (Figura 2A y datos no mostrados). Si bien se requiere un mayor análisis para validar estos resultados preliminares, los mapas son capaces de recuperar las respuestas fenotípicas que se correlacionan con la hipótesis de las funciones de clases de genes de fagos específicos. Además de la elucidación de las proteínas virales desconocidos, los mapas son un recurso novedoso para investigar la diversidad funcional y metabólica de una bacteria individuo o una comunidad de bacterias. Componentes del PAM están diseñados para la alteración fácil de apoyar el crecimiento de una gama de bacterias; incluyendo marino, auxotrófica y microbios anaeróbicos. Para facilitar estos esfuerzos la basal y pre-crecimiento de los medios definidos requieren especies químicas adicionales o ajustados antes de que un género bacteriano diferente se puede apoyar en los mapas.Una nota en este uso de los mapas es mantener medios definidos, que prohíbe el uso de ingredientes tales como triptona, extracto de levadura y peptona. Metabolómica El campo de la metabolómica es dependiente de las bases de datos de metabolitos, que incluyen metabolitos aislados identificados por espectrometría de masas. La facilidad de la base elegida aquí tiene una de las mayores bases de datos de la metabolómica. Curiosamente, más de la mitad de los metabolitos resultantes de nuestras experimentaciones eran identificables (~ 65%), mientras que otros habían nunca antes se han registrado en nuestro anfitrión, Escherichia coli (ejemplos incluyen: el indol 3 acético 33, ácido salicílico 34, y ácido dihidroabiético 35). Este hecho podría atribuirse a ya sea un fuerte sesgo de la base de datos hacia metabolitos de plantas, o las proteínas específicas bajo investigación. Independientemente, el resultado es un número limitado de metabolitos conocidos disponibles para la representación y el análisis de datos. En el futura, múltiples métodos metabolómica utilizando diversas bases de datos permitiría una mayor cobertura metabolito. En la actualidad, ambos conocidos y metabolitos desconocidos se utilizan al comparar y contrastar nuestras proteínas virales novedosos. Con este enfoque, la hipótesis de que los clones que albergan proteínas funcionalmente similares compartirán una mayor similitud en su perfil metabolómico completa. El análisis preliminar metabolómica reveló que mientras que los genes estructurales y metabólicas no se separan claramente una de otra, aquellos genes que exhiben efectos similares en el anfitrión cuando se sobreexpresa se ​​correlacionan (Figura 6). Por ejemplo, la cápside grupos de genes anotados en estrecha colaboración con los genes metabólicos putativos de relieve en este estudio, EDT2440 y EDT2441. Las investigaciones utilizando un programa predictor topología transmembrana y péptido señal disponible públicamente mostraron evidencia de que ambos genes metabólicos putativo albergan un único dominio transmembrana. Curiosamente 5 de THe 9 clones en el primer grupo de clústeres (porción del dendrograma más a la izquierda) han pronosticado dominios transmembrana utilizando el mismo programa de topología. Se necesitan más investigaciones, sin embargo, es probable que los metabolitos presentes durante la sobreexpresión de estos clones están asociados con la respuesta al estrés celular resultante de la membrana o cargas estructurales. Esta evidencia apoya que mientras que los datos de la metabolómica posee una mayor cantidad de ruido, el método es capaz de poner de relieve las señales que diferencian a efectos generales de genes, tanto dentro ya través de una clase de genes. Para determinar si el método es capaz de extraer información específica de la función génica, los metabolitos se agruparon en vías metabólicas específicas. El ser hipótesis, si un clon afecta metabolitos específicos a una sola vía, a continuación, el gen sobreexpresado está activo en esa vía. Antes de la creación de nuestra línea de aseguramiento de la calidad metabolómica, los datos preliminares revelaron que más de unad metabolitos menos representados eran típicamente &quot;desconocido&quot;, que proporciona poca información sobre las vías que están asociados (datos no mostrados). Metabolómica datos preprocesados, sin embargo, revela que la mayoría de los perfiles de metabolitos son similares y sólo un número selecto de las abundancias de metabolitos desconocidos y conocidos varía en los diferentes clones, por ejemplo putrescina y uracilo (Figura 6). Para proporcionar una mayor resolución de los esfuerzos de la función de proteínas se están realizando para comparar experimentalmente los nuevos genes de fagos contra genes de fagos conocidos, que se pueden utilizar para rellenar los &quot;huecos&quot; de metabolito basados ​​caracterización funcional. Usando esta técnica, la función asignada de genes virales conocidos proporciona una referencia para la función de los genes desconocidos. No obstante, el factor limitante del análisis metabolómica es el tamaño y la relevancia de la base de datos. Para corregir estas limitaciones, bases de datos metabolómicos relacionables a esta investigación deben desarrollarse; talcomo una base de datos de metabolitos y sus abundancias específica a la colección ASKA de E. clones de E. coli en los que un ORF se sobreexpresa 36. La evidencia de la necesidad de este tipo de bases de datos fue proporcionada en 2013 cuando los investigadores del Laboratorio Nacional Lawerence Berkeley compilados la primera base de datos completa de los metabolitos específicos para bibliotecas enteras de bacterias mutantes modelo 37. Esta investigación proporciona una visión novedosa en los genes necesarios para la utilización de los metabolitos específicos, revelando la conexión clara entre fenotipo y genotipo. Al considerar la metabolómica como una herramienta, es importante definir el régimen de procesamiento siguió en las instalaciones de la base. Un artefacto de la mayoría de los procedimientos experimentales es la varianza del día a día relacionados con los instrumentos de uso. Hasta la fecha todos los análisis GC-MS implementa el uso de las normas internas que se incluyen en cada serie analítica; Sin embargo, la adición de muestras internas específicas del proyecto &lt;/ Em&gt; corrieron cada día de la experimentación elimina varianza adicional. Estas consideraciones deben ser abordados con antelación para evitar problemas de normalización y sesgos. Otra solución es procesar todas las muestras en una instalación de núcleo en la misma máquina y como un solo lote, una opción disponible en cualquier tipo de núcleo. Las diversas herramientas tanto introducen y re-exploran en este manuscrito proporcionar nuevos medios para detectar y caracterizar los genes de fagos funcionalmente desconocidos. La simplicidad y la adaptabilidad de las técnicas experimentales con el uso de tuberías de línea de corriente computacionales asegura estos métodos son aplicables a una amplia gama de esfuerzos de investigación y campos. Nuestro objetivo es que los enfoques Phenomic presentados aquí ayudarán a nuevas investigaciones de las proteínas de fagos nuevos, además de los sistemas que son igualmente funcionalmente definido.

Se estiman virus que infectan bacterias (bacteriófagos o fagos aka) de existir en más de 10 31 partículas similares a virus (VLPs) a nivel mundial y superan en número a todos los otros organismos en un entorno de 1,2. El primer estudio metagenómica investigar las comunidades virales asociados a ambientes marinos se centró en la cuantificación de la diversidad visto dentro de la fracción viral 3. Además, Breitbart y sus colegas encontraron que más del 65% de las secuencias virales de la comunidad compartió ninguna homología con cualquier secuencias disponibles en bases de datos públicas. Estudios de metagenómica posteriores encontraron pruebas similares: metagenomes de sedimentos marinos en San Diego, California contienen 75% de secuencias virales desconocidas 4; metagenomes de lagos hipersalinos del Mar Salton contienen 98% de secuencias virales desconocidas 5; y metagenomes coral asociadas contienen 95-98% secuencias virales desconocidas 6. Esta acumulación de información unannotated ha dado lugar amaterial genético del fago ser &quot;la materia oscura del universo biológico&quot; 7. Caracterización genómica de fago se basa en la identificación de similitud de secuencia a través de la comparación con bases de datos de ácidos nucleicos y proteínas existentes. Debido a que la información genética del fago codificada es predominantemente desconocido, los métodos basados ​​en homología son ineficaces. Dentro de su genoma, fagos normalmente codifican tres principales tipos de genes: transcripción y replicación de genes, genes metabólicos, y los genes estructurales. Los genes de transcripción y replicación (clase I / II genes 8) incluyen polimerasas, primasas, endo / exo-nucleasas, y quinasas. Estos genes están muy conservadas debido a su importancia en la infección por fagos, transcribir y replicar material genético del fago. Polimerasas de fagos se identifican fácilmente usando métodos de homología de secuencia tradicionales debido a su conservación global 9 y se ha demostrado para servir como marcadores filogenéticos eficaces 10.Por el contrario, metabólicas fago y los genes estructurales (clase II / III genes 8) son cada vez más divergentes ya menudo anotada como genes hipotéticos. Genes metabólicos fagos afectan la capacidad metabólica del huésped y no se requieren necesariamente para la replicación viral. Estos genes, a menudo denominados genes metabólicos como auxiliares 11 (AMG), parecen modular el metabolismo de acogida y permitir la progresión óptima de la infección y el éxito de la maduración del virión. AMG se han asociado con la utilización y absorción de nutrientes limitantes o en vías de producción de energía. Algunos ejemplos incluyen genes fotosistema se encuentran en los genomas de diversos cyanophage 12-16, genes conectados a y regulados por el metabolismo del fosfato 17,18, y la utilización de la vía de las pentosas fosfato para la biosíntesis de dNTP fago 18,19. En comparación, los genes estructurales se encuentran entre los mediados a finales de los genes producidos durante la infección y varía en los diferentes fago-hosistemas st. La producción de proteínas estructurales dependen de la disponibilidad de dNTP viral, y las piscinas de energía para su transcripción, traducción y montaje 8. Las proteínas de la cápside y fibra cola estructural se considera como la más divergente de todos los genes que codifican proteínas virales y son necesarios para la producción de viriones éxito. Su divergencia se suele atribuir al papel activo que desempeñan en la conformación de la coevolución virus-huésped 20. Proteínas divergentes, independientemente de la clase de genes, se pasan por alto fácilmente cuando se utilizan técnicas de homología y la secuencia de alineación tradicionales. Un esfuerzo para corregir las limitaciones observadas con estrictas comparaciones de secuencias ha resultado en herramientas bioinformáticas capaces de utilizar características de secuencia para determinar asociación, tales como redes neuronales artificiales 21. Redes neuronales artificiales (RNA) permitir la predicción de genes estructurales y metabólicas, sin embargo, requieren la validación experimental de aguas abajo para caracterizar directamentela función del gen. El objetivo de este manuscrito es proporcionar protocolos phenomic capaces de controlar tanto el metabolismo catabólico y anabólico de una bacteria huésped durante la expresión de un nuevo gen de fago, predijo funcionalmente a través de RNAs. El campo de la fenómica, la biología asociado con fenotipos celulares, está bien establecida en la biología de sistemas para ayudar en la investigación de proteínas con función desconocida o pleiotrópicos. Herramientas Phenomic se utilizan para vincular la información fenotípica a la información genotípica. Nuestra hipótesis de los genes putativos de fagos que su función (s) se puede determinar a través de la observación de los efectos fisiológicos de acogida durante la expresión de genes del fago. Para investigar esta hipótesis, se seleccionaron dos métodos cuantitativos. Las placas de ensayo Multi-fenotipo (mapas) se usaron para supervisar la utilización de sustrato huésped y la subsiguiente formación de la biomasa mientras que la metabolómica midieron diversidad metabolito anfitrión y abundancia relativa durante el crecimiento en environ específicacondiciones mentales. Proteínas estructurales y metabólicas putativos se sobreexpresa en Escherichia coli y resultados representativos de ambos experimentos se comparan. Se presentan numerosas técnicas visuales y tuberías de procesamiento de alto rendimiento para facilitar la replicación experimental. Por último, la reproducibilidad y exactitud de los métodos presentados se discuten en el contexto de efectos fisiológicos esperados para una proteína de la cápside y anotada proteína metabólica fago, tiorredoxina, además de dos AMGs putativos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Sterivex Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m SteriCap Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS02RE</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Omnipore membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JHWP02500</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well micro-titer plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-764</td>
			<td>Standard F-Bottom 96 well Microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Seal Plate Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4inch Panel Mount Lock Nut, black nylon&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45509-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb&#160; 1/16inch&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb, 1/8inch</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer Integral Lock Ring to 500 Series Barb, 1/16inch ID tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45505-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed Bulkhead Fittings 1/4inch OD&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6149-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/16inch ID x 1/8inch OD&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/4inch OD x 1/8inch ID&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Flow Mini Pump (Peristaltic pump)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Velp Scientifica</td>
			<td>F203A0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-141</td>
			<td>&#160;Millipore* Filter Forceps&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-plate spectrophotometer plate reader</td>
			<td>Molecular Devices Analyst GT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;XX10 025 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python version 2.7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.python.org/">http://www.python.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyLab module</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.0.1&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://had.co.nz/reshape">http://had.co.nz/reshape</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://ggplot2.org/">http://ggplot2.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Composer</td>
			<td>PSI Tech Portal</td>
			<td></td>
			<td>http://www.genecomposer.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Services:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West Coast Metabolomics Center</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.dna20.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage phenomics: physiological approaches to characterize novel viral proteins

Las investigaciones actuales en las interacciones huésped-fago dependen de extrapolar el conocimiento de (meta) genomas. Curiosamente, el 60 - 95% de todas las secuencias de fagos no comparten ninguna homología con proteínas anotado actuales. Como resultado, una gran proporción de genes de fagos anotados como hipotético. Esta realidad afecta en gran medida la anotación de ambos genes metabólicos estructurales y auxiliares. Aquí presentamos métodos Phenomic diseñados para capturar la respuesta (s) fisiológica de un host seleccionado durante la expresión de uno de estos genes de fagos desconocidos. Multi-fenotipo placas de ensayo (mapas) se utilizan para controlar la diversidad de la utilización de sustratos de acogida y formación de la biomasa posterior, mientras que la metabolómica proporciona un análisis bi-producto mediante el control de la abundancia metabolito y la diversidad. Ambas herramientas se utilizan simultáneamente para proporcionar un perfil fenotípico asociado con la expresión de un marco de lectura abierto putativo fago individual (ORF). Los resultados representativos para ambos métodos se comparan, highlighting las diferencias fenotípicas perfil de un anfitrión que lleva ya sea putativos genes de fagos estructurales o metabólicas. Además, se presentan las técnicas de visualización y de alto rendimiento tuberías computacionales que facilitan el análisis experimental.

Watch this Scientific Journal Video about Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins at JoVE.com

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenómica fagos: enfoques fisiológicos para caracterizar Novela Virales Proteínas

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K vistas.  San Diego State University. Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Video: Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Enfoques Forward genéticos en<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Selección de ensayos para caracterizar nuevos reguladores endoteliales implicados en la respuesta inflamatoria

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.