1. Mutagénesis química Nota: Se encontró que la forma replicativa RB es más susceptible a la mutagénesis química que forma EB. A mitad del ciclo (entre 18 a 20 años hpi), RBS se encuentran en los grandes números anteriores a la transición RB-EB. Debido a Chlamydia trachomatis es un patógeno intracelular obligado, los efectos de la mutágeno sobre la salud del huésped pueden limitar la recuperación bacteriana. Se encontraron células Vero a ser más resistentes a los efectos adversos de altos niveles de ccsme que otras líneas celulares ensayadas. La segregación de las mutaciones de recombinación requiere la selección de la progenie recombinante resistente a los antibióticos. Se recomienda el uso de cepas resistentes a los medicamentos (por ejemplo, rifampicina, espectinomicina, o trimetoprim) para la generación de mutantes de la capacidad de realizar análisis recombinante y para aislar cepas isogénicas. Cepas resistentes a los antibióticos fueron generados por un proceso de selección paso a paso (15, 16). Noe: Chlamydia trachomatis (cepa L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) es BSL2 patógeno. Consulte los procedimientos operativos estándar (SOP institucionales) para el manejo de estos patógenos. <ol><li> Preparación de células cultivadas y la infección: <ol><li> Seed aproximadamente 1 10 6 células Vero (ATCC CCL x-81) por 25 cm 2 (T25) en matraz de 3 ml de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. Las células deben formar una monocapa confluente dentro de 24 h. </li><li> Aspirar medio. Infect matraces T25 confluentes de células Vero con clamidia a una multiplicidad de infección (moi) de 5 (~ 14 x 10 6) en un volumen total de 3 ml de medio (DMEM, 200 ng / ml de cicloheximida, 10% de FBS). </li></ol></li><li> Comience mutagénesis en 18 horas después de la infección (hpi): <ol><li> Preparar 20 mg / ml ccsme (metanosulfonato de etilo) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,9 mM de calcioy cloruro de magnesio 0,49 mM en una campana de seguridad química como EMS es un líquido volátil. Nota: EMS es un mutágeno y carcinógeno potente. Neutralizar el ccsme residuos y descontaminación de derrames, plástico, papel y vidrio con hidróxido de sodio 1 M. </li><li> Aspirar el medio y lavar las células una vez con 3 ml de PBS / MgCl 2 / CaCl2. Se incuban las células con 3 ml de 20 mg / ml de EMS en el PBS / MgCl 2 / CaCl2 durante una hora en la campana de humos a temperatura ambiente. Células Vero son capaces de sobrevivir a esta concentración de EMS y las condiciones fuera de la incubadora por períodos cortos. Recuerde incluir una muestra de control que no ha sido mutagenizado. </li><li> Retire medio que contiene EMS y colocarlo en un recipiente con NaOH 1 M para inactivar el mutágeno. Lavar las células infectadas por 3 veces en 3 ml de PBS + MgCl 2 / CaCl2 para eliminar mutágeno residual. Añadir 6 ml de DMEM/10% de FBS con 200 ng / ml de cicloheximida y 25 g / ml de gentamicina, y se incuba a 5% de CO <sub&gt; 2, 37 ° C durante 48-72 h. Las inclusiones aparecen desprovisto de bacterias alrededor de 36 horas después de la mutagénesis. A las 72 h sobre 10% de las inclusiones están llenos de bacterias, mientras que el resto permanece vacía. </li><li> Extraer EBs por lisis hipotónica: Completamente aspirar medio. Añadir 1,0 ml de H 2 O y el rock para desalojar las células durante 10 min. Lisar las células por pipeteo hacia arriba y hacia abajo por al menos 10 veces. Recoger lisado en una microcentrífuga y añadir 0,250 ml de 5x tampón de sacarosa fosfato glutamato (SPG) para llevarlo a una concentración final 1x. Almacenar a -80 ° C. Nota: El nivel de mutagénesis se puede evaluar mediante la inducción de la resistencia a rifampicina. Para ensayar la frecuencia de la resistencia a rifampicina, la placa 1 x 10 x 8 y 7 diluciones en serie de 10 veces de bacterias en la presencia de 200 ng / ml de rifampicina. La frecuencia de la resistencia a rifampicina se define como el número de placas resistentes a rifampicina dividido por el número total de bacterias chapados. Consulte la sección siguiente para obtener instrucciones de placa. </li></ol></li></ol> 2. Aislamiento clonal de Chlamydia trachomatis cepas mutantes de purificación en placa <ol><li> Establecer monocapas confluentes de células Vero en placas de 6 pocillos: Seed ~ 0,4 x 10 6 células en 3 ml DMEM/10% de SFB por pocillo. Permiten a las células para formar una monocapa homogénea en los próximos 24 h. </li><li> Descongele la solución madre de Chlamydia mutado en hielo. Realizar 6 x diluciones seriadas de 10 veces en un volumen total de 200 l por dilución en DMEM/10% de SFB y los establecido en el hielo. Nota: título bacteriana en unidades formadoras de inclusión (IFU) es una buena estimación de las unidades formadoras de placa (ufp). Apunta a la placa 10, 100 y 1000 ufp. </li><li> Lavar las células Vero dos veces con 3 ml de PBS por pocillo. </li><li> Añadir 3 ml de DMEM a cada pocillo para placas de 6 pocillos y 100 l de las diluciones bacterianas en duplicado. Agite la placa para asegurar una mezcla. </li><li> Gira placas infectadas a 2700 xg durante 30 min a 15 ° C y después se incuba a 37 ° C en un humidificado,5% de CO2 durante 1-2 horas. </li><li> Prepare 0,54% de agarosa en DMEM (para 6 pozos): <ol><li> Añadir los siguientes ingredientes: 18,9 ml de DMEM frío 2x, 4,2 ml de FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml de 200 mg / ml de cicloheximida, 0,021 ml de gentamicina 50mg/ml. Mezclar bien. </li><li> Mezclar con 18,9 ml de agarosa al 1,2% / H 2 O estéril caliente, revolviendo para evitar grumos. La mezcla debe estar caliente al tacto. Mantener en un baño de agua caliente a 55 ° C antes de añadir a las células infectadas. </li></ol></li><li> Aspirar suspensión bacteriana de los platos y aplicar 6 ml de agarosa al 0,54% / DMEM por pocillo. Permitir agarosa se solidifique por completo a temperatura ambiente fuera de la campana durante 15 min. Secar las placas con las tapas quitadas, en la campana de bioseguridad durante 15 min. Nota: las vibraciones de la campana de contención biológica puede distorsionar la agarosa solidificación. </li><li> Se incuba a 37 ° C en el incubador de CO2 durante 7-10 días. Las placas deben ser visibles con la ayuda de un microscopio de disección. (Refer a la figura 3 para una imagen típica de las placas.) </li><li> Un día antes del aislamiento de mutantes, semilla de 1 x 10 4 células Vero en 100 l por pocillo en una placa de 96 pocillos. Las células serán confluentes en un plazo de 24 h. </li><li> Utilizando un microscopio de disección, placas marca para ser recogidos. Recoge los tapones de las placas utilizando un estéril 1,0 ml barrera de punta de pipeta. </li><li> Volver a suspender las placas en 100 l de DMEM suplementado con 10% de FBS, 400 ng / ml de cicloheximida, 50 mg / ml de gentamicina. </li><li> Para ampliar las cepas mutantes, superponer la suspensión sobre monocapas confluentes de células Vero. Girar las placas a 2700 x g, 15 º C durante 30 min. </li><li> Se incuba a 37 ° C / 5% de CO 2 humidificado en una incubadora. Harvest EBS cuando&gt; 50% de las células están infectadas, lo que puede ocurrir tan pronto como 48 hpi y tan tarde como 14 días. Esta cantidad de células infectadas permite que las bacterias viables suficiente para ser almacenados. Las cepas mutantes difieren en las tasas de crecimiento y la infectividad. Permitir estirpes de crecimiento lento que naturally volver a infectar a las células vecinas hasta que suficientes células están infectadas. </li><li> Extraer EBs por lisis hipotónica de las células infectadas: <ol><li> Completamente aspirar el medio. </li><li> Añadir 160 l de agua estéril. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Disrupt células pipeteando arriba y abajo varias veces para asegurar la lisis completa, utilice los consejos de barrera para evitar la contaminación cruzada. </li><li> Transferir 160 l de lisados ​​a tubos de microcentrífuga. </li><li> Mezclar en 40 l de 5x SPG. Almacenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Ensayo y pantalla de mutantes de fenotipo (s) de interés. </li></ol> 3. Secuenciación del genoma completo de mutantes Chlamydia seleccionadas <ol><li> Extraer el ADN genómico de gradiente purificado EBS, que son en gran parte libre de contaminación de ADN del huésped. Protocolos para el cultivo a gran escala de clamidia y purificación de EBs se pueden encontrar en la ref. (17). Utilice kits de purificación de ADN genómico comerciales (por ejemplo Qiagen cat. 69504) para extRACT ADN de 2 x 10 9 bacterias siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Utilice un fluorómetro (Qubit, Invitrogen cat. Q32866) para medir con precisión la cantidad de ADN. Se requiere 1-5 g de ADN purificado para la plataforma de secuenciación de Illumina. Nota: Varias plataformas se pueden utilizar para la secuencia de los genomas de bacterias, incluyendo sistemas de Illumina/Solexa- y sólida basada. Hemos elegido utilizar HiSeq (Illumina), ya que produce una alta densidad de corto, pero la secuencia de alta calidad lee. Secuenciadores del genoma escala más pequeña, como IonTorrent (Life Technologies) y myseq (Illumina) son adecuados también y más que suficiente para multiplexar estos Quencing de hasta 4 genomas clamidia a la vez, lo que supera la cobertura mínima de 25X para el genoma de montaje adecuado. Preparación de bibliotecas de secuenciación de ADN para la plataforma Illumina se describen a continuación. </li><li> ADN Fragmento de tamaño adecuado (300-400 pares de bases para la secuenciación de Illumina) utilizando una adaptación acústica S220 enfocados entrumento (Covaris) de acuerdo con los ajustes sugeridos por el fabricante. Nota: la fragmentación del ADN por los resultados de nebulización en una mayor pérdida de la muestra debido al uso de aerosol de la muestra. </li><li> Preparar las bibliotecas de secuenciación genómica utilizando kits de construcción comercial (Illumina FC-102-1001), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas pueden ser indexados usando cebadores de código de barras (Illumina FC-121-1003) de tal manera que múltiples muestras se unen y se secuenciaron de forma simultánea. </li><li> Ejecutar secuenciación de muestras. Este paso se realiza generalmente por los servicios comerciales o instalaciones centrales operadas por personal técnico especializado. Siga los procedimientos y recomendaciones. </li><li> Illumina lecturas (formato FASTQ) se puede montar a un genoma de referencia utilizando usar software de interfaz de usuario gráfica de usuario, tales como Geneious (Biomatters), que puede ser también utilizado para SNP / identificación de mutaciones. Para mutaciones del mapa, establecer los parámetros de un 90% para la frecuencia de la variante mínima y 50X para la cobertura mínima. Abrir vitame ensambladores del genoma, tales como MAQ (18) y BWA (19), también se pueden utilizar. </li><li> Confirmar mutaciones por secuenciación de Sanger: usar el ADN genómico como molde para la amplificación por PCR de 300-500 bp regiones que flanquean las mutaciones identificadas y purificadas o secuencia (01:20) productos de PCR diluido por secuenciación de Sanger. </li></ol> 4. Generación de recombinantes de Chlamydia Nota: La clamidia puede intercambiar ADN durante la infección, lo que permite la generación de cepas recombinantes (12, 13, 20). Después de la co-infección de células con dos cepas resistentes a los antibióticos únicas, recombinante &quot;progenie&quot; se puede seleccionar para la doble resistencia a los antibióticos (12, 13). Nos aprovechamos de este fenómeno para segregar mutaciones y generar cepas co-isogénicas. Por lo tanto, se generaron cepas mutantes en el fondo resistente a los antibióticos (por ejemplo, resistencia a rifampicina (RIF R) H471Y en CTL0567 (rpoB)) de tal manera que se pueden cruzar con el tipo salvaje cepa bearinalelo resistente al antibiótico diferente ga (por ejemplo, resistencia a la espectinomicina (spc R), G1197A en R01/R02 (16SRNA copia 1 y 2)). Para detalles con respecto a intercambio de ADN y la recombinación en la clamidia, referirse a las referencias (12, 13). <ol><li> Co-infectar tipo salvaje y cepas mutantes clonales por centrifuging6 x 10 5 bacterias de cada cepa en monocapas confluentes de células Vero cultivadas en una placa de 24 pocillos. En paralelo, infectar monocapas con cada cepa solo. </li><li> A los 44 hpi, cosecha EBS mediante lisis hipotónica de las células infectadas: <ol><li> Completamente aspirar el medio. </li><li> Añadir 0,4 ml de agua estéril y dejar reposar durante 10 min. </li><li> Lyse células por pipeteo vigoroso arriba y abajo durante al menos 10 veces. Transferencia lisados ​​a un tubo de microcentrífuga. </li><li> Mezclar en 0,1 ml de SPG 5x para una concentración final de 1x SPG. </li><li> Lisados ​​crudos se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a -80 ° C. </li></ol></li><li> La placa 50 l de la EB crudo preps und 5 x 1:10 diluciones seriadas de agarosa / DMEM suplementado con los antibióticos adecuados para seleccionar a los recombinantes. (Véase la tabla de concentraciones de antibióticos típicos para la selección de recombinantes.) </li><li> La placa purificar y enriquecer las cepas recombinantes como anteriormente. Puntuación recombinantes para la presencia o ausencia del fenotipo deseado. Extraer el ADN de las cepas recombinantes mediante tratamiento DNAzol (siguiente sección) con el propósito de determinación del genotipo para determinar la presencia o ausencia de mutaciones. </li><li> Cruces pueden repetirse con otras cepas que llevan marcadores de resistencia a antibióticos para segregar más mutaciones, y generar cepas isogénicas. Co-infectar recombinantes seleccionados a otra cepa de tipo salvaje que lleva un marcador antibiótico diferente. </li></ol> Tabla 1: Las concentraciones de antibióticos para la selección de recombinantes: <table border="1"><tbody><tr><th> Concentración final </th><th> Instrucciones de preparación </th></tr><tr><td> 200 ng / ml de rifampicina </td&gt; <td> Hacer 25 mg / ml de caldo de almacenamiento en dimetilsulfóxido (DMSO). Maquillaje 200 mg / ml solución de trabajo diluyendo la solución madre de almacenamiento con H 2 O. Almacenar a -20 ° C en la oscuridad. </td></tr><tr><td> 200 mg / ml de trimetoprima </td><td> Hacer un mg / ml de caldo de 100 en DMSO. Almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> 200 g / ml de espectinomicina </td><td> Hacer un mg / ml de caldo de 100 en agua en 100 ml de alícuotas. Almacenar a -20 ° C. Evite repetida congelación y descongelación. </td></tr></tbody></table> 5. Extracción de ADN genómico a partir de cepas recombinantes para la genotipificación Nota: kits de purificación de columna de base también se pueden utilizar. Una ventaja de la extracción de ADN por el tratamiento DNAzol es el costo. <ol><li> Infect 1.2 x 10 5 clamidias en monocapas de células Vero cultivadas en placas de 12 pocillos. </li><li> En 36 a 48 hpi, aspirar a medio y añadir 0,375 ml de DNAzol (Invitrogen 10503-027). Agite suavemente las células y la pipeta lysates en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> ADN precipitado mediante la adición de 0.188 ml de etanol al 100%. Mezclar por inversión. </li><li> Extraer el ADN de cola de impresión, con una punta de pipeta y colocarla en un tubo limpio. Alternativamente, el pellet de ADN por centrifugación a velocidad máxima durante 2 minutos a temperatura ambiente o 4 º C, y el sobrenadante se decanta. </li><li> Lavar precipitar el ADN dos veces con 1,0 ml de etanol al 75%. </li><li> DNA aire seco después de retirar el etanol durante 15 s. </li><li> Solubilizar ADN con 0,2 ml de NaOH 8 mM a continuación, neutralizar a pH 8,0 con 20,2 l de 0,1 M de HEPES. Llevar hasta un volumen final de 0,5 ml con agua o TE. Alternativamente, resuspender el DNA en tampón TE (sedimento de ADN no solubilizado completamente.). </li><li> Utilice DNAzol ADN extraído como molde para la amplificación por PCR de 300 a 500 bp regiones que flanquean las mutaciones identificadas. Secuencia purificado o diluido (1:20) productos de PCR mediante secuenciación de Sanger. </li></ol>

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No hay nada que revelar.

Esta metodología cumple con los requisitos básicos para el análisis genético ya que establece la vinculación entre los genotipos y fenotipos. Es importante destacar que esto se logra sin la ayuda de herramientas moleculares convencionales para la transformación del ADN recombinante y la inactivación insercional de genes en bacterias, lo cual es a menudo un paso limitante de la velocidad en el análisis de la función de genes en los microbios no modelo. Un paso fundamental es asegurar...

La bacteria Chlamydia trachomatis cuentas intracelulares obligados para un estimado de 2,8 millones de infecciones del tracto genital por año en los Estados Unidos (Center for Disease Control) asociado con secuelas tales como la enfermedad pélvica inflamatoria, embarazo ectópico e infertilidad (1). Chlamydia spp tienen un único fisiología con un ciclo de desarrollo bifásico que consiste en dos formas: el cuerpo elemental infecciosa pero no replicante (EB) y el cuerpo reticulado no infecciosa pero replicativa (RB). La infección comienza con la unión de EBs a células epiteliales seguido de endoctyotosis (2). Dentro de una vacuola de membrana denomina una inclusión, EBS se diferencian en la forma RB, que se replica por fisión binaria. En la mitad del ciclo, las transiciones RBs de nuevo en EBS, que luego son expulsados ​​en el espacio extracelular para iniciar nuevas rondas de infección cuando la lisis de células huésped (3). C. trachomatis esrefractario a la manipulación de rutina con herramientas genéticas moleculares estándar, tales como el reemplazo de gen objetivo, transposones, y los fagos de transducción, que han sido central para la mayoría de los estudios en genética bacteriana, No está claro el grado en que los genes de Chlamydia individuales contribuyen a la evasión de la inmunidad innata , la adquisición de nutrientes, transiciones del desarrollo, u otros procesos importantes para la supervivencia del patógeno en un huésped eucariota (4). En consecuencia, este patógeno permanece mal caracterizado a pesar de su importancia clínica. Los genomas de Chlamydia spp. es relativamente pequeño (~ 1 Mb) (5) con múltiples especies y biotipos secuenciados utilizando tecnologías de secuenciación de próxima generación. El análisis comparativo del genoma de WGS ha proporcionado una visión única sobre la evolución de las especies de clamidias y su adaptación a los humanos (6-8) y, en cierta medida, ha proporcionado alguna información en cuanto a la función potencial de los factores de virulencia (9, 10). Tque la diversidad genética representada por los aislados clínicos no proporciona la resolución necesaria para trazar sistemáticamente la función de la mayoría de los factores de virulencia, presumiblemente debido a las mutaciones en dichos genes se han seleccionado fácilmente contra. Sin efectos de confusión de la selección natural, la variación del gen mutágeno inducida, junto con los ensayos definidos que los defectos de medida en la virulencia, pueden ampliar el espectro de mutaciones que pueden ser objeto de reconocimiento. Mutágenos químicos, en particular, son útiles ya que pueden generar nula hypomorphic (reducción de la función), condicional, y hypermorphic (ganancia de función) alelos. Con la llegada de las tecnologías de secuenciación del genoma robustos de última generación, tales mutaciones pueden ser fácilmente identificados y mapeados. De esta manera, las asociaciones fuertes se pueden realizar entre las mutaciones en un gen o vía genética y un fenotipo común, lo que permite la aplicación de enfoques genéticos hacia adelante. Las secuencias del genoma de cepas clínicas revelaron mosaicismo bserovares ntre y loci de recombinación frecuente (11). La evidencia empírica de recombinación se demostró a través de la co-infección de dos cepas resistentes a los antibióticos diferentes y la selección de la progenie de doble recombinante resistente, que fue revelado a tener contribuciones genéticas de ambas cepas (12, 13). Por lo tanto, el intercambio genético entre el tipo salvaje y las cepas mutantes en un entorno co-infección permite la segregación de las mutaciones inducidas químicamente para identificar el gen afectado que conduce al fenotipo observado. Aquí se describe una metodología para llevar a cabo el análisis genético de Chlamydia basada en la mutagénesis química, WGS, y un sistema para el intercambio de ADN dentro de las células infectadas (14) (Figura 1).

<table border="0" cellspacing="0" cols="4">
	<colgroup width="291">
	</colgroup>
	<colgroup width="123">
	</colgroup>
	<colgroup width="144">
	</colgroup>
	<colgroup width="84">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate (EMS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (sterile, tissue culture grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2% GTG Agarose , autoclaved</td>
			<td>Lonzo</td>
			<td>50070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA purification kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10503-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mM NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer (Qubit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetic approaches in chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, el agente etiológico de las enfermedades de transmisión sexual y las infecciones oculares, sigue siendo mal caracterizado por su inflexibilidad a la transformación experimental con ADN recombinante. Hemos desarrollado un enfoque para llevar a cabo el análisis genético en C. trachomatis a pesar de la falta de herramientas de genética molecular. Nuestro método consiste en: i) la mutagénesis química para generar rápidamente amplias bibliotecas de mutantes genéticamente definidos con fenotipos distintos; ii) secuenciación del genoma completo (WGS) para asignar las lesiones genéticas subyacentes y encontrar asociaciones entre genes mutados (s) y.. un fenotipo común. iii) la generación de cepas recombinantes a través de la co-infección de células de mamíferos con bacterias mutantes y de tipo salvaje. En consecuencia, hemos sido capaces de establecer relaciones causales entre los genotipos y fenotipos. El acoplamiento de la variación genética inducida químicamente y WGS establecer asociaciones genotipo-fenotipo correlativos Should ser ampliamente aplicable a la larga lista de razones médicas y ambientalmente microorganismos importantes actualmente intratables para el análisis genético.

La exposición a mutágeno conduce a inclusiones que aparecen desprovisto de bacterias, presumiblemente debido a la muerte de la célula bacteriana. Normalmente, serovar LGV-L2 lisará completamente las células infectadas en las 48 horas de la infección, pero el tratamiento con mutágenos puede extender este ciclo para&gt; 90 h. Se espera que aproximadamente el 10% de las inclusiones de recuperar. En nuestros experimentos, las células Vero infectadas tratadas con 20 mg / ml de SGM dirigida a una disminución de 99% e...

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Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Se describe una metodología para llevar a cabo el análisis genético de Chlamydia basada en la mutagénesis química y la secuenciación del genoma completo. Además, un sistema para el intercambio de ADN dentro de las células infectadas se describe que se puede utilizar para la cartografía genética. Este método puede ser ampliamente aplicable a los sistemas microbianos que carecen de sistemas de transformación y herramientas de genética molecular.

Enfoques Forward genéticos en<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

forward-genetic-approaches-in-chlamydia-trachomatis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

12.8K vistas.  Duke University Medical Center.  Se describe una metodología para llevar a cabo el análisis genético de Chlamydia basada en la mutagénesis química y la secuenciación del genoma completo. Además, un sistema para el intercambio de ADN dentro de las células infectadas se describe que se puede utilizar para la cartografía genética. Este método puede ser ampliamente aplicable a los sistemas microbianos que carecen de sistemas de transformación y herramientas de genética molecular. 

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Una pantalla genética para aislar Toxoplasma gondii Célula huésped-mutantes Egress

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Investigación

Inmunología e Infección

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipulación genética en<em&gt; Δku80</em&gt; Las cepas de Análisis Genómico Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Descubrimiento de nuevos patógenos intracelulares por amebas Coculture y Enfoques amebas Enriquecimiento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Adelante Genética pantallas usando macrófagos identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</empara la resistencia a IFN-γ por células dependiente&gt; Genes Importante Inmunidad Autónoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenómica fagos: enfoques fisiológicos para caracterizar Novela Virales Proteínas

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Un simple Blood Red lisis celular Método para el establecimiento de líneas de células B linfoblastoides

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.