The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

Todos los procedimientos de manipulación y tratamiento de ratones deben adherirse a las normas establecidas por los programas de la legislatura y / o cuidado de los animales y aprobados por un comité local de cuidado de animales. Todos los métodos descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales, con la aprobación del comité local de cuidado de animales. ATENCIÓN: Todos los trabajos con radiactividad (incluyendo, pero no limitado a la manipulación de tritio, γ-irradiación externa, la manipulación de tejidos animales, residuos radiactivos de cama) deben adherirse a las normas establecidas por las autoridades de la legislatura y / o de protección radiológica y se realizará por personal autorizado personal de un laboratorio y / o instalación certificada. 1. Trabajar Animal <ol><li> Agrupación Animal <ol><li> Si los ratones están llegando de una organización externa, aclimatar animales durante al menos 10 días en el animalario. Si el estudio incluye múltiples grupos de tratamiento, asegúrese de que el proveedor de los animales puede enviar all animales como un solo lote. </li><li> Asignar aleatoriamente los ratones a grupos de tratamiento de 10 ratones por grupo. Si el uso de ratones macho de la cepa C57BL / 6, que el proveedor de los animales pre-organizar aleatorización de muy corta edad C57BL / 6 machos en sus instalaciones para mitigar problemas de agresión. </li></ol></li><li> La exposición crónica de ratones de β-radiación interna <ol><li> Preparar las concentraciones de trabajo de tritio (10 kBq / L y 1 MBq / L) en el agua potable de ratón mediante la dilución de la población original de HTO y OBT (una mezcla de prolina tritiada, alanina y aminoácidos glicina) soluciones. </li><li> Validar las concentraciones finales de tritio en el agua potable mediante la medición de la radiactividad utilizando un contador de centelleo líquido. Ajuste concentraciones, si es necesario. </li><li> Tratar a los animales durante un mes mediante el acceso ad libitum al agua tritio. Si el agua de tratamiento se baja durante el período de dos semanas, añada más agua. De lo contrario, cambie las botellas a las dos semanas. </li><li> Farsa irradiado Tratar de controlratones idénticamente. Manténgalos en una habitación &quot;limpia&quot; separada o en un estante separado &quot;limpio&quot; bajo la presión de aire positiva para evitar tritio contaminación cruzada desde el aire. </li></ol></li><li> La exposición crónica de ratones a la radiación externa γ- Nota: facilidad de γ-irradiación / equipo variará dependiendo de la ubicación. </li><li> El uso de métodos disponibles de dosimetría, determinar las distancias de una fuente γ-radiación que tienen campos de radiación que producen las dosis deseadas. Garantizar la homogeneidad de los campos de radiación dentro de las áreas que cubren las jaulas de los animales. Nota: 1,7 μGy / h es equivalente a una tasa de dosis producida por 1 MBq / L tritio en el cuerpo. </li><li> Exponer los ratones mediante la colocación de jaulas de ratón en las distancias determinadas en el paso 1.3.1 para un mes. Minimizar interrupción diaria de la γ-irradiación a 30 min. Utilice dosímetros de termoluminiscencia para medir dosis total absorbida. </li></ol> 2. Sacrificio y Muestreo <ol&gt; <li> Preparar instrumentos quirúrgicos estériles, 60 mm placas de Petri con coladores insertados celulares 70 micras, 15 ml y tubos de 1,5 ml, medio RPMI suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS) y el lugar todo dentro de una cabina de seguridad biológica. Asegurar la esterilidad de la obra es crucial. </li><li> Dispense 5 ml de medio RPMI en cada 60 mm placa de Petri. </li><li> Sacrificar los ratones utilizando un método aprobado por el comité local de cuidado de los animales. Dislocación cervical es una buena opción para el trabajo de esplenocitos se describe en este protocolo. Sin embargo, si se requieren muestras de sangre para otros ensayos (por ejemplo, para el mFISH, el bloque de micronúcleos citocalasina u otros ensayos genetoxicity común), utilice la punción intracardiaca después de la anestesia con isoflurano. </li><li> Colocar el animal en decúbito dorsal, con la cabeza apuntando lejos de usted. Rocíe el ratón hacia abajo con etanol al 70%. Con unas pinzas, agarre la piel en sentido anterior a la abertura de la uretra y hacer una pequeña incisión con tijeras en la región perineal. <ol&gt; <li> De esta incisión, corte a lo largo de la línea media ventral a la cavidad torácica, teniendo cuidado de cortar solamente la piel y no la pared muscular debajo. Diseccionar la piel lejos de la línea media. </li><li> Agarre la pared abdominal con fórceps y cortar a lo largo del eje medio de la pared muscular de abrir la cavidad abdominal. </li></ol></li><li> Extirpar el bazo ligeramente agarre con pinzas estériles y suavemente tirando de él y al mismo tiempo cortando el tejido conectivo con unas tijeras. </li><li> Corte un pequeño trozo del bazo (aproximadamente 1/10 del bazo) y colocar en un tubo de 1,5 ml. Snap congelar en nitrógeno líquido para su posterior almacenamiento a -80 ° C para los ensayos suplementarios. </li><li> Coloque el resto del bazo en un filtro de células dentro de una placa de Petri de 60 mm con 5 ml de medio RPMI pre-dispensado. </li><li> Continúe con el siguiente ratón. Nota: Extraído bazos se pueden mantener en placas de 60 mm con los medios de comunicación (para un máximo de 2 horas), mientras que el resto de los ratones son Sacrificed. Dependiendo del número de personas que participan, entre 5 y 15 ratones se pueden procesar en un día. </li></ol> 3. Preparación de cultivos de esplenocitos <ol><li> Homogeneizar el bazo mediante el picado dentro de un filtro de células con unas pinzas estériles con un extremo curvo. </li><li> Retire el filtro de células y recoger la suspensión de células se filtra desde el plato de 60 mm en un tubo de 15 ml. </li><li> Enjuague el filtro de células con 5 ml de medio para recoger el resto de las células. </li><li> Tubos de centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA. </li><li> Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 10 ml de RPMI. </li><li> Tubos de centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA. </li><li> Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 5 ml de RPMI. </li><li> Transferencia de 4 ml de la suspensión celular en un matraz de cultivo de 25 ml de tejido y trasladarlo a un incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2, 80% de humedad) </li></ol> 4. Desafiando irradiación y Fijación <ol><li> Transferir elrestante 1 ml de suspensión celular desde el paso 3.8 en un tubo de 1,5 ml en hielo y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Daño en el ADN medido en esta muestra representará tanto daño inducido por el tratamiento y t = 0 de datos punto para la construcción de una curva de reparación del ADN. </li><li> Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 1 ml de tampón TBS (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM). </li><li> Tubos centrífuga a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 300 l de TBS. </li><li> Mientras se mezcla en un vórtice a baja velocidad, añadir 700 l de -20 ° C 100% de etanol. Cierre la tapa e invierta varias veces para mezclar. </li><li> Almacenar las muestras a -20 ° C. Los esplenocitos fijos en etanol se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos 12 meses sin ninguna pérdida notable en la señal de γH2AX. </li><li> Irradiar los cultivos de esplenocitos del paso 3.8 con un desafiante γ-rad<html> iation dosis de 2 Gy a una tasa de dosis ≥ 200 mGy / min utilizando dispositivo de irradiación disponible. Nota: El propósito de esta irradiación es inducir ADN OSD para desafiar la maquinaria de reparación. Los rayos X también se pueden utilizar para este propósito. </li><li> Inmediatamente devolver las culturas para una incubadora de CO 2. </li><li> 1 hora después de la desafiante 2 Gy de irradiación, retire las culturas de la incubadora a una cabina de seguridad biológica. Para recoger una alícuota de la muestra representativa, suavemente volver a suspender las células utilizando una pipeta y la transferencia de 1 ml de la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml en hielo. Devolver los cultivos celulares a una incubadora de CO 2. </li><li> Tubos centrífuga a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Suavemente volver a suspender el sedimento en 1 ml de TBS. </li><li> Repita los pasos 4.3 a 4.5. </li><li> 24 horas después de la desafiante 2 Gy γ-irradiación, cosecha y fijar en = 24 hrs muestra como se describe en el paso 4.8 a 4.10. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. El etiquetado de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-γH2AX Nota: Por lo general, 15 a 30 muestras por día pueden immunofluorescently etiquetados y se analizaron por citometría de flujo en una sola corrida. Para garantizar una comparación exacta entre los grupos de tratamiento, incluyen la muestra (s) de cada grupo. Ver también Referencia 16 para más detalles. <ol><li> Preparar un conjunto marcado de tubos para el número de muestras a procesar y el lugar en el hielo. Utilice 12 x 75 mm tubos de vidrio debutantes. La esterilidad no se requiere para este trabajo. Incluir una muestra de control histórica adicional para el marcaje con anticuerpo secundario solamente (&quot;segunda Ab única&quot;). Utilice esta muestra histórica de control en todos los citometría de flujo funcionar dentro de un estudio. </li><li> Añadir 0,5 ml de TBS helado a cada tubo. </li><li> Eliminar esplenocitos fijos de -20 ° C, vórtice durante 5 s y transferir una alícuota de 0,5 ml a tubos preparados con TBS. Coloque el resto de las muestras de vuelta a -20 ° C y almacenamientomantener como muestra de respaldo. </li><li> Esplenocitos centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de hielo-frío TBS que contiene 1% de FBS </li><li> Células centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 1 ml de tampón TST (0,05% de Triton X-100, 2% de FBS en TBS). Incubar durante 20 min en hielo. </li><li> Células centrifugar a 300 g durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 200 l de anticuerpo primario anti-γH2AX diluidos 1: 150 en tampón TST. Utilice 200 l de TST para el &quot;segundo Ab única&quot; muestra de control. </li><li> Tubos de posición en un agitador que gira a un ángulo de 45 - 60 ° y agitar durante 1,5 horas a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Mientras que los tubos están incubando, preparar un volumen suficiente (200 l / muestra) de la cabra anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con Alexa-488 en una dilución 1: 200 en tampón TST. Nota: Todos los trabajos que Alexa-488anticuerpo conjugado (pasos 5.10 a 5.16 más abajo) debe hacerse bajo condiciones de luz tenue y muestras etiquetadas debe protegerse de la luz, envolviendo los tubos en papel de aluminio. </li><li> Una vez completada la incubación 1,5 hrs, añadir 1 ml de TBS frío con hielo que contenía FBS al 2% a cada tubo y centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 1 ml de TBS que contenía 2% de FBS. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 200 l de la solución de anticuerpo secundario desde el paso 5.8. </li><li> Incubar las muestras en una plataforma de agitación durante 1 hora como en el paso 5.7. </li><li> Añadir 1 ml de TBS frío con hielo que contenía 1% de FBS. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de TBS enfriado con hielo. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento en 0,5 ml de TBS que contenía 50 mg / mlyoduro de propidio. </li><li> Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. </li><li> Analizar las muestras en un citómetro de flujo a través de protocolos específicos de los instrumentos 16. Leer al menos 10.000 células por muestra. </li></ol>

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The authors declare that there are no known competing financial interests.

El protocolo presentado en este documento es útil para la realización del ratón a gran escala en los estudios in vivo que examinan los efectos genotóxicos de los bajos niveles de diversos agentes químicos y físicos, incluyendo la radiación ionizante. Nuestra instalación de animales libres de patógenos específicos único equipado con un irradiador GammaBeam 150 y un pasillo largo irradiación 30 metros permite la realización de estudios de toda la vida que implican radiaciones bajas o muy baj...

Controversia significativa sobre los posibles efectos nocivos de cualquiera de las dosis bajas o muy bajas de radiación y el temor del público de la radiación, impulsado por las imágenes de los bombardeos atómicos de Hiroshima y Nagasaki y de accidentes en plantas nucleares raras ionizante (exacerbada por los medios de comunicación), ha dado lugar a muy estricta regulación de la protección radiológica y normas que potencialmente no son científicamente justificada. En las tres últimas décadas, numerosos informes han documentado tanto la falta de perjudicial y la presencia de efectos biológicos potencialmente beneficiosos inducidos por la radiación de baja dosis 1-4. El factor de riesgo para la salud de radiación mayor es la probabilidad de cáncer, que se calcula sobre la base de los estudios epidemiológicos de sobrevivientes de las bombas atómicas que reciben dosis altas o medianas de la radiación. Linear extrapolación de estos datos (los llamados lineal-no-umbral o modelo LNT) se utiliza para estimar los riesgos de cáncer a dosis bajas. Sin embargo, este enfoque no ha recibido la aceptación científica mundialy está fuertemente debatido 5. Es evidente que se necesitan más estudios para aclarar esta cuestión y, posiblemente, mejorar las normas de protección radiológica. Tales estudios deben incluir tratamientos crónicos (mejor aproximación de las exposiciones ambientales y ocupacionales), en modelos animales in vivo (en el mejor de los efectos para la salud humana) y la extrapolación de estos puntos finales como los tipos de daño en el ADN, la reparación del ADN y mutagénesis. Se sabe que el ADN es el principal objetivo de dañar efectos de la radiación y incompletos o mis-reparación puede conducir a mutagénesis y cáncer de desarrollo 6. Roturas de doble hebra de ADN (OSD) son uno de los tipos más perjudiciales de las lesiones del ADN y pueden conducir a la muerte celular y tumorigénesis 7. Es, por lo tanto, importante para ser capaz de medir de forma fiable y precisa el nivel de DSB después de la exposición a bajas dosis de radiación y / o otros factores de estrés, tales como contaminantes químicos. Uno de los marcadores más sensibles y específicosde DSB de ADN es la histona H2AX fosforilada, llamado γH2AX 8, sin embargo, otros marcadores y métodos Se han sugerido 9,10. Se estima que miles de moléculas de H2AX, en las proximidades de un OSD inducida, están implicados en la formación de γH2AX que permite la detección de individuo OSD, mediante el etiquetado de inmunofluorescencia con un anticuerpo y microscopía de fluorescencia anti-γH2AX 11. La respuesta es muy rápida, alcanzando su máximo entre 30 y 60 min. Existen pruebas de que γH2AX facilita la reparación de DSB de ADN mediante la atracción de otros factores de reparación a los sitios de las pausas y al modificar la estructura de la cromatina para anclar los extremos de ADN rotos y facilitar el acceso de otras proteínas de reparación (revisado en 12). Sobre la terminación de la reparación de DSB de ADN, se γH2AX De fosforilada y / o se somete a la degradación, y las moléculas recién sintetizadas H2AX reemplazar γH2AX en las zonas afectadas de la cromatina 10. La formación y la pérdida de γH2AX Vigilancia puede,por lo tanto, proporcionar una estimación precisa de la cinética de reparación del ADN OSD. Este enfoque ha sido utilizado para estudiar la reparación de DSB en diversas líneas celulares tumorales humanas irradiadas con altas dosis de radiación y su tasa de OSD y los niveles residuales se han demostrado que se correlaciona con la radiosensibilidad 13-15. Hemos modificado este enfoque experimental y lo aplicamos a un estudio en ratones in vivo para examinar los efectos de las dosis bajas de γ- crónica y β-irradiación en los niveles de ADN del OSD y reparación (Figura 1). En primer lugar, demostramos un método para realizar una exposición crónica a largo plazo de ratones para β-radiación sea emitida por tritio (hidrógeno-3) en forma de agua tritiada (HTO) o como tritio orgánico (OBT) disuelto en el agua potable . Se espera que las dos formas de acumular y / o distribuir de manera diferente en el cuerpo y por lo tanto, producir diferentes efectos biológicos. Ambas formas son posibles peligros en la industria nuclear. Este tratamientoes paralelo por la exposición crónica a la radiación γ-a una tasa de dosis equivalente para permitir una correcta comparación de los dos tipos de radiación, que es crucial para la evaluación de su eficacia biológica relativa. Beta-radiación se compone de electrones, lo que es muy diferente de la γ-radiación, fotones de alta energía. Debido a esta diferencia, Β-radiación representa peligro para la salud principalmente interna y puede producir diferentes efectos biológicos en comparación con γ-radiación. Esta complicación se tradujo en controversias significativas sobre la regulación de la exposición a β-radiación emitida por OTA. Por lo tanto, los niveles de regulación de HTO en el agua potable para el público varían de 100 Bq / L en Europa a 75.000 Bq / L en Australia. Es, por lo tanto, importante para comparar los efectos biológicos de HTO a dosis equivalentes de γ-radiación. En segundo lugar, la tasa de DSB de ADN se mide en esplenocitos aislados a la finalización de las exposiciones crónicas usando immunofluorescently marcado γH2AX detectared por citometría de flujo. Esto permite la evaluación de la extensión del daño de ADN infligido por las exposiciones in vivo. Sin embargo, es razonable esperar que tales exposiciones de bajo nivel pueden no producir ningún tasas detectables de ADN OSD; en cambio, / puede esperarse algunos cambios ocultos respuestas que afectaría a la capacidad de las células para reparar el daño del ADN. Estos cambios, si se encuentra, pueden ser o bien estimulador (produciendo un efecto beneficioso) o inhibidor (produciendo un efecto perjudicial). El protocolo propuesto permite revelar tales cambios desafiando a los esplenocitos extraídos con una alta dosis de radiación que produce una cantidad significativa de daño (por ejemplo, 2 Gy producir aproximadamente 50 DSB de ADN por célula o un 3 -. Incremento de 5 veces en nivel total γH2AX) . Posteriormente, la formación y la pérdida de γH2AX, lo que refleja el inicio y la finalización de la reparación de DSB, se controla mediante citometría de flujo. De esta manera, no sólo basal y los niveles inducidos por el tratamiento de DSB de ADN pueden medirse, perotambién su efecto potencial sobre la capacidad de las células para responder y daño del ADN inducido por la reparación de los niveles estresantes mucho más altas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HTO: tritiated water, [3H]</td>
			<td>locally obtained from a nuclear reactor&#160;</td>
			<td></td>
			<td>stock activity 3.7 GBq/mL;&#160; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET348005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET004005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET323005MC</td>
			<td>1mCi/mL (185 MBq)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tritiated water, [3H] (HTO)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET001B005MC</td>
			<td>substitute for HTO of local origin&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GammaBeam 150 irradiator</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Limited</td>
			<td>locally manufactured</td>
			<td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025501</td>
			<td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864-10ML</td>
			<td>1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P006-EAAN</td>
			<td>500ml bottles Absolute Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682550</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>P110403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 x 75 mm mL uncapped glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K60B1496126</td>
			<td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA15708-120</td>
			<td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14068-12</td>
			<td>Wagner scissors 12cm sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>Semken forceps 13cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-12</td>
			<td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA25382-100</td>
			<td>BD Falcon tissue culture dish 60x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainers, 70 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td>Falcon cell strainers 50/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200mL of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS recipe: to make 10X Stock,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g TRIS HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-1KG</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>88g NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Sodium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2g KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Potassium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissolve in 1L of deionized water, adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

Exposición a la radiación en dosis bajas puede producir una variedad de efectos biológicos que son diferentes en cantidad y calidad de los efectos producidos por dosis altas de radiación. Abordar las cuestiones relacionadas con la seguridad ambiental, ocupacional y de salud pública de una manera adecuada y científicamente justificada en gran medida se basa en la capacidad de medir con precisión los efectos biológicos de los contaminantes de dosis bajas, tales como sustancias químicas y radiación ionizante. Daños en el ADN y la reparación son los más importantes indicadores tempranos de riesgos para la salud debido a sus posibles consecuencias a largo plazo, tales como el cáncer. Aquí se describe un protocolo para estudiar el efecto de la crónica exposición in vivo a dosis bajas de γ- y β-radiación en daños y reparación del ADN en las células de bazo de ratón. Utilizando un marcador comúnmente aceptada de ADN de doble filamento se rompe, la histona H2AX fosforilada llamado γH2AX, se demuestra cómo se puede utilizar para evaluar no sólo los niveles de daño en el ADN, pero también cambiaen la capacidad de reparación del ADN potencialmente producido por una baja dosis de exposición in vivo. La citometría de flujo permite la medición rápida, precisa y fiable de immunofluorescently marcado γH2AX en un gran número de muestras. Reparar el ADN de doble filamento romper puede evaluarse mediante la exposición de esplenocitos extraídos a una dosis de 2 Gy reto de producir un número suficiente de ADN se rompe para desencadenar la reparación y midiendo la inducida (1 hora después de la irradiación) y daño del ADN residual (24 hrs después de la irradiación). Daño en el ADN residual sería indicativo de reparación incompleta y el riesgo de la inestabilidad genómica a largo plazo y el cáncer. Combinado con otros ensayos y puntos finales que pueden ser fácilmente medidos en tales estudios in vivo (por ejemplo, las aberraciones cromosómicas, frecuencias de micronúcleos en reticulocitos de la médula ósea, la expresión de genes, etc.), este enfoque permite una evaluación precisa y contextual de los efectos biológicos de los factores de estrés de bajo nivel.

La Figura 2 muestra ejemplos de gráficos de citometría de flujo esperados para esplenocitos preparados usando el método descrito aquí. Las células se gated primero basado en el &lt;electrónica de dispersión del lado del volumen&gt; gráfico de dispersión (Figura 2A y 2D; volumen electrónico es equivalente a dispersión frontal). Histogramas de yodo FL3 / propidio (Figura 2B y 2E) confirman la distribución del ciclo celular nor...

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Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica<em&gt; En Vivo</em&gt; La exposición a dosis muy bajas de beta y gamma Radiación

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K vistas.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

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Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Investigación

Biología

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

La estimulación de citoplasmáticos de ADN Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the different aspects of visual, cross-modal and developmental plasticity along the mammalian visual system1-4.
Here, we demonstrate an elegant and straightforward technique for the removal of one or both eyes in the mouse, which is validated in mice of 20 days old up to adults. Briefly, a disinfected curved forceps is used to clamp the optic nerve behind the eye. Subsequently, circular movements are performed to constrict the optic nerve and remove the eyeball. The advantages of this technique are high reproducibility, minimal to no bleeding, rapid post-operative recovery and a very low learning threshold for the experimenter. Hence, a large amount of animals can be manipulated and processed with minimal amount of effort. The nature of the technique may induce slight damage to the retina during the procedure. This side effect makes this method less suitable as compared to Mahajan et al. (2011)5 if the goal is to collect and analyze retinal tissue. Also, our method is limited to post-eye opening ages (mouse: P10 - 13 onwards) since the eyeball needs to be displaced from the socket without removing the eyelids. The in vivo enucleation technique described in this manuscript has recently been successfully applied with minor modifications in rats and appears useful to study the afferent visual pathway of rodents in general.

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

The removal of eyes, also called enucleation, provides a useful strategy to study aspects of visual, cross-modal, and developmental plasticity along the mammalian visual system since it induces irreversible partial (monocular) or complete (binocular) vision loss. Here we describe a highly reproducible and straightforward approach to perform in vivo enucleation.

Un método altamente reproducible y fácil de Perform<em&gt; En Vivo</em&gt; Ocular enucleación en el ratón después de la abertura del ojo

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

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Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica

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