Pbmc y muestras de plasma son fáciles de adquirir y altamente informativo en el desarrollo clínico temprano. Este protocolo robusto minimiza la variabilidad preanalítica introducida en los sitios clínicos. Este protocolo es rápido y fácil, y requiere equipo de laboratorio básico y una experiencia mínima del operador para procesar la sangre en PBMCs y plasma.
Es compatible con los ajetreados días de laboratorio en los hospitales. El análisis aguas abajo de los componentes sanguíneos resultantes de este protocolo puede informar las relaciones farmacocinéticas y farmacodinámicas, la programación de la dosis de fármacos y la prueba del compromiso objetivo y proporcionar información sobre los mecanismos de acción de los fármacos, apoyando tanto el análisis en tiempo real como el introspectivo. Utilizamos este protocolo para estudios oncológicos, específicamente para analizar los mecanismos de respuesta al daño del ADN.
Sin embargo, los materiales recogidos por este protocolo pueden ser relevantes a través de muchas áreas de la enfermedad y de modalidades terapéuticas múltiples. Después de recibir ocho mililitros de sangre de donante por muestra, registre el momento en que se extrajo la sangre e invierta suavemente cada tubo de ocho a 10 veces antes de transferir las muestras de sangre tratadas con anticoagulantes a cada uno de los tubos etiquetados para la radiación. Para muestras clínicas, centrífuga los tubos justo después de invertirlos.
Coloque los 0,2 tubos grises en un gabinete de rayos X precalentado, cierre la puerta y aplique una dosis de 0,2 grises a los tubos. Substituya los tubos irradiados en dosis bajas por los siete tubos grises y ajuste la dosis para aplicar una dosis de radiación de siete grises a las muestras de irradiación de dosis altas. Después de que ambas muestras hayan sido irradiadas, incube los tres tubos a 37 grados Centígrados durante una hora.
Transfiera las muestras a tubos de preparación celular antes de separar las células con centrifugación de alta velocidad, asegurándose de establecer las unidades como x g o RCF equivalente. Después de la centrifugación, vea los tubos contra un fondo oscuro para identificar el plasma, los glóbulos rojos y las capas de la capa buffy. Usando una pipeta serológica, transfiera aproximadamente la mitad del plasma a una centrifugadora cónica etiquetada de 15 mililitros sin alterar la capa de la capa buffy y almacene el tubo de plasma en hielo húmedo.
Luego, use una pipeta de pasto para transferir toda la capa de recubrimiento buffy que contiene PBMC a un nuevo tubo de 15 mililitros y agregue PBS a temperatura ambiente al PBMC a un volumen final de 15 mililitros por muestra. Mezcle suavemente las células por inversión cinco veces y recoja las células por centrifugación a una velocidad más baja, asegurándose de verificar las unidades de centrifugación. Aspirar todos menos los últimos 500 microlitros de sobrenadante sin molestar a los pellets.
Agregue PBS fresco a un volumen final de 10 mililitros a cada tubo y resuspend invirtiendo suavemente los tubos. Utilice 40 alícuotas microlitro de las células para contar. Después de contar, recoger las células con otra centrifugación y eliminar tanto sobrenadante como sea posible sin molestar a los pellets.
Para almacenar el PBMC para su posterior procesamiento, resuspend los pellets en 50 microlitros de PBS fresco por muestra con pipeteo suave y transferir cada suspensión de célula entera en un criovial etiquetado de 1,5 mililitros sobre hielo húmedo. Luego congele las celdas por el método preferido y colótelas en una caja de congelación a menos 80 grados. Registre la hora a la que se congelaron las celdas.
Alternativamente, resuspend los pellets en un mililitro o mezcla de congelación por muestra y transferir las suspensiones celulares a crioviales etiquetados individuales. Luego coloque los tubos y las cajas de congelación preenfriadas para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius. Para congelar el plasma, agregue hasta un mililitro alícuotas lotes del plasma hasta cada uno de cinco microtubos de dos mililitros sin alterar el pellet residual y registre el volumen total de plasma en cada tubo.
Luego, congele inmediatamente las alícuotas de plasma en una orientación vertical en un congelador de menos 80 grados Celsius. Para el análisis de Western blot de las muestras, resuspend el pellet en cada tubo con un volumen apropiado de tampón de lisis complementado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa igual al del volumen de pellets celulares con pipeteo suave e incubar las muestras de células durante 10 minutos en hielo. Al final de la incubación, transfiera las muestras a 1.5 tubos de mililitro y sonicéelos con tres ciclos de 30 segundos en 30 segundos a cuatro grados Celsius.
Recoger las muestras por centrifugación y transferir los sobrenadantes a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Luego, mezcle 40 microgramos por muestra con el tampón de carga y hierva las muestras durante cinco minutos. Cargue 20 microgramos de cada muestra por carril por duplicado en un gel de proteína 4-12% Bis-Tris y ejecute un SDS-PAGE.
El número de células obtenidas de ocho mililitros de sangre varía según el paciente y el ajuste de la enfermedad. En general, el pellet celular es pequeño en tamaño y blanco transparente en color. A veces, los pellets pueden tener cierta contaminación de glóbulos rojos, lo que tiene un efecto negativo en la calidad de la preparación.
Una producción típica de un paciente crónico de la leucemia linfocítica usando este protocolo varía a partir de la 1,62 por 10 al cuarto a 1,99 por 10 a las novenas células por la preparación mononuclear de la célula de ocho mililitros con una concentración final de la proteína que se extiende entre 1,62 a 19,77 miligramos por mililitro. En este análisis representativo de tres muestras de pacientes, se observó un aumento en las modificaciones postraduccionales a dosis más altas de radiación ionizante. Curiosamente, la fosforilación de la ataxia-telangiectasia mutada y RAD50 fue sustancial en la dosis baja de 0,2 grises, lo que sugiere que estas modificaciones postraduccionales pueden ser interrogadas factiblemente como biomarcadores farmacodinámicos para los tratamientos que implican la generación de roturas de doble cadena de ADN con un buen rango dinámico en el tumor, así como muestras de sangre periférica.
Para una preparación óptima de la muestra, procese la sangre dentro de una hora de la recolección a temperatura ambiente, centrifugse las muestras correctamente y vea el tubo contra el fondo oscuro para poder distinguir la capa buffy.
