Este protocolo proporciona dos métodos para movilizar a C.Elegans para realizar imágenes de calcio in vivo de los músculos de la pared del cuerpo. Este método puede ayudar a responder preguntas relacionadas con la homeostasis de calcio y el manejo del calcio, y una sinapsis accesible en organismos genéticamente manejables. Esta técnica puede proporcionar una mejor comprensión de los mecanismos que regulan la homeostasis de calcio muscular, y por lo tanto puede ser importante en la identificación de condiciones o vías moleculares que afectan el acoplamiento de contracción de excitación a través de la mala regulación del ciclo de calcio.
Estos métodos pueden proporcionar información sobre áreas de investigación, incluyendo, pero no limitado también, neurobiología, biología del desarrollo y biología celular. Estas técnicas podrían adaptarse para estudiar una variedad de tipos celulares y C.elegans, otros nematodos relacionados, así como larvas de filsafat. La demostración visual de este método es fundamental para que el experimentador pueda entender la técnica de disección y ser capaz de evaluar con precisión los transitorios de calcio de animales correctamente inmovilizados.
Comience configurando el microscopio para imágenes fluorescentes. Utilice una cámara CMOS científica capaz de tomar imágenes de cuadro completo a 100 hercios para realizar un seguimiento de los cambios rápidos en los niveles de calcio. Controle la adquisición de la cámara y la excitación fluorescente LED con un software de micromanager que se ejecuta en ImageJ.
Utilice un plug-in de plataforma electrónica de código abierto que se conecta a una placa de microcontrolador de código abierto externa para gestionar los pulsos de sincronización externos que controlan las excitaciones fluorescentes. Para controlar la lógica de temporización, active el protocolo de adquisición de microrúrmos en el software de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice dos LED para estimular la rodopsicina del canal con luz azul y registrar los cambios de RCaMP.
Active la rodopsin de canal con AM LED con la longitud de onda de admisión máxima de 470 nanómetros y un filtro de paso de banda, y excite RCaMP con un LED con una longitud de onda de admisión máxima de 594 nanómetros y un filtro de paso de banda. Conclare ambos LED y transmita la luz a la misma trayectoria óptica utilizando un combinador de haz dicroico. Controle la sincronización de la iluminación LED con interruptores de estado sólido controlados por señales TTL de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y establezca la intensidad del LED con las fuentes de alimentación lineales de ruido de carga controlada actual, luego programe el protocolo de simulación de luz azul en un simulador.
En este experimento encienda la simulación de luz azul después de dos segundos de capturar la fluorescencia RCaMP solamente y utilice un tren de cinco pulsos de luz azul de dos milisegundos con intervalos de 50 milisegundos para activar la rodopsila del canal. Si utiliza la preparación de la disección, realice la disección de C.elegans con poca luz. Coloque los animales en el plato de disección con la base de cubierta recubierta de silicona que se llena con un mililitro de solución extracelular de calcio preparada de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Pegue a los animales usando el adhesivo líquido tópico de la piel con coloración azul a lo largo del lado dorsal del gusano. Y hacer una incisión de cutícula lateral a lo largo de la interfaz de pegamento y gusano utilizando agujas de vidrio. Utilice una pipeta bucal para eliminar las vísceras internas de la cavidad del gusano, luego pegue el colgajo cutícula del animal para exponer los músculos de la pared del cuerpo medial ventral para la toma de imágenes.
Si utiliza la preparación de nano-perlas, haga una solución fundida 5%Agra utilizando agua destilada a un volumen final de 100 mililitros. Utilice una pipeta Pasteur para colocar una gota de solución de molte-Agra en un portaobjetos de vidrio e inmediatamente coloque una segunda diapositiva de vidrio sobre la parte superior usando suavemente la presión para crear una almohadilla de Agra uniforme. Retire la corredera superior y a aproximadamente cuatro microlitros de nano-perlas de poliestireno en el centro de la almohadilla.
A poca luz añadir de cuatro a seis C.elegans en la solución de nano-perlas, asegurándose de que los animales no se acosten uno encima del otro, y cuidadosamente colocar un cubreobjetos en la parte superior. Cuando esté listo para la imagen, coloque la diapositiva o la placa de disección preparada en el microscopio y busque y concéntrese en un gusano utilizando un aumento de 10 veces y una iluminación de campo brillante tenue. Cambie a 60 veces el aumento en la excitación fluorescente RCaMP para identificar un músculo de pared corporal medial de ventrum que es anterior a la vulva y en el plano vocal correcto.
A continuación, cambie la ruta de la imagen del ocular a la cámara tirando del interruptor y haciendo clic en vivo dentro del software de adquisición de datos. Haga clic en el botón ORI en el software de adquisición de datos y cree un cuadro alrededor del músculo en el que se está centrando. En el estimulador, active la vía de estimulación de luz azul previamente programada y, a continuación, haga clic en Adquirir en el software de imágenes para capturar la imagen.
Cuando los C.elegans se cultivan en la retina totalmente trans, incorporando con éxito la retina y activando el canal rodopsino, se puede evocar un transitorio de calcio. Si los animales no están expuestos a la retina trans, no se desencadena ningún transitorio de calcio muscular. Este protocolo se utilizó para investigar la pérdida de la función de los mutantes sca-1, que afectan a la bomba de calcio retículo sarcoplasmático codificada por el gen sca-1.
Sin embargo, la preparación de la disección aumenta en los niveles basales de fluorescencia RCaMP en comparación con el control, lo que sugiere que la mutación necesita los niveles elevados de calcio citoplasmático en reposo. Hubo una disminución significativa en los niveles máximos de calcio en los mutantes sca-1 en comparación con el control. Sin embargo, no se vio ningún cambio en el tiempo pico o el tiempo de media descomposición.
Es importante destacar que se pueden observar resultados similares utilizando la preparación de nano-perlas menos difícil técnicamente. Se evaluó la pérdida de la función de los eslo-mutantes, que interrumpen los grandes canales de potasio activados con calcio para investigar a los mutantes que indirectamente afectan el manejo del calcio en C.elegans. Cuando se midieron los niveles basales de RCaMP, los mutantes mostraron un aumento de la fluorescencia en comparación con los controles.
Al evaluar la cinética del calcio no se observaron cambios en los niveles máximos de calcio. Los mutantes slo-1(eg142), sin embargo, exhibieron un aumento significativamente mayor a la hora punta. El paso más importante a recordar al completar el procedimiento es preparar animales experimentales en retina totalmente trans.
Sin este paso, la rodopsin del canal estará inactiva, evitando que se activen transitorios de calcio inducidos por la luz. Después de este procedimiento, se puede realizar una electrofisiología y un análisis conductual para evaluar el impacto funcional de cualquier cambio observado en la homeostasis del calcio. Usando los métodos de inmovilización descritos aquí, allana el camino para una mayor exploración de la dinámica del calcio y demuestra que se pueden observar resultados comparables en respuesta a la estimulación neuronal optogenética y la captura de transitorios de calcio muscular utilizando la técnica de inmovilización de cuentas mucho menos desafiante.
