The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

<ol>
	<li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+phenotypic+gap:+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7 (2008).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans,+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor.">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li><li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor.">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503 (2012).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells.">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li><li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+the+Crabtree+effect:+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants.">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li><li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tobacco-specific+nitrosamine+4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone+(NNK)+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content,+transcription,+ATP+production,+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans.">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).</li><li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism.">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li><li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors.">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases.">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li><li>Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).</li><li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+in+chemical+biology:+a+compendium+of+inhibitors,+mechanistic+evaluation+of+chemotypes,+and+suggested+use+as+a+reporter.">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li><li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism.">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li><li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function.">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li><li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development.">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li><li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans.">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li><li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development.">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li><li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods.">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877 (2013).</li><li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7,+two+major+components+of+the+hypodermis.">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li><li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما تكشف

الكائن الحي نموذج C. يوفر ايليجانس نظام تجريبي قوي. فمن السهل أن تنتج ثقافة وفيرة ذرية متطابقة جينيا مع دورة حياة 3.5 يوم من البيض لاستنساخ الكبار (عبر مراحل اليرقات الأحداث L1 حتى L4). ونظرا لصغر حجمه، فإنه يمكن زراعتها بشكل ملائم في لوحات 96-جيدا، وتسهيل فحص المركبة. نقدم بروتوكول الفحص المظهري بناء على سلالات C. ايليجانس التي تقوم بدور في الجسم الحي أجهزة الاستشعار من مستويات الطاقة. 14 البروتوكول ينطبق على أي مختبر، على الرغم من أن هناك حاجة إلى luminometer لوحة 96-جيدا والحكومة العقيمة. من المهم لمنع التلوث في فحوصات باستخدام تقنية المختبرات الجيدة. إذا كان يعمل يدويا، والحد الأقصى لعدد لوحات الديدان الخيطية يمكن تحقيقه هو 13 في التجربة السماح للاختبار 2X لوحات المخدرات 96-جيدا وبينهم اثنان من لوحات المركبات. يتم عرض نتائج ممثل للمجمع الميتوكوندريا I المانع rotenonه، مولد الباراكوات الفائق، ودورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسطة وأربع مركبات مع المعروف النشاط المثبطة يراعة luciferase. أدت المركبين الأولى إلى انخفاض في تلألؤ بيولوجي كما كان متوقعا في حين أوكسالوآسيتات أدى إلى تعزيز، من المرجح أن يؤدي من جيل أكبر من ATP. تظهر أيضا مجموعات البيانات أوكسالوآسيتات التغير الجوهري في تجاربه التي تستند إلى يراعة luciferase كمراسلة. ما لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة لا ينصح للتأكد من متانة الردود على مركبات غير معروفة. وتثبيط النشاط يراعة luciferase التعرف مع فحص في المختبر باستخدام طقم التجارية. 3 واحدة من المركبات أدى إلى زيادة كبيرة في GFP مضان بما يتفق مع مثبط زيادة مستويات يراعة luciferase المراسل ملزمة لانزيم luciferase المراسل النشط الموسومة GFP الموقع، وجعله أكثر استقرارا. 15 وفي بعض الحالات(وليس في هذه الحالة بالذات) وهذا يمكن أن يؤدي إلى زيادة مستويات تلألؤ بيولوجي عند النازحين المانع من قبل الركيزة الزائدة. 15. ولذا، من المهم عدم تفسير النتائج خطأ من المركبات التي تتفاعل مع انزيم يراعة كما انخفضت أو زيادة مستويات ATP / وظيفة الميتوكوندريا. التغييرات في إشارة التلألؤ في كثير من الأحيان ترتبط مع قياسات إضافية للصحة مثل الحركة والتطور والنمو. وكمثال على ذلك، وهو مركب هو luciferase المراسل المانع المشتبه به إذا تم الكشف عن الانخفاض الكبير في إشارة تلألؤ بيولوجي لكن الديدان لا يمكن تمييزها من الضوابط من خلال الملاحظة المجهرية. زيادة في GFP مضان، لا يفسر النمو أو مركب تألق ذاتي، قد يشير أيضا إلى المانع. ومن المعروف أن عددا من مثبطات luciferase المراسل 15، وقد دخلت حيز PubChem. لذلك، في المقام الأول، بل هو ممارسة جيدة للتشاور معلومات عن مثبطات luciferase المراسل تحتجزهم PubChem. تليها رesting من آثار مركب في فحوصات في المختبر مع انزيم المنقى 3 و / أو تأكيد من آثار على وظيفة الميتوكوندريا من قبل وسائل إضافية. 16،17 قياسات GFP مضان تمكين الكشف عن مستويات يراعة luciferase (والكشف المحتمل لبعض مثبطات انزيم luciferase المراسل كما نوقش أعلاه) مما يجعل حجة قوية لقياس هذه النهاية جنبا إلى جنب مع تلألؤ بيولوجي حيثما كان ذلك ممكنا. تطبيع قراءات تلألؤ بيولوجي لGFP هو أيضا وسيلة لتوضيح أسباب الاختلاف في الأرقام دودة بين الآبار (على الرغم من أن هذا يمكن أيضا أن يتحقق عن طريق إدراج مكررات التقنية متعددة). لمزيد من حساسية، من المهم طرح مضان الخلفية من القراءات. بروتوكول يقيم مساهمة تعليق البكتيرية إلى مضان الخلفية، ولكن لا تمثل الديدان الخيطية تألق ذاتي ل(وجود قيود على الفحص الحالي، حاسمة بشكل خاص لأي ستو الشيخوخةوفاة بالنظر إلى أن الزيادات الخيطية تألق ذاتي مع التقدم في السن). وينبغي أيضا تقييم تألق ذاتي من المركبات اختبار في نفس الوقت. سوف GFP تطبيع يبدو لا غنى عنه حيث يرغب الباحثون على التكيف بروتوكول لمقارنة حمامات ATP الخلوية في المسوخ وراثية مختلفة، أو بعد إسكات الجينات المختلفة، من أجل السيطرة على أي اختلافات الضغط على مستوى التعبير عن التحوير تلألؤ بيولوجي. وتشمل المعايير الضرورية ضمن بروتوكول المرحلة التنموية التي يبدأ التعرض، ومدة التعرض، والحصول على أرقام مماثلة من الديدان الخيطية في آبار مختلفة. التعرض يمكن أن يبدأ في أي مرحلة من مراحل التنمية من الديدان الخيطية، ولكن مرحلة L3 أو أقدم الأفضل. من هذه المرحلة على والديدان الخيطية تعتمد على الفسفرة التأكسدية للتنمية في مرحلة البلوغ، كما يتضح من زيادة كبيرة جدا في المحتوى و mtDNA، واستهلاك الأوكسجين ومستويات ATP. 18،19،20 هذا البروتوكول يبدأ المعارضلدى عودتهم في المرحلة L4. سبب aliquoting الديدان الخيطية لوحات 96-جيدا فقط في هذه المرحلة (وليس عندما قدمت لأول مرة في المواد الغذائية في مرحلة L1)، هو أنه على الرغم من وضع لوحات في غرف رطبة لتقليل التبخر، وعلى درجة التبخر لا يزال يحدث في لدينا حاضنة الهز، وينظر إليها على أنها قطرات صغيرة جدا تتشكل على الجفن (وهذا قد لا يكون مشكلة مع حاضنات تهز أخرى). بواسطة aliquoting الديدان الخيطية لوحات قبل إضافة معايير المخدرات، لا يتأثر تركيز الدواء الفعلي من قبل أي اختلاف صغير في الحجم بسبب التبخر. تحميل لوحة الخيطية مع السيارة هو مفيد فقط للتأكد من أن الديدان الخيطية وزعت بالتساوي بين الآبار. فإن أي اختلافات كبيرة تم العثور عليها ل السيارة لوحة فقط يكون مؤشرا على تقنية الفقيرة في الاستغناء عن النيماتودا إلى الآبار. طول التعرض هو عامل مهم للنظر فيها. إذا كانت الآثار على وضع الطاقة بشكل مستقل من النمو هي التي تهم، والمؤيديمكن تعديل tocol لاستيعاب التعرض أقصر (من استجابات فورية تقريبا، على سبيل المثال، 2 ساعة). من ناحية أخرى، دخول المركبات إلى C. الأنسجة ايليجانس قد يستغرق بعض الوقت. على سبيل المثال يطلب من 12-24 ساعة لتحقيق أقصى قدر من تركيزات الداخلية ريسفيراترول و 5 الفلورية 2&#39;-deoxyuridine (FuDR). 21 لذلك، التعرض الطويل (18-24 ساعة) قد يكون له ما يبرره لتحقيق أقصى قدر من مستويات التعرض. الساعة التعرض ينبغي أن يقتصر على الأوقات التي لا تسمح مستويات كبيرة من الاستنساخ الذي سيعقد في البئر. ونحن نوصي بأن الوقت التنموي الكلي للالنيماتودا يتم الاحتفاظ تحت 66-67 ساعة. على الرغم من مريحة، وحامل الديدان الخيطية في ذلك الوقت، وقد بدأت egglaying. ومع ذلك وجدنا قراءات تلألؤ بيولوجي من الاستعدادات البيض لا تذكر (لا يظهر). يتم الكشف عن سور 5 المروج يحركها التعبير التحوير أول اثنين فقط لمدة سنتين وبعد نصف ساعة الإخصاب في مرحلة 100 خلية 22 وجومن المرجح أن تحد من دخول وسيفيرين قشر البيض hitinous. ووجد آخرون أن البيض المحتوي لم تساهم بشكل كبير في عملية التمثيل الغذائي للبالغين حامل. 23 ومع ذلك، والظروف التي تسمح بانتاج كبير ذرية هي التي ينبغي تجنبها. إذا كان يفضل، والجدول الزمني التجريبي يمكن أن تحول مرة أخرى: بادرنا قبل التعرض لسموم البيئية في أواخر L3 مرحلة اليرقات (36 ساعة) والتي أجريت القياسات تلألؤ بيولوجي وGFP في 55 ساعة 2 الخلفيات بدلا من ذلك، الوراثية التي هي عقيمة مشروط. يمكن استخدامها لمنع إنتاج ذرية، وعلى سبيل المثال فر-15 (B16) II. لا ينصح فيم-1 (hc17) IV متحولة المزدوج الذي لا يمكن الحفاظ عليه في 15 ° C، ولكن غير معقمة في 25 ° C. 24 استخدام FuDR للحث على العقم وهذا يمكن أن يؤثر في حد ذاته عملية التمثيل الغذائي الديدان الخيطية. 25 الفحص يمكن أن كما أن يؤديها في التوترات مع البشرة أكثر نفاذية مثل جزئية الخسارة من وfunctأيون حافلة 8 المسوخ التي هي نتيجة لزيادة نفاذية الأدوية الحساسة للأدوية المتعددة. 26 وهذا يسهل التعرض أقصر وتركيز مركب أقل. الشروط لإضافة وسيفيرين لهذه الديدان الخيطية يمكن أيضا تحتاج التعديل أي 1٪ DMSO و 0.05٪ تريتون-X100 في المخزن المؤقت التلألؤ قد لا تكون هناك حاجة لتعزيز توافر وسيفيرين. يستخدم بروتوكول 1٪ DMSO كما سيلة لتسليم المجمع. وإن لم يكن قاتلا، وهذا تركيز DMSO لديه بعض التأثيرات البيولوجية كما ناقشنا في منشور السابق. 3 العديد من المكتبات المخدرات المتاحة مستعدون في 100٪ DMSO، بتركيزات من شأنها أن تكون مناسبة لفحوصات خلية القاعدة بعد التخفيف من السيارة إلى 0.1٪. ويلزم تركيز مركب أعلى للحصول على ردود في C. ايليجانس بالمقارنة مع الخلايا البشرية، بحيث غالبا ما يكون من غير الممكن إجراء فحوصات على أقل من 1٪ DMSO. مرة أخرى، واستخدام سلالات معقد يؤدي المزيد من البشرة منفذة لاختبار مع تركيزات أقل من المركبات. لا ينصح تركيزات DMSO أعلى من 1٪. ينبغي التقيد الوقت المحدد الحضانة مع وسيفيرين قبل قراءات ل. كما هو موضح سابقا، التلألؤ يصل أقصى مستويات لها في الدقيقة الثانية بعد إضافة وسيفيرين، وتبقى مستقرة نسبيا لأول 5 دقائق، تليها انخفاض تدريجي بطيء في التألق على مدى 30 دقيقة المقبل 1. ويمكن إجراء استجابات حركية لمادة كيميائية معينة من خلال هذه المرحلة الأولية من 30 دقيقة بعد الاستغناء الأولي من وسيفيرين. ويشمل البروتوكول خطوة جوعا بعد جمع البيض لتحقيق التزامن من السكان الديدان الخيطية. نوصي تزامن السكان اختبار النيماتودا منذ مراحل النمو المختلفة تختلف في مستويات ATP الخلوية وربما تستجيب بشكل مختلف للمركبات الاختبار. من خلال تنفيذ المجاعة في S كاملةمتوسطة بالمقارنة مع M9، يتم توفير الديدان الخيطية الفقس مع مصدر الكربون (الإيثانول)، بحيث اليرقات لا تتطور ولكنها لا تفتقر تماما. 27،28 كما تبين أن القبض على L1 وتستعد للاستجابة السريعة في الغذاء و ويتم تحقيق معدل نمو L1 العادي في غضون 3 ساعة بعد الغذاء تصبح متوفرة. 29 ومع ذلك، فإنه احتمال أن الخطوة المجاعة قد يغير التمثيل الغذائي للC. لا يمكن استبعاد ايليجانس. 30 لهذا السبب طول الجوع يجب أن لا تتجاوز 24 ساعة (18 ساعة كافية لمزامنة). قد يكون بعض المختبرات في إمكانية استخدام COPAS Biosorter لمزامنة عمر تجاوز الخطوة الجوع تماما. قد يكون غيرها من المختبرات تفضيل لتوسيع السكان الخيطية على وسائل الاعلام الصلبة (لوحات NGM مع OP50) قبل التبييض (الخطوة 3.1) وهذا سوف تعمل بشكل جيد جدا. نحن نستخدم S المتوسطة خلال التعرض مجمع كوسيلة القياسي لالنيماتودا زراعة، howeveص يمكن اختيار وسيلة أخرى، على سبيل المثال K متوسطة أو معتدلة EPA الماء العسر غالبا ما تستخدم للدراسات السمية البيئية. 31،32 وينص البروتوكول وسيلة لفحص وتحديد المرشحين لإجراء مزيد من التجارب من حيث الآثار المترتبة على وظيفة الميتوكوندريا. في مرحلة الفرز الأولية أنه من المحتمل أن يكون قد تم تفويت بعض المركبات بسبب تركيز واحد فقط يجري اختبارها، وبالتالي لا ينبغي النظر شاشات المخدرات شاملة. يضرب يمكن التحقق من صحة عن طريق استخدام تقنيات لتقييم جوانب مختلفة من وظيفة الميتوكوندريا للاستهلاك الأكسجين سبيل المثال، C. ايليجانس سلالات مع GFP معربا عن الميتوكوندريا، البقع على إمكانات غشاء الميتوكوندريا و / أو القياسات ROS. 16،33،34 أعظم أهمية المنهجية هو أن يكون وسيلة لفحص عدد كبير من المركبات و / أو شروط على المستوى العضوي متعددة الخلايا، والأهم من ذلك أن تكون قادرة على الاستفادة من الالبريد قابلية الإستطراق الجيني للC. ايليجانس للتحقيق في آليات العمل. تقنية قد تساعد على تسريع وإيجاد مسارات جديدة لاكتشاف مركبات والأهداف مثيرة للاهتمام. ومن المتصور أن الجمع بين أجهزة الاستشعار مع خلفيات وراثية مرتبطة الأمراض التي تصيب البشر لفرز مجموعات المركبات الكيميائية في سياق ذي صلة المرض سيكون لها الكثير لتقدمه.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقدير سريع للوضع الطاقة في C. ايليجانس في الجسم الحي بهدف استخدام هذا بمثابة نقطة النهاية في فحص المركبة. ويستند هذا المنطق على التعبير المعدلة وراثيا من يراعة luciferase في C. الخيطية ايليجانس 1-3 عن طريق البلازميد pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> وتنصهر انزيم luciferase المراسل إلى بروتين الفلورية الخضراء GFP وأعرب جوهري وبتواجد مطلق في السيتوبلازم (تم إزالة بيروكسية luciferase المراسل استهداف إشارة). وهذا يؤدي إلى انبعاث الضوء عندما يتم توفير الركيزة luciferin خارجيا. كما الدودة شفافة، وعلى ضوء يمكن قياسها في luminometer وحدات الخفيفة النسبية (RLU). الوقود ATP الخلوية رد فعل تلألؤ بيولوجي وتوافره يحدد مستويات الخفيفة المنتجة. ونتيجة لذلك، luminometry يقدم مريحهر يعني تقييم مستويات ATP النسبية وبالتالي وظيفة الميتوكوندريا، لأن إنتاج ATP يحدث بشكل رئيسي في الميتوكوندريا. وقد ثبت وجود صلة بين مستويات ظيفة وتلألؤ بيولوجي الميتوكوندريا سابقا من خلال إسكات الجينات الميتوكوندريا سلسلة نقل الإلكترون ويصاحب ذلك انخفاض ناتج الضوء. 1 سلالات تلألؤ بيولوجي ولدت وعينت PE254 (feIs4) و PE255 (feIs5) 1 (انظر قائمة المواد)، ويمكن أن تستخدم بالتبادل. 3 وقد استخدمت عدد من الدراسات هذه السلالات استشعار للإبلاغ عن مستويات ATP الخلوية في الجسم الحي بعد التعرض لمواد كيميائية مختلفة أجنبي بيولوجيا مثل أزيد الصوديوم 1، الكادميوم 2 والصرف الصحي استخراج الحمأة 3، 5&#39;-الفلورية 2-deoxyuridine 6، ونيتروسامين التبغ محددة 7. وكانت سلالات من المفيد أيضا رصد تأثيرات التعرض للأشعة فوق البنفسجية C <sتصل&gt; 8 وآثار تعطيل سلسلة الميتوكوندريا وظيفة الجهاز التنفسي. 1،9 كما تم استخدام نسخة مبكرة من أجهزة الاستشعار التلألؤ التعبير عن الجينات luciferase المراسل دون الانصهار GFP (PE39) في التحقيق في آثار المعادن الثقيلة وعلى الجهاز التنفسي . uncoupler 10 سلالات PE254 PE255 وتحمل luciferase المراسل: تبين GFP الانصهار وGFP مضان لزيادة متناسبة مع النيماتودا الإعلام، حيث تتيح وسيلة مريحة للتطبيع القيم التلألؤ 6،9 آثار مبلغ الفرق من الديدان لكل بئر ويمكن أيضا أن يكون. تؤخذ بعين الاعتبار من قبل بما في ذلك مكررات تقنية متعددة في مقايسة (ما لا يقل عن 5 آبار في حالة). 3 بروتوكول يتيح إمكانية الرصد في الجسم الحي من مستويات الطاقة (على العكس من أكثر شاقة من الناحية الفنية في المختبر قرارات ATP) مما يتيح فحص المركبة وتغيير وضعيتها في سياق الفسيولوجية لمو كلهكائن lticellular. ويمكن تمديد هذا الإجراء إلى مجموعة متنوعة من خلفيات وراثية عن طريق عبور التحوير متكاملة صبغويا إلى سلالات متحولة المتاحة و / أو إسكات الجينات التي تدخل الحمض النووي الريبي. وهكذا، مع الاستفادة الكاملة من C. ايليجانس بوصفه الكائن نموذج. يجب أن الأسلوب تساعد في الحد من فشل المرحلة في وقت متأخر من المرشحين المخدرات نظرا لسمية الميتوكوندريا وتقديم مساهمة نحو الحد من أعلى التجارب على الحيوانات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Orion II Microplate Luminometer</td>
			<td>Berthold Detection Systems</td>
			<td></td>
			<td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLx800 fluorimeter&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ks 130 basic shaking platform</td>
			<td>Ika</td>
			<td>#0002980000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4349</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Refrigerated incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with eppendorf rotor A-4-44&#160; (for 50/15ml tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette, Costar</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#4489</td>
			<td>Serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 50 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 15 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile spatula</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3007; #3004</td>
			<td>for weighing out chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mM Millex GP filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well assay plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3603</td>
			<td>Black plate clear bottom with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 well assay plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#236105</td>
			<td>White plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir reagent 60 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Finnpipette</td>
			<td>#9510027</td>
			<td>used as trough for nematodes&#160; in protocol section 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage box/damp chamber</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#10 800 058 001</td>
			<td>174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#239305</td>
			<td>Store in aliquots at 4&#176;C,&#160; seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, potassium salt</td>
			<td>Biotium Inc</td>
			<td># 10101-2</td>
			<td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 &#176;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#317275</td>
			<td>Purity 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A16046</td>
			<td>Diltute to 10% in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#475914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans bioluminescent strains</td>
			<td>Author&#39;s own laboratory</td>
			<td>PE254, PE255</td>
			<td>contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General chemicals</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

وقد تم الحصول على نتائج ممثلة لتوضيح طريقة لروتينون (الشكل 1)، الباراكوات (الشكل 2)، أوكسالوآسيتات (الشكل 3)، و 4 مركبات التي تم انتقاؤها مثبطات كما يراعة luciferase خلال فحص مكتبة المخدرات 13 (الشكل 4). وقد بدأ التعرض للمخدرات في المرحلة L4 في جميع الحالات، ولكن بدأت تجارب التعرض ترابل في 41 ساعة بعد الغذاء قدمت أول من الديدان الخيطية مقارنة مع 45-46 ساعة للمركبات الأخرى. بروتوكول يسمح للحصول على درجة من المرونة في اختيار الوقت المناسب للبدء من التعرض للمخدرات وطول التعرض. ينبغي التقيد ومع ذلك، لأغراض الفحص، تعيين أوقات الى المفضلة مرة واحدة، لاستنساخ بين التجارب. يجب أن تقاس النهاية من قبل 66-67 ساعة وقت التنموية من أجل منع واسعة وضع البيض والتفريخ من ذرية في الآبار. يتم توفير مبادئ توجيهية للتوقيت في Tقادرة 1. روتنون، وهو مجمع الميتوكوندريا I المانع، تخفيض تلألؤ بيولوجي بعد كل من قصيرة نسبيا (2 ساعة) وأطول التعرض (24 ساعة) لمجموعة من تركيزات (الشكل 1). في هذه الحالة، لم تتخذ أية قياسات GFP، ولكن عدد مكررات التقنية المستخدمة (ن = 6) كافية لمعادلة أية اختلافات في أرقام دودة بين الآبار 3. تعرض 24 ساعة هو نافذة الزمنية التي تنمو الديدان الخيطية، والتنمية أبطأ نتيجة معقدة I تثبيط كان من المتوقع أن تسهم في انخفاض تلألؤ بيولوجي. هذا ما أكده الملاحظة البصرية تحت المجسام مع تطوير تأخر ينظر إليها، ولا سيما في تركيزات 20 ميكرومتر وأعلاه؛ بالإضافة لوحظ بعض الفتك من 40 ميكرومتر (الملاحظات النوعية لا كميا). ولم يلاحظ أي الفتك بعد التعرض 2 ساعة ولكن ظهرت التأثيرات على حركة الدودة. انخفاض حاد في تلألؤ بيولوجي بالنسبة لضوابط occurred في أقل تركيز من روتينون اختبار 2.5 ميكرومتر، والتي الآثار لم يتم الكشف بسهولة عن طريق الملاحظة البصرية السريعة في 2 التعرض ساعة. هذا الانخفاض في تلألؤ بيولوجي يتسق مع انخفاض ATP الخلوية. وقد تحقق تثبيط القصوى بأقل تركيز روتينون المستخدمة (2.5 ميكرومتر) مشيرا إلى أن أي تجارب لاحقة تستهدف روتينون على وجه التحديد يجب أن تنفذ بين 0 و 5 ميكرومتر [نطاق تركيز 0-160 ميكرون تم اختيار كجزء من المقارنة مع أدوية أخرى حددت في البداية وجود آثار كبيرة على 10 ميكرومتر (التي سيتم نشرها في مكان آخر)]. والباراكوات مبيدات الأعشاب تؤثر على وظيفة الميتوكوندريا من خلال زيادة أنواع الاكسجين التفاعلية. هنا، علينا أن نظهر تأثيرها على تلألؤ بيولوجي من C. ايليجانس السلالة PE254 بعد التعرض لمجموعة من تركيزات لمدة 24 ساعة (الشكل 2). كما سلالة يحمل لوك :: الانصهار GFP، كان GFP مضان المرضس قياس كوسيلة للتطبيع. انخفضت 6،9 ترابل تلألؤ بيولوجي، GFP مضان وتلألؤ بيولوجي تطبيع بشكل ملحوظ. وأشار الاختبار اللاحق-Dunnet أن تركيزات الباراكوات مع وجود اختلافات كبيرة فيما يتعلق السيطرة على السيارة وكانت 4 و 8 مم للتلألؤ بيولوجي وتلألؤ بيولوجي تطبيع، فضلا عن 2 ملم لتلألؤ بيولوجي تطبيع. وكان تركيز الوحيد تخفيض كبير GFP مضان 8 ملم، والتركيز على شوهدت فيها آثار للنمو ودودة الميتة عرضية (الملاحظات النوعية). كان الانخفاض في تلألؤ بيولوجي (وتلألؤ بيولوجي تطبيع) أكبر من مضان، بما يتفق مع انخفاض وظيفة الميتوكوندريا والآثار على إنتاج ATP. دورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسط ​​اختبارها على C. ايليجانس السلالة PE254 بتركيز واحد من 8 ملم، أدى إلى زيادة في تلألؤ بيولوجي (الشكل 3). لا GFP يتألقتم الحصول على قياسات الامتحانات التنافسية الوطنية أو إجراء الملاحظة البصرية إضافية خارج. ولكن هذه الاستجابة إلى تركيز واحد سوف تستحق المزيد من التعرض تأكيدي على مجموعة من تركيزات، وملاحظات أكثر تفصيلا من الآثار. تعزيزا لتلألؤ بيولوجي هذا المركب ليس من المستغرب كما أنها يمكن أن يفترض أن تؤدي إلى مزيد من النشاط في دورة حمض الستريك، مع زيادة في نهاية المطاف إنتاج ATP (مع ذلك سيكون من المستحسن للسيطرة على أي آثار على مستويات luciferase المراسل عن طريق تقييم GFP مضان في تجارب لاحقة). مجموعات البيانات أوكسالوآسيتات أظهرت تكشف عن مدى التباين في استجابة ينظر في تجاربه التي تستند luciferase المراسل. في تجربتنا هذه التقلبات هو سمة من سمات نظام الاختبار وخاصة لظروف التعرض أقل ضررا. المركبات المثبطة يراعة luciferase DDD00001434، تم اختبار DDD0001477، DDD00000635 وDDD00023047 على حد سواء في المختبر من خلال النظر في الآثار المترتبة على بوانزيم rified والحية باستخدام C. ايليجانس لوك: GFP معربا عن سلالة. لم يكن هناك أي دليل على أن أيا من مركبات اخضعت للاختبار تسبب في وفاة الخيطية تحت ظروف التعرض. جميع المركبات 4 أثرت على luciferase النشاط في المختبر على تركيزات 2 اختبار 25 و 100 ميكرومتر (الشكل 4A). DDD00001434 قتل نشاط luciferase المراسل تنقيته تماما تقريبا، والتي قدمت لتبرير معقول لتراجع كبير في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي في (الشكل 4B). على الرغم من أن في المختبر والمقايسات فيفو لا يمكن مقارنتها مباشرة، كانت ردا على DDD00023047 مماثلة في كل من المقايسات. تسبب DDD0001477 وDDD00000635 انخفاضا أكبر في الجسم الحي مما كانت عليه في في المختبر. وقدمت هذه المركبات إلى الديدان الحية 22 ساعة قبل الركيزة وسيفيرين، ويمكن أن تعكس النتائج التي لم ينزحوا بسهولة من موقع نشط luciferase المراسل عندما أصبح وسيفيرين افاعيlable و. بدلا من ذلك، قد DDD0001477 وDDD00000635 يكون لها تأثير إضافي على مستويات ATP الخلوية. وهذا من شأنه أن يتم تقييمها بواسطة الوسائل التي لا تنطوي على يراعة luciferase. من المذكرة هو تعزيز قوي للإشارة GFP في الديدان الحية تتعرض لتفاقم DDD00000635. وسيناقش هذا أدناه. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> الشكل 1. مجمع الميتوكوندريا I المانع انخفض روتينون وضع الطاقة في C. ايليجانس مقاسا تلألؤ بيولوجي من سلالة PE254. المتزامنة L4 مرحلة الديدان (45-46 ساعة بعد الغذاء المقدم لليرقات L1) تتعرض ل0، 2.5، 5، 10، 20، 40، 80 و 160 ميكرومتر روتينون في 1٪ DMSO ل2 ساعة (قصيرة) أو 24 ساعة (التعرض الطويل) قراءات مسبقة من تلألؤ بيولوجي على التوالي في 48 و 69 ساعة من وضع دودة بعد توفير الغذاء. وأعرب تلألؤ بيولوجي (وحدة النسبية وحدات خفيفة، RLU) كنسبة مئوية من السيارة (1٪ DMSO) القيم. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية في كل تركيز روتينون (ن = 6). أسفرت عن تركيزات اختبارها في غاية الاختلاف ذات دلالة إحصائية فيما يتعلق السيطرة على السيارة (P &lt;0.001). <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> الشكل 2. الباراكوات الأكسدة الضغوطات انخفضت وضع الطاقة في C. تعرضت ايليجانس السلالة PE254 بطريقة تعتمد على التركيز (تقاس تلألؤ بيولوجي). المتزامنة L4 الديدان المرحلة (للراحة في هذه الحالة في 41 ساعة بعد الطعام المقدمة للL1 اليرقات) إلى 0، 0.25، 0.5، 1، 2، 4 أو 8 ملي الباراكوات لمدة 24 ساعة. وقد استخدم مضان GFP (وحدة وحدات مضان النسبية، RFU) لتطبيع البيانات تلألؤ بيولوجي (وحدة RLU)، وكلاهما النهاية حصلت على 65 تنمية الموارد البشرية. يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من الضوابط (1٪ DMSO). أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية(ن = 5 لتركيزات مختلفة، ن = 18 للضوابط). في اتجاه واحد ANOVA: *** P &lt;0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> الشكل 3. دورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسط ​​(8 ملم) تعزيز تلألؤ بيولوجي من C. تعرضت ايليجانس السلالة PE254. المتزامنة L4 مرحلة الديدان (45-46 ساعة بعد الغذاء المقدم لليرقات L1) إلى طازجة 8 ملي أوكسالوآسيتات لمدة 18 ساعة ± 30 دقيقة. تم قراءة تلألؤ بيولوجي (وحدة RLU) في وقت التنموي من 63.5 ساعة ± 1 ساعة وكنسبة مئوية من السيطرة على السيارة ([ده 2 O). وتمثل أعمدة مختلفة مجموعات البيانات المختلفة من 8 مكررات التقنية المخصصة لمختلف 96 لوحات جيدة داخل نفس التجربة. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 8). 2 طريقة ANOVA مع &quot;مجموعة&quot; و &quot;تركيز&quot; كعوامل: ̵6؛ مجموعة &quot;P&gt; 0.05، &#39;&#39; ع تركيز &lt;0.001 و مصطلح التفاعل P&gt; 0.05. A <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> الرقم 4. اختبار الردود على 4 مركبات من اكتشاف المخدرات مكتبة مجمع دندي 13 (C1: DDD00001434، C2: DDD0001477، C3: DDD00000635 وC4: DDD00023047) مع النشاط المثبطة معروف على يراعة luciferase المراسل التلألؤ. (A) تأثير المركبات على نشاط تنقية يراعة luciferase (قياس وحدات خفيفة، RLU)، معبرا عنه كنسبة مئوية من السيطرة على السيارة. تم استخدام ATP تلألؤ بيولوجي CLSII مجموعة (روش، مانهايم، ألمانيا) وفقا لتعليمات بنفس كمية الانزيم luciferase المراسل aliquoted إلى الآبار (أبيض 96 ثالذراع لوحات عيار مكروي). وقدمت ATP في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر و 1 ميكرولتر من مركب (تركيز النهائي أشار) أو أضيفت DMSO (1٪). تم دمج إشارة التلألؤ لمدة 10 ثانية. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 4). تحليل: في اتجاه واحد ANOVA. * P &lt;0.05 أو *** P &lt;0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة. الاختلافات بين 25 و 100 ميكرومتر هامة للغاية لC1 (DDD00001434؛ P &lt;0.001)، وهامة لC2 و C3 (على التوالي DDD0001477 وDDD00000635؛ P &lt;0.05). (ب) في الجسم الحي قياسات تلألؤ بيولوجي، تلألؤ بيولوجي تطبيع لGFP مضان و GFP مضان من C. ايليجانس السلالة PE254 في 67 ساعة وقت التنموية بعد التعرض لمركبات الاختبار لمدة 22 ساعة. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 8). تحليل إحصائي قامت (واحد طريقة ANOVA) للخروج على البيانات المجمعة من 3 مجموعات البيانات (3 XN = 8). * P &lt;0.05 أو *** P &lt;0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة المعنية. مختلفاالمجال الاقتصادي الموحد بين 25 و 100 ميكرومتر فقط يعتد به إحصائيا (P &lt;0.05) للتلألؤ بيولوجي تطبيع بعد التعرض لC4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> وقت اليوم </td><td> اليوم 1 </td><td> يوم 2 </td><td> اليوم 3 </td><td> اليوم 4 </td><td> اليوم 5 </td><td> اليوم 6 </td><td> يوم 7 </td><td> اليوم 8 </td></tr><tr><td> 10/09 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> خطوة 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> خطوة 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 4 </td><td> خطوة 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><tد&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> الخطوة 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. نظرة عامة على خطوات البروتوكول التي يتعين القيام بها في كل يوم من التجارب الخيطية (القسم 3) واقترح توقيت.

Watch this Scientific Journal Video about A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

A للمسح<em&gt; في فيفو</em&gt; الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K Views.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

Video: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

في التصوير Bioluminescent المجراة من أورام الثدي باستخدام IVIS الطيف

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

A للمسح

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

في التصوير Bioluminescent المجراة من أورام الثدي باستخدام IVIS الطيف

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

الأساسية

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

زراعة