The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

<ol>
	<li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+phenotypic+gap:+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7 (2008).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans,+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor.">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li><li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor.">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503 (2012).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells.">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li><li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+the+Crabtree+effect:+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants.">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li><li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tobacco-specific+nitrosamine+4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone+(NNK)+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content,+transcription,+ATP+production,+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans.">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).</li><li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism.">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li><li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors.">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases.">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li><li>Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).</li><li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+in+chemical+biology:+a+compendium+of+inhibitors,+mechanistic+evaluation+of+chemotypes,+and+suggested+use+as+a+reporter.">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li><li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism.">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li><li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function.">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li><li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development.">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li><li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans.">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li><li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development.">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li><li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods.">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877 (2013).</li><li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7,+two+major+components+of+the+hypodermis.">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li><li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما تكشف

الكائن الحي نموذج C. يوفر ايليجانس نظام تجريبي قوي. فمن السهل أن تنتج ثقافة وفيرة ذرية متطابقة جينيا مع دورة حياة 3.5 يوم من البيض لاستنساخ الكبار (عبر مراحل اليرقات الأحداث L1 حتى L4). ونظرا لصغر حجمه، فإنه يمكن زراعتها بشكل ملائم في لوحات 96-جيدا، وتسهيل فحص المركبة. نقدم بروتوكول الفحص المظهري بناء على سلالات C. ايليجانس التي تقوم بدور في الجسم الحي أجهزة الاستشعار من مستويات الطاقة. 14 البروتوكول ينطبق على أي مختبر، على الرغم من أن هناك حاجة إلى luminometer لوحة 96-جيدا والحكومة العقيمة. من المهم لمنع التلوث في فحوصات باستخدام تقنية المختبرات الجيدة. إذا كان يعمل يدويا، والحد الأقصى لعدد لوحات الديدان الخيطية يمكن تحقيقه هو 13 في التجربة السماح للاختبار 2X لوحات المخدرات 96-جيدا وبينهم اثنان من لوحات المركبات. يتم عرض نتائج ممثل للمجمع الميتوكوندريا I المانع rotenonه، مولد الباراكوات الفائق، ودورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسطة وأربع مركبات مع المعروف النشاط المثبطة يراعة luciferase. أدت المركبين الأولى إلى انخفاض في تلألؤ بيولوجي كما كان متوقعا في حين أوكسالوآسيتات أدى إلى تعزيز، من المرجح أن يؤدي من جيل أكبر من ATP. تظهر أيضا مجموعات البيانات أوكسالوآسيتات التغير الجوهري في تجاربه التي تستند إلى يراعة luciferase كمراسلة. ما لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة لا ينصح للتأكد من متانة الردود على مركبات غير معروفة. وتثبيط النشاط يراعة luciferase التعرف مع فحص في المختبر باستخدام طقم التجارية. 3 واحدة من المركبات أدى إلى زيادة كبيرة في GFP مضان بما يتفق مع مثبط زيادة مستويات يراعة luciferase المراسل ملزمة لانزيم luciferase المراسل النشط الموسومة GFP الموقع، وجعله أكثر استقرارا. 15 وفي بعض الحالات(وليس في هذه الحالة بالذات) وهذا يمكن أن يؤدي إلى زيادة مستويات تلألؤ بيولوجي عند النازحين المانع من قبل الركيزة الزائدة. 15. ولذا، من المهم عدم تفسير النتائج خطأ من المركبات التي تتفاعل مع انزيم يراعة كما انخفضت أو زيادة مستويات ATP / وظيفة الميتوكوندريا. التغييرات في إشارة التلألؤ في كثير من الأحيان ترتبط مع قياسات إضافية للصحة مثل الحركة والتطور والنمو. وكمثال على ذلك، وهو مركب هو luciferase المراسل المانع المشتبه به إذا تم الكشف عن الانخفاض الكبير في إشارة تلألؤ بيولوجي لكن الديدان لا يمكن تمييزها من الضوابط من خلال الملاحظة المجهرية. زيادة في GFP مضان، لا يفسر النمو أو مركب تألق ذاتي، قد يشير أيضا إلى المانع. ومن المعروف أن عددا من مثبطات luciferase المراسل 15، وقد دخلت حيز PubChem. لذلك، في المقام الأول، بل هو ممارسة جيدة للتشاور معلومات عن مثبطات luciferase المراسل تحتجزهم PubChem. تليها رesting من آثار مركب في فحوصات في المختبر مع انزيم المنقى 3 و / أو تأكيد من آثار على وظيفة الميتوكوندريا من قبل وسائل إضافية. 16،17 قياسات GFP مضان تمكين الكشف عن مستويات يراعة luciferase (والكشف المحتمل لبعض مثبطات انزيم luciferase المراسل كما نوقش أعلاه) مما يجعل حجة قوية لقياس هذه النهاية جنبا إلى جنب مع تلألؤ بيولوجي حيثما كان ذلك ممكنا. تطبيع قراءات تلألؤ بيولوجي لGFP هو أيضا وسيلة لتوضيح أسباب الاختلاف في الأرقام دودة بين الآبار (على الرغم من أن هذا يمكن أيضا أن يتحقق عن طريق إدراج مكررات التقنية متعددة). لمزيد من حساسية، من المهم طرح مضان الخلفية من القراءات. بروتوكول يقيم مساهمة تعليق البكتيرية إلى مضان الخلفية، ولكن لا تمثل الديدان الخيطية تألق ذاتي ل(وجود قيود على الفحص الحالي، حاسمة بشكل خاص لأي ستو الشيخوخةوفاة بالنظر إلى أن الزيادات الخيطية تألق ذاتي مع التقدم في السن). وينبغي أيضا تقييم تألق ذاتي من المركبات اختبار في نفس الوقت. سوف GFP تطبيع يبدو لا غنى عنه حيث يرغب الباحثون على التكيف بروتوكول لمقارنة حمامات ATP الخلوية في المسوخ وراثية مختلفة، أو بعد إسكات الجينات المختلفة، من أجل السيطرة على أي اختلافات الضغط على مستوى التعبير عن التحوير تلألؤ بيولوجي. وتشمل المعايير الضرورية ضمن بروتوكول المرحلة التنموية التي يبدأ التعرض، ومدة التعرض، والحصول على أرقام مماثلة من الديدان الخيطية في آبار مختلفة. التعرض يمكن أن يبدأ في أي مرحلة من مراحل التنمية من الديدان الخيطية، ولكن مرحلة L3 أو أقدم الأفضل. من هذه المرحلة على والديدان الخيطية تعتمد على الفسفرة التأكسدية للتنمية في مرحلة البلوغ، كما يتضح من زيادة كبيرة جدا في المحتوى و mtDNA، واستهلاك الأوكسجين ومستويات ATP. 18،19،20 هذا البروتوكول يبدأ المعارضلدى عودتهم في المرحلة L4. سبب aliquoting الديدان الخيطية لوحات 96-جيدا فقط في هذه المرحلة (وليس عندما قدمت لأول مرة في المواد الغذائية في مرحلة L1)، هو أنه على الرغم من وضع لوحات في غرف رطبة لتقليل التبخر، وعلى درجة التبخر لا يزال يحدث في لدينا حاضنة الهز، وينظر إليها على أنها قطرات صغيرة جدا تتشكل على الجفن (وهذا قد لا يكون مشكلة مع حاضنات تهز أخرى). بواسطة aliquoting الديدان الخيطية لوحات قبل إضافة معايير المخدرات، لا يتأثر تركيز الدواء الفعلي من قبل أي اختلاف صغير في الحجم بسبب التبخر. تحميل لوحة الخيطية مع السيارة هو مفيد فقط للتأكد من أن الديدان الخيطية وزعت بالتساوي بين الآبار. فإن أي اختلافات كبيرة تم العثور عليها ل السيارة لوحة فقط يكون مؤشرا على تقنية الفقيرة في الاستغناء عن النيماتودا إلى الآبار. طول التعرض هو عامل مهم للنظر فيها. إذا كانت الآثار على وضع الطاقة بشكل مستقل من النمو هي التي تهم، والمؤيديمكن تعديل tocol لاستيعاب التعرض أقصر (من استجابات فورية تقريبا، على سبيل المثال، 2 ساعة). من ناحية أخرى، دخول المركبات إلى C. الأنسجة ايليجانس قد يستغرق بعض الوقت. على سبيل المثال يطلب من 12-24 ساعة لتحقيق أقصى قدر من تركيزات الداخلية ريسفيراترول و 5 الفلورية 2&#39;-deoxyuridine (FuDR). 21 لذلك، التعرض الطويل (18-24 ساعة) قد يكون له ما يبرره لتحقيق أقصى قدر من مستويات التعرض. الساعة التعرض ينبغي أن يقتصر على الأوقات التي لا تسمح مستويات كبيرة من الاستنساخ الذي سيعقد في البئر. ونحن نوصي بأن الوقت التنموي الكلي للالنيماتودا يتم الاحتفاظ تحت 66-67 ساعة. على الرغم من مريحة، وحامل الديدان الخيطية في ذلك الوقت، وقد بدأت egglaying. ومع ذلك وجدنا قراءات تلألؤ بيولوجي من الاستعدادات البيض لا تذكر (لا يظهر). يتم الكشف عن سور 5 المروج يحركها التعبير التحوير أول اثنين فقط لمدة سنتين وبعد نصف ساعة الإخصاب في مرحلة 100 خلية 22 وجومن المرجح أن تحد من دخول وسيفيرين قشر البيض hitinous. ووجد آخرون أن البيض المحتوي لم تساهم بشكل كبير في عملية التمثيل الغذائي للبالغين حامل. 23 ومع ذلك، والظروف التي تسمح بانتاج كبير ذرية هي التي ينبغي تجنبها. إذا كان يفضل، والجدول الزمني التجريبي يمكن أن تحول مرة أخرى: بادرنا قبل التعرض لسموم البيئية في أواخر L3 مرحلة اليرقات (36 ساعة) والتي أجريت القياسات تلألؤ بيولوجي وGFP في 55 ساعة 2 الخلفيات بدلا من ذلك، الوراثية التي هي عقيمة مشروط. يمكن استخدامها لمنع إنتاج ذرية، وعلى سبيل المثال فر-15 (B16) II. لا ينصح فيم-1 (hc17) IV متحولة المزدوج الذي لا يمكن الحفاظ عليه في 15 ° C، ولكن غير معقمة في 25 ° C. 24 استخدام FuDR للحث على العقم وهذا يمكن أن يؤثر في حد ذاته عملية التمثيل الغذائي الديدان الخيطية. 25 الفحص يمكن أن كما أن يؤديها في التوترات مع البشرة أكثر نفاذية مثل جزئية الخسارة من وfunctأيون حافلة 8 المسوخ التي هي نتيجة لزيادة نفاذية الأدوية الحساسة للأدوية المتعددة. 26 وهذا يسهل التعرض أقصر وتركيز مركب أقل. الشروط لإضافة وسيفيرين لهذه الديدان الخيطية يمكن أيضا تحتاج التعديل أي 1٪ DMSO و 0.05٪ تريتون-X100 في المخزن المؤقت التلألؤ قد لا تكون هناك حاجة لتعزيز توافر وسيفيرين. يستخدم بروتوكول 1٪ DMSO كما سيلة لتسليم المجمع. وإن لم يكن قاتلا، وهذا تركيز DMSO لديه بعض التأثيرات البيولوجية كما ناقشنا في منشور السابق. 3 العديد من المكتبات المخدرات المتاحة مستعدون في 100٪ DMSO، بتركيزات من شأنها أن تكون مناسبة لفحوصات خلية القاعدة بعد التخفيف من السيارة إلى 0.1٪. ويلزم تركيز مركب أعلى للحصول على ردود في C. ايليجانس بالمقارنة مع الخلايا البشرية، بحيث غالبا ما يكون من غير الممكن إجراء فحوصات على أقل من 1٪ DMSO. مرة أخرى، واستخدام سلالات معقد يؤدي المزيد من البشرة منفذة لاختبار مع تركيزات أقل من المركبات. لا ينصح تركيزات DMSO أعلى من 1٪. ينبغي التقيد الوقت المحدد الحضانة مع وسيفيرين قبل قراءات ل. كما هو موضح سابقا، التلألؤ يصل أقصى مستويات لها في الدقيقة الثانية بعد إضافة وسيفيرين، وتبقى مستقرة نسبيا لأول 5 دقائق، تليها انخفاض تدريجي بطيء في التألق على مدى 30 دقيقة المقبل 1. ويمكن إجراء استجابات حركية لمادة كيميائية معينة من خلال هذه المرحلة الأولية من 30 دقيقة بعد الاستغناء الأولي من وسيفيرين. ويشمل البروتوكول خطوة جوعا بعد جمع البيض لتحقيق التزامن من السكان الديدان الخيطية. نوصي تزامن السكان اختبار النيماتودا منذ مراحل النمو المختلفة تختلف في مستويات ATP الخلوية وربما تستجيب بشكل مختلف للمركبات الاختبار. من خلال تنفيذ المجاعة في S كاملةمتوسطة بالمقارنة مع M9، يتم توفير الديدان الخيطية الفقس مع مصدر الكربون (الإيثانول)، بحيث اليرقات لا تتطور ولكنها لا تفتقر تماما. 27،28 كما تبين أن القبض على L1 وتستعد للاستجابة السريعة في الغذاء و ويتم تحقيق معدل نمو L1 العادي في غضون 3 ساعة بعد الغذاء تصبح متوفرة. 29 ومع ذلك، فإنه احتمال أن الخطوة المجاعة قد يغير التمثيل الغذائي للC. لا يمكن استبعاد ايليجانس. 30 لهذا السبب طول الجوع يجب أن لا تتجاوز 24 ساعة (18 ساعة كافية لمزامنة). قد يكون بعض المختبرات في إمكانية استخدام COPAS Biosorter لمزامنة عمر تجاوز الخطوة الجوع تماما. قد يكون غيرها من المختبرات تفضيل لتوسيع السكان الخيطية على وسائل الاعلام الصلبة (لوحات NGM مع OP50) قبل التبييض (الخطوة 3.1) وهذا سوف تعمل بشكل جيد جدا. نحن نستخدم S المتوسطة خلال التعرض مجمع كوسيلة القياسي لالنيماتودا زراعة، howeveص يمكن اختيار وسيلة أخرى، على سبيل المثال K متوسطة أو معتدلة EPA الماء العسر غالبا ما تستخدم للدراسات السمية البيئية. 31،32 وينص البروتوكول وسيلة لفحص وتحديد المرشحين لإجراء مزيد من التجارب من حيث الآثار المترتبة على وظيفة الميتوكوندريا. في مرحلة الفرز الأولية أنه من المحتمل أن يكون قد تم تفويت بعض المركبات بسبب تركيز واحد فقط يجري اختبارها، وبالتالي لا ينبغي النظر شاشات المخدرات شاملة. يضرب يمكن التحقق من صحة عن طريق استخدام تقنيات لتقييم جوانب مختلفة من وظيفة الميتوكوندريا للاستهلاك الأكسجين سبيل المثال، C. ايليجانس سلالات مع GFP معربا عن الميتوكوندريا، البقع على إمكانات غشاء الميتوكوندريا و / أو القياسات ROS. 16،33،34 أعظم أهمية المنهجية هو أن يكون وسيلة لفحص عدد كبير من المركبات و / أو شروط على المستوى العضوي متعددة الخلايا، والأهم من ذلك أن تكون قادرة على الاستفادة من الالبريد قابلية الإستطراق الجيني للC. ايليجانس للتحقيق في آليات العمل. تقنية قد تساعد على تسريع وإيجاد مسارات جديدة لاكتشاف مركبات والأهداف مثيرة للاهتمام. ومن المتصور أن الجمع بين أجهزة الاستشعار مع خلفيات وراثية مرتبطة الأمراض التي تصيب البشر لفرز مجموعات المركبات الكيميائية في سياق ذي صلة المرض سيكون لها الكثير لتقدمه.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقدير سريع للوضع الطاقة في C. ايليجانس في الجسم الحي بهدف استخدام هذا بمثابة نقطة النهاية في فحص المركبة. ويستند هذا المنطق على التعبير المعدلة وراثيا من يراعة luciferase في C. الخيطية ايليجانس 1-3 عن طريق البلازميد pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> وتنصهر انزيم luciferase المراسل إلى بروتين الفلورية الخضراء GFP وأعرب جوهري وبتواجد مطلق في السيتوبلازم (تم إزالة بيروكسية luciferase المراسل استهداف إشارة). وهذا يؤدي إلى انبعاث الضوء عندما يتم توفير الركيزة luciferin خارجيا. كما الدودة شفافة، وعلى ضوء يمكن قياسها في luminometer وحدات الخفيفة النسبية (RLU). الوقود ATP الخلوية رد فعل تلألؤ بيولوجي وتوافره يحدد مستويات الخفيفة المنتجة. ونتيجة لذلك، luminometry يقدم مريحهر يعني تقييم مستويات ATP النسبية وبالتالي وظيفة الميتوكوندريا، لأن إنتاج ATP يحدث بشكل رئيسي في الميتوكوندريا. وقد ثبت وجود صلة بين مستويات ظيفة وتلألؤ بيولوجي الميتوكوندريا سابقا من خلال إسكات الجينات الميتوكوندريا سلسلة نقل الإلكترون ويصاحب ذلك انخفاض ناتج الضوء. 1 سلالات تلألؤ بيولوجي ولدت وعينت PE254 (feIs4) و PE255 (feIs5) 1 (انظر قائمة المواد)، ويمكن أن تستخدم بالتبادل. 3 وقد استخدمت عدد من الدراسات هذه السلالات استشعار للإبلاغ عن مستويات ATP الخلوية في الجسم الحي بعد التعرض لمواد كيميائية مختلفة أجنبي بيولوجيا مثل أزيد الصوديوم 1، الكادميوم 2 والصرف الصحي استخراج الحمأة 3، 5&#39;-الفلورية 2-deoxyuridine 6، ونيتروسامين التبغ محددة 7. وكانت سلالات من المفيد أيضا رصد تأثيرات التعرض للأشعة فوق البنفسجية C <sتصل&gt; 8 وآثار تعطيل سلسلة الميتوكوندريا وظيفة الجهاز التنفسي. 1،9 كما تم استخدام نسخة مبكرة من أجهزة الاستشعار التلألؤ التعبير عن الجينات luciferase المراسل دون الانصهار GFP (PE39) في التحقيق في آثار المعادن الثقيلة وعلى الجهاز التنفسي . uncoupler 10 سلالات PE254 PE255 وتحمل luciferase المراسل: تبين GFP الانصهار وGFP مضان لزيادة متناسبة مع النيماتودا الإعلام، حيث تتيح وسيلة مريحة للتطبيع القيم التلألؤ 6،9 آثار مبلغ الفرق من الديدان لكل بئر ويمكن أيضا أن يكون. تؤخذ بعين الاعتبار من قبل بما في ذلك مكررات تقنية متعددة في مقايسة (ما لا يقل عن 5 آبار في حالة). 3 بروتوكول يتيح إمكانية الرصد في الجسم الحي من مستويات الطاقة (على العكس من أكثر شاقة من الناحية الفنية في المختبر قرارات ATP) مما يتيح فحص المركبة وتغيير وضعيتها في سياق الفسيولوجية لمو كلهكائن lticellular. ويمكن تمديد هذا الإجراء إلى مجموعة متنوعة من خلفيات وراثية عن طريق عبور التحوير متكاملة صبغويا إلى سلالات متحولة المتاحة و / أو إسكات الجينات التي تدخل الحمض النووي الريبي. وهكذا، مع الاستفادة الكاملة من C. ايليجانس بوصفه الكائن نموذج. يجب أن الأسلوب تساعد في الحد من فشل المرحلة في وقت متأخر من المرشحين المخدرات نظرا لسمية الميتوكوندريا وتقديم مساهمة نحو الحد من أعلى التجارب على الحيوانات.

<table><tbody><tr><td>Orion II Microplate Luminometer</td><td>Berthold Detection Systems</td><td></td><td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td></tr><tr><td>FLx800 fluorimeter&amp;nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td></tr><tr><td>Ks 130 basic shaking platform</td><td>Ika</td><td>#0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Refrigerated incubator shaker</td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>with eppendorf rotor A-4-44&amp;nbsp; (for 50/15&amp;#160;ml tubes)</td></tr><tr><td>Stripette, Costar</td><td>Corning</td><td>#4489</td><td>Serological pipette</td></tr><tr><td>Cellstar 50 ml tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227661</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 15 ml tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>#188261</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&amp;nbsp;</td><td>Greiner bio-one</td><td>#628160</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Microscope slides</td><td>VWR</td><td>#631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Sterile spatula</td><td>Corning</td><td>#3007; #3004</td><td>for weighing out chemicals</td></tr><tr><td>0.22 mM Millex GP filters</td><td>Millipore</td><td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 well assay plate</td><td>VWR</td><td>#3603</td><td>Black plate clear bottom with lid</td></tr><tr><td>Nunc 96 well assay plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>#236105</td><td>White plate with lid</td></tr><tr><td>Reservoir reagent 60 ml</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>#9510027</td><td>used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1</td></tr><tr><td>Storage box/damp chamber</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#10 800 058 001</td><td>174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td></tr><tr><td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#239305</td><td>Store in aliquots at 4&amp;#160;&amp;deg;C,&amp;nbsp; seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td></tr><tr><td>D-Luciferin, potassium salt</td><td>Biotium Inc</td><td># 10101-2</td><td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, keep at -20 &amp;deg;C in aliquots</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td><td>#317275</td><td>Purity 99.99%</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A16046</td><td>Diltute to 10% in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>CalBiochem</td><td>#475914</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; bioluminescent strains</td><td>Author&#039;s own laboratory</td><td>PE254, PE255</td><td>contain integrated arrays &lt;em&gt;feIs4&lt;/em&gt; and &lt;em&gt;feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)]&lt;/em&gt; respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of &lt;em&gt;luc::GFP&lt;/em&gt; by fluorescence microscopy (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; pick 15 worms) every now and then.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General chemicals</td><td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

وقد تم الحصول على نتائج ممثلة لتوضيح طريقة لروتينون (الشكل 1)، الباراكوات (الشكل 2)، أوكسالوآسيتات (الشكل 3)، و 4 مركبات التي تم انتقاؤها مثبطات كما يراعة luciferase خلال فحص مكتبة المخدرات 13 (الشكل 4). وقد بدأ التعرض للمخدرات في المرحلة L4 في جميع الحالات، ولكن بدأت تجارب التعرض ترابل في 41 ساعة بعد الغذاء قدمت أول من الديدان الخيطية مقارنة مع 45-46 ساعة للمركبات الأخرى. بروتوكول يسمح للحصول على درجة من المرونة في اختيار الوقت المناسب للبدء من التعرض للمخدرات وطول التعرض. ينبغي التقيد ومع ذلك، لأغراض الفحص، تعيين أوقات الى المفضلة مرة واحدة، لاستنساخ بين التجارب. يجب أن تقاس النهاية من قبل 66-67 ساعة وقت التنموية من أجل منع واسعة وضع البيض والتفريخ من ذرية في الآبار. يتم توفير مبادئ توجيهية للتوقيت في Tقادرة 1. روتنون، وهو مجمع الميتوكوندريا I المانع، تخفيض تلألؤ بيولوجي بعد كل من قصيرة نسبيا (2 ساعة) وأطول التعرض (24 ساعة) لمجموعة من تركيزات (الشكل 1). في هذه الحالة، لم تتخذ أية قياسات GFP، ولكن عدد مكررات التقنية المستخدمة (ن = 6) كافية لمعادلة أية اختلافات في أرقام دودة بين الآبار 3. تعرض 24 ساعة هو نافذة الزمنية التي تنمو الديدان الخيطية، والتنمية أبطأ نتيجة معقدة I تثبيط كان من المتوقع أن تسهم في انخفاض تلألؤ بيولوجي. هذا ما أكده الملاحظة البصرية تحت المجسام مع تطوير تأخر ينظر إليها، ولا سيما في تركيزات 20 ميكرومتر وأعلاه؛ بالإضافة لوحظ بعض الفتك من 40 ميكرومتر (الملاحظات النوعية لا كميا). ولم يلاحظ أي الفتك بعد التعرض 2 ساعة ولكن ظهرت التأثيرات على حركة الدودة. انخفاض حاد في تلألؤ بيولوجي بالنسبة لضوابط occurred في أقل تركيز من روتينون اختبار 2.5 ميكرومتر، والتي الآثار لم يتم الكشف بسهولة عن طريق الملاحظة البصرية السريعة في 2 التعرض ساعة. هذا الانخفاض في تلألؤ بيولوجي يتسق مع انخفاض ATP الخلوية. وقد تحقق تثبيط القصوى بأقل تركيز روتينون المستخدمة (2.5 ميكرومتر) مشيرا إلى أن أي تجارب لاحقة تستهدف روتينون على وجه التحديد يجب أن تنفذ بين 0 و 5 ميكرومتر [نطاق تركيز 0-160 ميكرون تم اختيار كجزء من المقارنة مع أدوية أخرى حددت في البداية وجود آثار كبيرة على 10 ميكرومتر (التي سيتم نشرها في مكان آخر)]. والباراكوات مبيدات الأعشاب تؤثر على وظيفة الميتوكوندريا من خلال زيادة أنواع الاكسجين التفاعلية. هنا، علينا أن نظهر تأثيرها على تلألؤ بيولوجي من C. ايليجانس السلالة PE254 بعد التعرض لمجموعة من تركيزات لمدة 24 ساعة (الشكل 2). كما سلالة يحمل لوك :: الانصهار GFP، كان GFP مضان المرضس قياس كوسيلة للتطبيع. انخفضت 6،9 ترابل تلألؤ بيولوجي، GFP مضان وتلألؤ بيولوجي تطبيع بشكل ملحوظ. وأشار الاختبار اللاحق-Dunnet أن تركيزات الباراكوات مع وجود اختلافات كبيرة فيما يتعلق السيطرة على السيارة وكانت 4 و 8 مم للتلألؤ بيولوجي وتلألؤ بيولوجي تطبيع، فضلا عن 2 ملم لتلألؤ بيولوجي تطبيع. وكان تركيز الوحيد تخفيض كبير GFP مضان 8 ملم، والتركيز على شوهدت فيها آثار للنمو ودودة الميتة عرضية (الملاحظات النوعية). كان الانخفاض في تلألؤ بيولوجي (وتلألؤ بيولوجي تطبيع) أكبر من مضان، بما يتفق مع انخفاض وظيفة الميتوكوندريا والآثار على إنتاج ATP. دورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسط ​​اختبارها على C. ايليجانس السلالة PE254 بتركيز واحد من 8 ملم، أدى إلى زيادة في تلألؤ بيولوجي (الشكل 3). لا GFP يتألقتم الحصول على قياسات الامتحانات التنافسية الوطنية أو إجراء الملاحظة البصرية إضافية خارج. ولكن هذه الاستجابة إلى تركيز واحد سوف تستحق المزيد من التعرض تأكيدي على مجموعة من تركيزات، وملاحظات أكثر تفصيلا من الآثار. تعزيزا لتلألؤ بيولوجي هذا المركب ليس من المستغرب كما أنها يمكن أن يفترض أن تؤدي إلى مزيد من النشاط في دورة حمض الستريك، مع زيادة في نهاية المطاف إنتاج ATP (مع ذلك سيكون من المستحسن للسيطرة على أي آثار على مستويات luciferase المراسل عن طريق تقييم GFP مضان في تجارب لاحقة). مجموعات البيانات أوكسالوآسيتات أظهرت تكشف عن مدى التباين في استجابة ينظر في تجاربه التي تستند luciferase المراسل. في تجربتنا هذه التقلبات هو سمة من سمات نظام الاختبار وخاصة لظروف التعرض أقل ضررا. المركبات المثبطة يراعة luciferase DDD00001434، تم اختبار DDD0001477، DDD00000635 وDDD00023047 على حد سواء في المختبر من خلال النظر في الآثار المترتبة على بوانزيم rified والحية باستخدام C. ايليجانس لوك: GFP معربا عن سلالة. لم يكن هناك أي دليل على أن أيا من مركبات اخضعت للاختبار تسبب في وفاة الخيطية تحت ظروف التعرض. جميع المركبات 4 أثرت على luciferase النشاط في المختبر على تركيزات 2 اختبار 25 و 100 ميكرومتر (الشكل 4A). DDD00001434 قتل نشاط luciferase المراسل تنقيته تماما تقريبا، والتي قدمت لتبرير معقول لتراجع كبير في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي في (الشكل 4B). على الرغم من أن في المختبر والمقايسات فيفو لا يمكن مقارنتها مباشرة، كانت ردا على DDD00023047 مماثلة في كل من المقايسات. تسبب DDD0001477 وDDD00000635 انخفاضا أكبر في الجسم الحي مما كانت عليه في في المختبر. وقدمت هذه المركبات إلى الديدان الحية 22 ساعة قبل الركيزة وسيفيرين، ويمكن أن تعكس النتائج التي لم ينزحوا بسهولة من موقع نشط luciferase المراسل عندما أصبح وسيفيرين افاعيlable و. بدلا من ذلك، قد DDD0001477 وDDD00000635 يكون لها تأثير إضافي على مستويات ATP الخلوية. وهذا من شأنه أن يتم تقييمها بواسطة الوسائل التي لا تنطوي على يراعة luciferase. من المذكرة هو تعزيز قوي للإشارة GFP في الديدان الحية تتعرض لتفاقم DDD00000635. وسيناقش هذا أدناه. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> الشكل 1. مجمع الميتوكوندريا I المانع انخفض روتينون وضع الطاقة في C. ايليجانس مقاسا تلألؤ بيولوجي من سلالة PE254. المتزامنة L4 مرحلة الديدان (45-46 ساعة بعد الغذاء المقدم لليرقات L1) تتعرض ل0، 2.5، 5، 10، 20، 40، 80 و 160 ميكرومتر روتينون في 1٪ DMSO ل2 ساعة (قصيرة) أو 24 ساعة (التعرض الطويل) قراءات مسبقة من تلألؤ بيولوجي على التوالي في 48 و 69 ساعة من وضع دودة بعد توفير الغذاء. وأعرب تلألؤ بيولوجي (وحدة النسبية وحدات خفيفة، RLU) كنسبة مئوية من السيارة (1٪ DMSO) القيم. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية في كل تركيز روتينون (ن = 6). أسفرت عن تركيزات اختبارها في غاية الاختلاف ذات دلالة إحصائية فيما يتعلق السيطرة على السيارة (P &lt;0.001). <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> الشكل 2. الباراكوات الأكسدة الضغوطات انخفضت وضع الطاقة في C. تعرضت ايليجانس السلالة PE254 بطريقة تعتمد على التركيز (تقاس تلألؤ بيولوجي). المتزامنة L4 الديدان المرحلة (للراحة في هذه الحالة في 41 ساعة بعد الطعام المقدمة للL1 اليرقات) إلى 0، 0.25، 0.5، 1، 2، 4 أو 8 ملي الباراكوات لمدة 24 ساعة. وقد استخدم مضان GFP (وحدة وحدات مضان النسبية، RFU) لتطبيع البيانات تلألؤ بيولوجي (وحدة RLU)، وكلاهما النهاية حصلت على 65 تنمية الموارد البشرية. يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من الضوابط (1٪ DMSO). أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية(ن = 5 لتركيزات مختلفة، ن = 18 للضوابط). في اتجاه واحد ANOVA: *** P &lt;0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> الشكل 3. دورة حمض الستريك أوكسالوآسيتات المتوسط ​​(8 ملم) تعزيز تلألؤ بيولوجي من C. تعرضت ايليجانس السلالة PE254. المتزامنة L4 مرحلة الديدان (45-46 ساعة بعد الغذاء المقدم لليرقات L1) إلى طازجة 8 ملي أوكسالوآسيتات لمدة 18 ساعة ± 30 دقيقة. تم قراءة تلألؤ بيولوجي (وحدة RLU) في وقت التنموي من 63.5 ساعة ± 1 ساعة وكنسبة مئوية من السيطرة على السيارة ([ده 2 O). وتمثل أعمدة مختلفة مجموعات البيانات المختلفة من 8 مكررات التقنية المخصصة لمختلف 96 لوحات جيدة داخل نفس التجربة. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 8). 2 طريقة ANOVA مع &quot;مجموعة&quot; و &quot;تركيز&quot; كعوامل: ̵6؛ مجموعة &quot;P&gt; 0.05، &#39;&#39; ع تركيز &lt;0.001 و مصطلح التفاعل P&gt; 0.05. A <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> الرقم 4. اختبار الردود على 4 مركبات من اكتشاف المخدرات مكتبة مجمع دندي 13 (C1: DDD00001434، C2: DDD0001477، C3: DDD00000635 وC4: DDD00023047) مع النشاط المثبطة معروف على يراعة luciferase المراسل التلألؤ. (A) تأثير المركبات على نشاط تنقية يراعة luciferase (قياس وحدات خفيفة، RLU)، معبرا عنه كنسبة مئوية من السيطرة على السيارة. تم استخدام ATP تلألؤ بيولوجي CLSII مجموعة (روش، مانهايم، ألمانيا) وفقا لتعليمات بنفس كمية الانزيم luciferase المراسل aliquoted إلى الآبار (أبيض 96 ثالذراع لوحات عيار مكروي). وقدمت ATP في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر و 1 ميكرولتر من مركب (تركيز النهائي أشار) أو أضيفت DMSO (1٪). تم دمج إشارة التلألؤ لمدة 10 ثانية. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 4). تحليل: في اتجاه واحد ANOVA. * P &lt;0.05 أو *** P &lt;0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة. الاختلافات بين 25 و 100 ميكرومتر هامة للغاية لC1 (DDD00001434؛ P &lt;0.001)، وهامة لC2 و C3 (على التوالي DDD0001477 وDDD00000635؛ P &lt;0.05). (ب) في الجسم الحي قياسات تلألؤ بيولوجي، تلألؤ بيولوجي تطبيع لGFP مضان و GFP مضان من C. ايليجانس السلالة PE254 في 67 ساعة وقت التنموية بعد التعرض لمركبات الاختبار لمدة 22 ساعة. أشرطة الخطأ تصور SEM من مكررات التقنية (ن = 8). تحليل إحصائي قامت (واحد طريقة ANOVA) للخروج على البيانات المجمعة من 3 مجموعات البيانات (3 XN = 8). * P &lt;0.05 أو *** P &lt;0.001 نسبة إلى السيطرة على السيارة المعنية. مختلفاالمجال الاقتصادي الموحد بين 25 و 100 ميكرومتر فقط يعتد به إحصائيا (P &lt;0.05) للتلألؤ بيولوجي تطبيع بعد التعرض لC4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> وقت اليوم </td><td> اليوم 1 </td><td> يوم 2 </td><td> اليوم 3 </td><td> اليوم 4 </td><td> اليوم 5 </td><td> اليوم 6 </td><td> يوم 7 </td><td> اليوم 8 </td></tr><tr><td> 10/09 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> خطوة 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> خطوة 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 4 </td><td> خطوة 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><tد&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> الخطوة 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> الخطوة 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. نظرة عامة على خطوات البروتوكول التي يتعين القيام بها في كل يوم من التجارب الخيطية (القسم 3) واقترح توقيت.

Watch this Scientific Journal Video about A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

A للمسح<em&gt; في فيفو</em&gt; الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

10.0K Views.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

Video: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biochemistry

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

تحليل مقارن للطرق التجريبية لقياس النشاط الحيواني في نماذج Elegans Caenorhabditis من مرض الميتوكوندريا

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Behavior

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

في المختبر و في فيفو كشف ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس جيموالفئران

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Medicine

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

طرق لتقييم التحت خلوية من المقصورات في العضلات<em&gt; C. ايليجانس</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

قياس معدلات استهلاك الأوكسجين في سليمة ايليجانس كاينورهابديتيس

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع التأثير على صحة Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

القياس الكمي للميتوفاجي في C. elegans وخط خلايا سرطان الكبد

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

تسليط الضوء على المؤلف: الكشف عن Mitophagy في Caenorhabditis elegans وخلايا الثدييات باستخدام الأصباغ الخاصة بالعضيات  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

الكشف عن الميتوفاجي في Caenorhabditis elegans وخلايا الثدييات باستخدام الأصباغ الخاصة بالعضيات

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...

A للمسح

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

تحليل مقارن للطرق التجريبية لقياس النشاط الحيواني في نماذج Elegans Caenorhabditis من مرض الميتوكوندريا

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

في المختبر و في فيفو كشف ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس جيموالفئران

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

طرق لتقييم التحت خلوية من المقصورات في العضلات

قياس معدلات استهلاك الأوكسجين في سليمة ايليجانس كاينورهابديتيس

فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع التأثير على صحة Caenorhabditis elegans

الكشف عن الميتوفاجي في Caenorhabditis elegans وخلايا الثدييات باستخدام الأصباغ الخاصة بالعضيات

الكشف عن الميتوفاجي في Caenorhabditis elegans وخلايا الثدييات باستخدام الأصباغ الخاصة بالعضيات