The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

注：（126°C、11分間オートクレーブ処理することによって）滅菌条件（クリーンベンチ）の下と予め滅菌材料とのすべてのステップを実行します。画線大腸菌を含むLBプレート大腸菌 OP50は4℃に維持し、必要な新鮮なLBプレート上にストリークアウト毎月restreakされます。 1.細菌性食品（ 大腸菌 OP50）準備<ol><li> 1日目接種大腸菌の単一コロニーを持つ2つのユニバーサルボトルで2×5ミリリットルのLB 8時間、37°C（220 rpm）で振盪インキュベーターで大腸菌 OP50と場所。 </li><li> 8時間のインキュベーション後、 大腸菌を2mlを使用3×200ミリリットルLBのそれぞれに接種するために大腸菌 OP50 LB培地37℃のインキュベーター（220 rpm）でO / N（17時間）を振っに入れフラスコ。 </li><li> 20×50 ml遠心管を秤量し、チューブ上に重量を書きます。 </li><li> O / N Eの血清学的ピペット、アリコート30ミリリットルを使用して2日目。事前に大腸菌 OP50文化が遠心管の重量を量りました。 7741 xでの遠心分離G、10℃、8分</li><li>慎重に、上清をデカントで蓋を反転チューブを維持し、数分間放置します。ピペットを使用して、蓋に収集している可能性のある余分な上清を除去します。チューブを秤量し、ペレットの重量を計算します。 </li><li> 30グラム/ Lのサスペンションを提供し、チューブにこのボリュームをマークするために必要な量を計算します。 1-3カ月以内にまたはで使用するために-20℃で日付、ラベルと場所チューブ - 80℃で3ヶ月以上のために保存する場合。 </li><li>線虫を成長させるための細菌懸濁液を準備します。細菌ペレットを静かに必要な体積を得るために、ペレット、異なるチューブのプールの内容を再懸濁するために出て解凍し、各チューブに11,12完全培地Sの必要なボリュームを追加、ボルテックスすることができます。無菌状態の下で働きます。 </li></ol> 96ウェルプレートフォーマットで薬物標準の調製注：薬剤ライブラリを使用する場合、薬剤プレートは単一に設けられています。DMSO中の化合物の濃度。一次スクリーニングは、単一の濃度で化合物を試験します。手順については、10μMで統計的有意後に選択し、0〜160μMの濃度の範囲で確認化合物試験のための薬剤プレートの調製のために従ってください。以下の手順は、他の濃度をテストするために適合させることができます。 注意！薬を扱うために必要な注意事項を守ってください（一般的に手袋が必要とされる、マスク、安全ゴーグルに直面しています）。 <ol><li>確認スクリーニングのための作業標準に薬物プレートを準備します（ つまり、100倍を露光のために必要な最大濃度に比べて集中）滅菌1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに化合物の必要量を計量し、DMSOに16mMの化合物を製造。 </li><li> 8、4、2、1、0.5、および0.25 mMの標準（無菌状態）を取得するためにDMSOに2：シリアル16mMのストック1を希釈。これらは、100倍に濃縮され、0（車両のみ）の最終濃度まで希釈され、薬物曝露の間に（1％DMSO中）2.5、5、10、20、40、80および160μM。 </li><li>クリーンベンチでは、例えばプレートの位置A1のために、96ウェルプレートの列内の化合物基準のウェル当たり20〜50μLを置く：16 mMの、B1：8 mMの、C1：4 mMの、D1：2 mMの、 E1：1 mMの、F1：0.5 mMの、G1：0.25 mMの薬とH1：DMSO。異なる薬剤の希釈系列の異なるカラムを使用してください。 </li><li>薬剤プレートの列12のウェルに分注し車。 注：これは、車両全体のプレートの位置の代表でテストされて確実に、車両制御下に行Hに沿って検査に加えて、列のテストを容易にします。 注：確認のスクリーニングのための各薬剤プレートは、試験される11種類の薬剤の最大プラス車両制御のための希釈系列を保持しています。 </li><li>必要になるまでラベルとシールプレートは、-20℃で箔と場所でカバーしています。 </li></ol> 3.線虫の実験注：すべてのステップを実行し、Uファインダー無菌状態、無菌的かつ事前に滅菌材料および試薬で。 C.を維持エレガンスは、EとNGMプレート上で日常株異なるプロトコルステップの大腸菌 OP50 12示唆タイミングは、表1に提供されています。 <ol><li> 1日目の作業は：その後の同期のためのバイオセンサー株の液体培養を設定します。 <ol><li> S完全2mlに（食品がちょうどなくなった若い幼虫をたっぷり使って）1 6センチメートルNGMプレートから線虫を取り、30グラム/ L Eでフラスコへの転送S完全な（250ミリリットル容量の円錐形のガラスフラスコ中の総容量30ミリリットル）中の大腸菌 OP50。 20℃、160rpmで3日間インキュベートします。 </li></ol></li><li> 4日目の作業（約30〜35分を許可）：漂白文化卵を収穫し、ワームの人口を同期します。 1分間のすべての遠心操作を実行し、600×gで。 <ol><li>使用直前に漂白剤溶液を調製：0.156 M KOH / NaOHを各16ミリリットルに4ミリリットル漂白剤を追加します。 </li><li> 2×14ミリリットルを注ぎます15ミリリットルの円錐遠心チューブにワーム文化。ワームは、重力（3分）によって解決することができます。取り外し、液体上の落ち着いた線虫を捨てます。各チューブに漂白剤溶液5mlを加え、タイマーを開始します。 1チューブにボリュームを兼ね備​​えています。 </li><li>ワームの破壊と懸濁液に卵を放出するステレオスコープの下で確認し、2分間穏やかにチューブを反転。ときほとんどの卵が解放されるか、漂白溶液中で2分間、遠心機の最大時。 </li><li>注意深く上清を取り除きます。 14ミリリットルのS完了し、遠心分離してペレット1×を洗ってください。 </li><li> （この第二の漂白工程は、ワームの死体のほとんどが崩壊し、もはやステレオスコープの下に見ていることを保証します）上清を捨て、10ミリリットル漂白剤溶液を添加し、タイマーを開始します。 2分の漂白液の最大時間後、遠心分離。 </li><li>完全なS内の洗浄ペレット3倍、静かに各遠心後のS完全な14ミリリットルで上清と再懸濁したペレットをデカント。最終洗浄後、14ミリリットルのS cで卵のペレットを再懸濁omplete。 </li><li>円錐形のガラスフラスコにボリュームを転送します。 20℃、160 rpmで18〜24時間インキュベートします。 注：収穫卵は、したがって、彼らはすべての成長の同じステージになります、O / Nを孵化し、原因食品の不足のために最初の幼虫齢（L1）で開発を逮捕します。 </li></ol></li><li> 5日目の作業：薬物アッセイのための同期ワームの文化を設定します。 注：飢餓培地に懸濁ワームは、ピペットチップおよびチューブのような疎水性プラスチック表面に付着する傾向があります。 0.01％のTween-20がプラスチック表面をより親水性とカウントでより高い精度（0.01％のTriton-X100を使用することもできる）を可能にするためにここで使用される界面活性剤です。線虫、細菌添加培地である場合、それらは、プラスチックに固執する傾向がありません。 <ol><li>プラットフォーム（160 rpm）を振っにフラスコを維持し、フラスコ中の斜線のL1の数を決定します。 <ol><li> 900μlの液体mの独立した1.7ミリリットルのマイクロチューブに（きれいな先端を毎回使用）フラスコから3倍の100μlのサンプルを取りますedium 0.01％のTween-20。 注：一度だけきれいな先端への熱望100μlのサンプル。そして、ときに先端に付着した虫を解放するためにトゥイーン添加した培地に、ピペットアップし、数回上下分配します。 </li><li>各三連の希釈チューブから4倍の10μlの液滴中の線虫をカウントします。平均値を計算し、円錐形のガラスフラスコ内に存在するワームの数を推定します。 </li></ol></li><li> 10μLあたり10線虫で2×20ミリリットル文化をセットアップするために必要な斜線の線虫懸濁液の体積を計算します。遠心分離工程の間に、いくつかの後続の線虫の損失を考慮して10％、算出容量を増やします。 </li><li>デカントボリュームが2×15 mLの遠心分離管に必要な（予め秤量）。優しく実際の分注量、渦を取得し、5 mlピペット（のみ無菌先端がチューブを入力してください）​​と過剰量を除去することによって、ボリュームをターゲットにする調整するためにチューブを秤量します。 </li><li>だったの完全な新鮮なSで14ミリリットルにボリュームを構成します時間線虫。遠心分離（1分、600 g）を得ました。線虫のペレットを乱さないように注意して上清を除去し、廃棄します。 </li><li> 30グラム/ L Eで完全なSの5ミリリットルを追加します。ペレット化した線虫の大腸菌 OP50。各チューブ内の5mlを30グラム/ L、Eとの完全な15ミリリットルSを含む円錐形のガラスフラスコに移し大腸菌 OP50。線虫が最初に食べ物を提供した時間を書き留めます。 </li><li> （160 rpm）で静かにフラスコを振って、10μLあたりの線虫をカウントし、約10（±2）の平均値を確認する（新鮮なヒントを毎回使用）顕微鏡スライド上に9×10μlの滴を取ります。 </li><li> 20℃、42〜44時間、160 rpmで振盪インキュベーターで線虫フラスコを置きます。 </li></ol></li><li> 7日目の作業：転送は96ウェルプレートに線虫および薬物曝露を開始します。 <ol><li> 、単一のフラスコに線虫の文化を組み合わせ軽くフラスコを旋回維持し、60 mlの滅菌トラフで線虫文化の3×4ミリリットルを配置します。振盪台（160 RPM）で谷を置きます。 </li><li> 8ちゃんを使用してくださいNELピペットは、平坦な透明底の96ウェル黒色マイクロタイタープレートのウェルあたり25μlの一時停止線虫をアリコートに（両方の発光と蛍光読み取りを行うための、または唯一の発光用白色プレート）。プレート蓋で覆い、脇に置きます。 <ol><li>後ごとに2枚のプレートの設定、失われたボリュームを交換するトラフ内の別の2×2.5ミリリットル線虫を置く（約7ミリリットルの谷に「デッドボリューム」を保ちます）。 </li><li>線虫との13/14のプレートを設定します。 11線虫プレートを2枚の96ウェル薬物プレートを試験するために必要とされます。線虫のプレート番目 12は、制御等の車両を独占的にロードされます。 13 番目のプレートは、8日目にバックグラウンド蛍光を確立するために使用される（下記参照）。間違いがセットアップ中に発生した余分な板を使用するために調製することができます。 </li></ol></li><li>振盪インキュベーターで湿ったチャンバー内の各ウェルと場所のプレートへの完全なSのアリコート74μlの（素材リストを参照してください）​​（20℃、160 rpm）でUNT予め選択された発達時点でのアリコートの試験化合物を準備IL（提供食後例えば、45時間30分）。 【ウェルあたりのボリュームは現在99μlです]。 </li><li>試験に薬剤プレート（単数または複数）を解凍します。 </li><li>ヒントを毎回変え、薬物と線虫のプレートを設定するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。薬を小分けするために、96ウェルプレートあたり5分を許可します。 <ol><li>薬剤プレートの1 列目から1μLを取り、列線虫を含むプレートの1-5に追加します。列線虫を含むプレートの8-12への薬物プレートで2 番目の列から繰り返します。列6と線虫のプレートの7に車両の1μLを加えます。 注：化合物/車両：100希釈の線虫のプレート中のウェルあたりの総容量は、1の結果を100μlになります。 </li><li>第二の線虫のプレートの列1-5 / 8-12に薬剤プレートの第 3 / 第 4列の1μLを添加することにより、プロセスを繰り返し、列6と線虫のプレートの7に車両を追加します。</li><li>残りの薬剤プレートの列をテストし続けます。薬剤プレートのカラム12からサンプリングすることにより、すべてのウェルに車で1線虫プレートの最小値を設定します。バック湿ったチャンバ内で20〜22時間（20℃、160 rpm）を振盪インキュベーターに入れプレート（8日目のための注意を参照）。 </li></ol></li><li>翌日の発光バッファをパート準備：1％DMSOおよび0.15％トリトンX-100を取得するための完全なSの必要量にDMSOおよび10％トリトンX-100を追加します。発光のために読んでプレート当たり5ミリリットルに加え、1mlをルミノメーターインジェクタをプライミングするために許可します。 </li></ol></li><li> 8日目の作業：実験的なエンドポイントを読む - 蛍光と生物発光。 （GFP蛍光測定値は、生物発光データを正規化するための手段として推奨されています。） 注：記載された実験条件の下でかなりの子孫の生産を防止するために、線虫に提供食べ物後66〜67時間までに、エンドポイントを読むことを目指します。 <ol><li> GFPの測定値のバックグラウンドコントロールとして使用するためにプレートを設定します。 C言語15ミリリットルチューブに13 番目のプレートからombineよく内容。線虫は（2-3分）を解決するために許可します。ウェルあたり100μlの細菌懸濁液をマイクロプレート（透明底部と黒）をロードするために上清を使用してください。 <ol><li>線虫を見ることができる井戸の下に注目顕微鏡下でのバックグラウンドコントロールプレートを観察します。その後のデータ分析に使用されるバックグラウンドの見積もりからこれらを除外します。 </li></ol></li><li>バックグラウンドコントロールを含む各96ウェルプレートの蛍光を、お読みください。 （設定：プレートの底から光学; 485/20励起フィルター; 20分の528放射）。 </li><li>発光測定値のためにバッファを準備します：ルシフェリン（20 mM）のパート準備するためのバッファを（前日から）を追加し、1％のDMSO（1×）、0.15％トリトンX100（3回）および0.3 mMのルシフェリン（3回発光バッファを取得します）。 150μlの発光バッファーで総理ルミノメーターインジェクタ6倍。 <ol><li>前のステップでは、薬物暴露中の車両として、1％DMSOを前提としています。車両が水である場合には、共調節3％（ すなわち、3回）に発光バッファー中のDMSOのncentration。 </li></ol></li><li>一度に一つのプレートで動作します。ウェル当たり50μlの発光バッファーを分注します。 （ウェル中の150μlの最終容量;発光バッファの3倍希釈：1％DMSO、0.05％トリトン-X100および0.1mMルシフェリン最終濃度）のプラットフォームを振っに即座に置き、タイマーを開始します。 <ol><li>プラットフォーム（160 rpm）を振っに3分後、発光（測定あたり1秒）をお読みください。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4.データ解析<ol><li>蛍光結果からの読み取りの平均GFPの背景を引きます。それぞれのGFP読み取りによって生物発光を割ります。 <ol><li>高いGFPの値が化合物に暴露された線虫のために検出された場合、任意の化合物の蛍光を考慮するためにそれ自体で化合物の蛍光を測定します。平均より高い場合は、代わりに背景として使用します。 </li></ol></li><li>エクスプレス生物発光、GFP正規化された生物発光A各プレートにおける車両制御のための平均値の百分率としてND GFP蛍光データ。 </li><li>各濃度の平均値を、エラーバーをプロットします。 </li><li> 「濃度」、「実験」、およびそれらの相互作用の効果と分散の2方向分析（ANOVA）を使用して統計的有意性についての試験（各データ点は、単一のウェルをいう）、およびポストホック検定（対としてダネット検定を使用して。車両制御）。 注：「実験」または「相互作用」という用語は、有意である場合には、さらなる実験は、応答を確認するために必要とされ得ます。実験の間にばらつきがデータプロットの観察から明らかでない場合には、一方向ANOVAは、独立した実験からプールされたデータに対して実行することができます。 <ol><li>唯一の車両とプレート（S）の統計分析のために、列6 -7で全てのウェルと対照群として行Hにおける全てのウェルを選択します（これらは、日常的に化合物試験中の車両に割り当てられた位置です）。 </lI&gt; </ol></li></ol>

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	<li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+phenotypic+gap:+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7 (2008).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans,+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor.">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li><li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor.">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503 (2012).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells.">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li><li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+the+Crabtree+effect:+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants.">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5'-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li><li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tobacco-specific+nitrosamine+4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone+(NNK)+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content,+transcription,+ATP+production,+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans.">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).</li><li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism.">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li><li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors.">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases.">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li><li>Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).</li><li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+in+chemical+biology:+a+compendium+of+inhibitors,+mechanistic+evaluation+of+chemotypes,+and+suggested+use+as+a+reporter.">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li><li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism.">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li><li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function.">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li><li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development.">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li><li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans.">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li><li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development.">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li><li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods.">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877 (2013).</li><li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7,+two+major+components+of+the+hypodermis.">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li><li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans:+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress:+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae.">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+Grow+or+Not+to+Grow:+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest.">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li><li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media.">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li><li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH,+salinity,+and+hardness+in+aquatic+media.">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li><li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response.">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li><li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません

モデル生物C.エレガンスは、強力な実験系を提供します。それは、文化に簡単で、（L4まで幼若幼虫L1を介して）大人の再生に卵から3.5日のライフサイクルと豊富な遺伝的に同一の子孫を生成します。 、その小さなサイズのために、それは、好都合には、化合物のスクリーニングを容易にする、96ウェルプレート中で増殖させることができます。我々は、Cの株に基づいて表現型スクリーニングプロトコルを提示96ウェルプレートルミノメーターおよび滅菌キャビネットが必要であるが、エネルギーレベルのインビボセンサーとして作用エレガンス 。14プロトコルは、任意の実験室に適用可能です。良好な研究室の技術を使用して、アッセイ内の汚染を防止することが重要です。手動で作業する場合は、達成可能な線虫板の最大数は、2×96ウェル薬物プレートの試験を可能にする二つの車両プレートを含む実験当たり13です。代表的な結果を私はrotenon阻害ミトコンドリア複合体のために提示されていますE、スーパーオキシド発生パラコート、クエン酸回路の中間オキサロ酢酸と知らホタルルシフェラーゼ阻害活性を有する4つの化合物。予測されるようにオキサロ酢酸は、ATPの大発生に起因する可能性が高い、強化につながったのに対し、最初の2つの化合物が生物発光の減少につながりました。オキサロ酢酸のデータセットは、レポーターとしてホタルルシフェラーゼに基づいて、実験における固有のばらつきを示します。 3つの独立した実験の最小値は、未知の化合物への応答の頑健性を確認することが賢明です。 ホタルルシフェラーゼ活性の阻害は、市販のキットを用いたin vitroアッセイと識別可能であった。3つの化合物の一つは、ホタルルシフェラーゼ酵素の活性に結合することによって、ルシフェラーゼ、GFPタグ付きのレベルを増加させる阻害剤と一致するGFP蛍光の大幅な増加をもたらしましたサイト、それはより安定したレンダリング。いくつかの例では15阻害剤が過剰基板によって変位したとき（この特定のケースではない）、これは生物発光のレベルの増加につながる可能性があります。15それは、減少または増加ATPレベルとしてホタルの酵素と相互作用する化合物から、誤って結果を解釈するのではなく、したがって、重要です/ミトコンドリア機能。発光信号の変化は、かなり頻繁にこのような動き、発展と成長のような健康の追加の測定と相関します。例として、生物発光信号の劇的な低下が検出された場合、化合物は、疑わしいルシフェラーゼ阻害剤であるが、ワームは、顕微鏡観察によりコントロールと区別できません。成長または化合物の自己蛍光では説明しないGFP蛍光の増加は、また、阻害剤を指してもよいです。ルシフェラーゼ阻害剤15の数が知られており、PubChemに入力されています。したがって、まず第一に、それはPubChemによって保持されたルシフェラーゼ阻害剤に関する情報を参照してくださいすることをお勧めします。トンが続きます精製酵素3および/ ​​または付加的な手段によってミトコンドリア機能に及ぼす影響の確認を用いたin vitroアッセイにおける化合物の効果のesting。16,17 （上述のように、一部のルシフェラーゼ酵素阻害剤の潜在的な検出）GFP蛍光測定が可能な場合、生物発光と一緒にこのエンドポイントを測定するための強力なケースを作るホタルルシフェラーゼレベルの検出を可能にします。 GFPと生物発光の測定値の正規化は、（これは、複数の技術的な複製を含めることによって達成することができますが）ウェル間ワーム数の変動の会計処理の手段です。より高い感度のためには、測定値からバックグラウンド蛍光を引くことが重要です。プロトコルは、しかし、線虫の自家蛍光は、任意の老化STUに特に重要で、（の現在のアッセイの限界を占めていない、バックグラウンドの蛍光に細菌懸濁液の寄与を評価します線虫の自家蛍光）は年齢とともに増加することを考えると死にます。試験化合物の自家蛍光も並行して評価されるべきです。研究者は、生物発光の導入遺伝子の発現のレベルの任意の歪みの差を制御するために、異なる遺伝的変異体、又は異なる遺伝子のサイレンシング後の細胞ATPプールを比較するためのプロトコルを適合させることを望む場合にGFPの正規​​化が必要不可欠と思われます。 プロトコル内の重要なパラメータは、露光が開始される発達段階、露出の長さを含み、別のウェル中で線虫の同様の番号を取得します。露出しかし、線虫の発生の任意の段階でのL3段階を開始することができ、または古いであることが好ましいです。ミトコンドリアDNA含有量、酸素消費量とATPレベルでは非常に顕著な増加によって証明されるように、この段階から、線虫は、大人になって開発のための酸化的リン酸化に依存している。18,19,20存在プロトコルは、博覧会を開始L4段階でURE。 （むしろ、最初L1段階で食品を提供した場合に比べて）が、この段階で、96ウェルプレートに線虫を小分けする理由は、プレートは、蒸発を最小限にするために、湿ったチャンバー内に配置されているが、蒸発の程度は未だで発生することです蓋の上に形成する微小な液滴として見られる私たちの振盪インキュベーター、（これは他の揺れインキュベータの問題ではないかもしれません）。ちょうど薬物標準を添加する前にプレートに線虫を分取することにより、実際の薬物濃度は、蒸発によるボリューム内の任意の小さな変化に影響されません。車で線虫のプレートをロードするだけで線虫が均等に井戸の間に分布していることが確認するのに便利です。車両のみ板に発見された有意差をウェルに線虫を分配するの貧しい技術の指標となるであろう。 露出の長さは考慮すべき重要な要因です。独立して成長のエネルギー状態への影響は、関心のある、プロであればトコールは、（例えば、ほぼ即時の応答から、2時間）より短い曝露に適応するように修正することができます。 C.への化合物の一方、エントリエレガンス組織は、いくつかの時間がかかることがあります。例えば、12-24時間は、レスベラトロールおよび5-フルオロ-2&#39;-デオキシウリジン（FUDR）の最大内部濃度を達成するために必要とされる。 図21は、したがって、より長い曝露（18時間〜24）は、曝露レベルを最大にするために正当であり得ます。露光時間は、再生の有意なレベルが十分に場所を取ることはできません回に制限する必要があります。我々は、線虫の全発育時間は66〜67時間の下に保たれていることをお勧めします。便利なものの、線虫は、それまでに妊娠しているとegglayingを開始しています。それにもかかわらず、我々は、卵調製物からの生物発光測定値（図示せず）を無視できることがわかりました。 シュール5プロモーター駆動導入遺伝子発現は、100セルステージ 22とCで受精後2つだけ〜2時間半を最初に検出されましたhitinous卵殻は、ルシフェリンの進入を制限する可能性があります。その他は、孵化卵は妊娠成人の代謝に有意に寄与しなかったことを見出した。23が、かなりの子孫の生産を可能にする条件は避けるべきです。好適な場合には、実験的なタイムスケールが戻って移動させることができる：私たちは、以前に遅く、L3幼虫期（36時間）での環境毒素への暴露を開始し、55時間後に生物発光とGFPの測定を行った2代わりに、条件付きで滅菌されている遺伝的背景FER-15（B16）II例えばように、子孫の生成を防止するために使用することができます。 FEM-1 15℃に維持したが、25℃で無菌であることができる（hc17）IV二重変異体。24これは、それ自体では線虫の代謝に影響を与えることができるように無菌性を誘導するFUDRの使用は推奨されません。25アッセイ可能性また、このような部分喪失FUNCTとしてより透過性のキューティクルを有する株で実行すること多感応性薬物の浸透性を増加させる原因であるイオンバス8の変異体。26これは、より短い暴露および下部化合物濃度を容易にします。これらの線虫にルシフェリンを添加するための条件も発光緩衝液中の1％DMSOおよび0.05％のTriton-X100は、ルシフェリンの可用性を向上させるために必要とされないかもしれない、すなわち調整する必要があるかもしれません。 プロトコルは、化合物の送達のための媒体として、1％のDMSOを使用しています。致命的ではないが、DMSOのこの濃度は、我々が以前の出版物で説明したように、いくつかの生物学的効果を有する。3利用可能な薬物ライブラリの多くは、車両の希釈後に、細胞ベースのアッセイのために適切である濃度で、100％DMSO中で調製され0.1％です。より高い化合物濃度は、Cの応答を誘発するために必要とされていますそれ未満、1％DMSOでアッセイを実施することがしばしば不可能であるようなヒト細胞と比べてエレガンス 。ここでも、株を用いましたより透過性キューティクルは、車両のより低い濃度でテストにつながる可能性があります。 1％より高いDMSOの濃度が推奨されていません。 測定値の前にルシフェリンとセットインキュベーション時間はに付着する必要があります。以前に示したように、発光は次の30分1以上の発光のゆっくりと漸減が続く、最初の5分間は比較的安定した残り、ルシフェリンを追加した後、第2分以内に最大レベルに達しました。特定の化学物質への動的応答は、ルシフェリンの最初の分注後に30分間のこの初期の段階で行うことができます。 プロトコルは、線虫の集団の同期化を達成するために、卵の収集を以下の飢餓工程を含みます。異なる発達段階は、細胞のATPレベルが異なり、試験化合物に対して異なる応答することができるので、我々は、線虫試験集団の同期をお勧めします。 Sの完全に飢餓を行うことによりM9とは対照媒体として、ハッチング線虫は、その幼虫が発生しないので、炭素源（エタノール）が設けられているが、完全に飢えていません。27,28また、L1を逮捕したのは、食品への迅速な対応のためにプライミングされており、そのことが示されています食品が利用可能になった後、通常のL1の成長速度は、3時間以内に達成される。29しかし、飢餓工程は、Cの代謝を変化させてしまう可能性エレガンスを除外することはできません。飢餓の長さが24時間を超えてはならない。このため30（18時間は、同期のために十分です）。特定の研究室は、完全飢餓工程を迂回年齢同期のためCOPAS Biosorterを使用する可能性を有していてもよいです。他の研究室は、漂白前に固形培地（OP50とNGMプレート）上の線虫集団を拡大するための好み（ステップ3.1）を有することができ、これも問題なく動作します。我々は、線虫の培養のための標準培地、などの化合物の曝露の間に媒体Sを使用howeveRその他のメディアは、例えばK媒体またはEPA適度に硬水のために選択することができるが、多くの場合、環境毒性の研究のために使用される。31,32 プロトコルは、スクリーニングするおよびミトコンドリア機能に及ぼす影響の点で更なる試験のための候補を同定するための手段を提供します。一次スクリーニングの段階で、いくつかの化合物は、したがって、薬物の画面が完全なものではありません、のみによる1つの濃度が試験されることに見逃されている可能性が高いです。ヒットはC.、例えば酸素消費のためにミトコンドリア機能のさまざまな側面を評価するための技術の使用によって検証することができますエレガンスは、GFPを発現するミトコンドリアを有する菌株、ミトコンドリア膜電位、および/ ​​またはROSの測定のための汚れ。16,33,34の方法の最大の意義は、多細胞生物のレベルの化合物および/ ​​または条件の多数をスクリーニングするための手段を有することであり、そして重要なのは目の利点を活用できる​​ようにするために、Cの電子遺伝的扱い易作用機序を調査するエレガンス 。技術が加速し、興味深い化合物と標的の発見に新しい経路を見つけるのに役立つことがあります。これは、疾患関連の文脈における化合物ライブラリーのスクリーニングのためのヒトの疾患に関連する遺伝的背景とセンサーの組み合わせが提供する多くを持っていることが想定されます。

この手順の全体的な目的は、Cのエネルギー状態の迅速な定量化です化合物スクリーニングにおけるエンドポイントとしてこれを使用するビューとin vivoでのエレガンス 。 根拠は、線虫C.におけるホタルルシフェラーゼのトランスジェニック発現に基づいていますプラスミドpSLGCV（1経由エレガンス 1-3 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862）。</a>ルシフェラーゼ酵素は、緑色蛍光タンパク質GFPと融合させて、（信号を標的ルシフェラーゼペルオキシソームを除去した）、細胞質中で構成し、遍在的に発現されます。基質ルシフェリンを外因的に設けられているときに発光をもたらします。ワームは透明であり、光は相対光単位（RLU）としてルミノメーターで測定することができます。生物発光反応とその可用性細胞ATP燃料が生成された光のレベルを決定します。その結果、発光法はconvenienを提供していますATP産生がミトコンドリア内で主に発生するのでtは、相対的なATPレベルを評価し、拡張ミトコンドリア機能によって意味します。ミトコンドリア機能と生物発光のレベルとの間のリンクは、ミトコンドリアの電子伝達鎖遺伝子およびそれに伴う減少し、光出力を黙らせる以前に実証されている。1 生成された生物発光株はPE254（feIs4）に指定し、 PE255（feIs5）1（材料のリストを参照）と交換可能に使用することができる。研究の3数は、アジ化ナトリウム1、カドミウム2、下水などの様々な生体異物化学物質への曝露後にインビボで細胞ATPレベルをレポートするには、これらのセンサー株を利用してきました汚泥エキス3、5&#39;-フルオロ-2-デオキシウリジン6、およびタバコ-特異的ニトロソアミン7。株はまた、紫外線C放射線への暴露の影響をモニターするために有用でした<s&gt; 8までとミトコンドリア呼吸鎖の機能を破壊する効果。1,9 GFP融合（PE39）なしでルシフェラーゼ遺伝子を発現する発光センサの初期のバージョンはまた、重金属の影響の調査におよび呼吸器の使用されています。脱共役10株PE254とPE255は、ルシフェラーゼを運ぶ：GFP融合およびGFP蛍光を発光値の正常化のための便利な手段を提供し、線虫の質量に比例して増加することが示されたウェルあたりのワームの微分量の6,9の効果にもすることができます。アッセイ（条件当たり5ウエル以上）で複数の技術的反復を含むによって考慮。3 プロトコルは、エネルギーレベルの in vivoモニタリングの可能性を提供しています（とは対照的に、技術的に、より面倒なインビトロのATPの測定）化合物のスクリーニングを可能にし、全体ムーの生理的な文脈で再配置しますlticellular生物。手順および/またはRNA干渉により遺伝子をサイレンシングすることにより、利用可能な変異株に染色体に組み込まれた導入遺伝子を交配することによって、遺伝的背景の多様に拡張することができます。したがって、Cの最大限に活用することモデル生物としてのエレガンス 。この方法は、ミトコンドリア毒性による薬剤候補の後期不良を低減し、高い動物実験の削減に向けた貢献をすることに役立ちます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Orion II Microplate Luminometer</td>
			<td>Berthold Detection Systems</td>
			<td></td>
			<td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLx800 fluorimeter&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ks 130 basic shaking platform</td>
			<td>Ika</td>
			<td>#0002980000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4349</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Refrigerated incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with eppendorf rotor A-4-44&#160; (for 50/15ml tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette, Costar</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#4489</td>
			<td>Serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 50 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 15 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile spatula</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3007; #3004</td>
			<td>for weighing out chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mM Millex GP filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well assay plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3603</td>
			<td>Black plate clear bottom with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 well assay plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#236105</td>
			<td>White plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir reagent 60 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Finnpipette</td>
			<td>#9510027</td>
			<td>used as trough for nematodes&#160; in protocol section 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage box/damp chamber</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#10 800 058 001</td>
			<td>174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#239305</td>
			<td>Store in aliquots at 4&#176;C,&#160; seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, potassium salt</td>
			<td>Biotium Inc</td>
			<td># 10101-2</td>
			<td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 &#176;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#317275</td>
			<td>Purity 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A16046</td>
			<td>Diltute to 10% in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#475914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans bioluminescent strains</td>
			<td>Author&#39;s own laboratory</td>
			<td>PE254, PE255</td>
			<td>contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General chemicals</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

方法を説明するための代表的な結果は、ロテノン（ 図1）、パラコート（ 図2）、オキサロ酢酸（ 図3）、および薬剤ライブラリ13（ 図4）のスクリーニングの間のようなホタルルシフェラーゼ阻害剤をピックアップし4の化合物について得られました。薬物暴露は、すべての場合において、L4段階で開始したが、食品は最初、他の化合物のために45〜46時間と比較して、線虫に提供した後、パラコート暴露実験は41時間で開始しました。プロトコルは、薬物暴露の開始と露出長のための時間の選択の自由度を可能にします。しかしながら、スクリーニング目的のために、時間は実験間の再現性のために、一度選択するために付着されるべきセット。エンドポイントは、ウェル内の子孫の大規模な産卵と孵化を防止するために、66〜67時間の発生時により測定されるべきです。タイミングのためのガイドラインは 、Tに提供されています1できます。 ロテノン、I阻害剤ミトコンドリア複合体は、ある範囲の濃度の両方の比較的短い（2時間）となりましたエクスポージャー（24時間）（ 図1）の後に生物発光を減少させました。この例では、何のGFPの測定が行われなかったが、技術的反復の数は、使用される（N = 6）をウェル3との間にワーム数の違いを均等に十分です。 24時間の曝露は、生物発光の減少に寄与することが期待された複合体Iの阻害の結果として、線虫が成長する時間の窓、と遅い開発です。これは、特に上記の20μM以上の濃度で、見遅延開発とステレオスコープの下で目視により確認しました。加えて、いくつかの致死率は40μM（定量化ではない定性的な観察）から注目されました。いいえ致死は、2時間の曝露後に観察されなかったが、ワームの動きへの影響が見られました。コントロールoccuに生物発光の相対の急激な減少ロテノンの最低濃度でRRED効果は簡単に2時間暴露で簡単に目視で検出されなかったために2.5μMを、テストしました。生物発光におけるこの減少は、減少した細胞のATPと一致しています。最大の阻害は、特にロテノンをターゲットに任意のその後の実験は、0〜5μM[濃度範囲0〜160μMの間で行われるべきであることを示す使用ロテノンの最低濃度（2.5μM）で達成されたが、他の薬剤との比較の一部として選択されまし​​た当初は10μMで有意な効果を有すると同定]（別の場所で公開されます）。 除草剤のパラコートは、活性酸素種の増加によってミトコンドリアの機能に影響を与えます。ここでは、Cの生物発光にその効果を実証24時間（ 図2）のための濃度範囲に暴露した後エレガンス株 PE254。株はLUC :: GFP融合を運ぶように、GFP蛍光は、ALSましたO正規化の手段として測定した。6,9パラコート大幅生物発光、GFP蛍光および正規化された生物発光を減少させました。ダンネットの事後テストは、車両制御に関連して有意な差とパラコートの濃度は生物発光と正規化された生物発光のための4と8 mMであっただけでなく、正規化された生物発光のための2 mMのことが示されました。大幅にGFP蛍光を減少させる唯一の濃度は8 mMの、成長の影響と時折死者ワームが見られたする濃度（定性観察）でした。生物発光（および正規化された生物発光）の減少は、ミトコンドリアの機能及びATP産生への影響を減少させたと一致した蛍光のそれよりも大きかったです。 C.上でテストされ、クエン酸サイクル中間オキサロ酢酸8mmの単一濃度でエレガンス株 PE254は、生物発光の増加（ 図3）につながりました。いいえ、GFP蛍光を発するありませんNCE測定が得られるか、または追加の目視観察を行いました。しかし、単一の濃度にそのような応答は、さらに濃度の範囲に確認露出、効果のより詳細な観察に値するだろう。それはATPの最終的に大きい生産で、クエン酸サイクルのより高い活性につながると仮定することができるように、この化合物による生物発光の増強は、（それにもかかわらず、それは、GFP蛍光を評価することにより、ルシフェラーゼのレベル上の任意の効果を制御することをお勧めし驚くべきことではありませんその後の実験で）。オキサロ酢酸のデータセットは、ルシフェラーゼベースの実験で見られる応答のばらつきの程度を明らかに示します。我々の経験では、このばらつきが特に少ない有害な露光条件のためのテスト・システムの機能です。 ホタルルシフェラーゼ阻害化合物DDD00001434、DDD0001477、DDD00000635とDDD00023047はPUへの影響を見て、 インビトロの両方を試験しましたrified酵素およびin vivoでのCを使用してエレガンスLUC：GFP発現株。試験した化合物のいずれかの露光条件の下で線虫の死亡を引き起こしたという証拠はなかったです。すべての4の化合物は、25および100μM（ 図4A）をテストした2濃度で、in vitroでのルシフェラーゼ活性に影響を与えました。 DDD00001434は、in vivoでの生物発光（ 図4B）の大幅な減少のための信頼できる正当性を提供する、ほ ​​ぼ完全に精製されたルシフェラーゼの活性を殺しました。直接比較できないが、 インビトロおよびインビボのアッセイ 、DDD00023047への応答は、両方のアッセイで同様でした。 DDD0001477とDDD00000635 は 、in vitroでより生体内で大きな減少を引き起こしました。これらの化合物は、22時間前にルシフェリン基質へのライブワームに提供し、その結果をルシフェリンになったときに、容易に、ルシフェラーゼ活性部位から置換されていないことを反映してもよいのAvaIlable。あるいは、DDD0001477とDDD00000635は、細胞ATPレベル上の付加的な効果を有することができます。これは、ホタルルシフェラーゼを含まない手段によって評価されなければなりません。注目すべきはDDD00000635を化合物に曝露ライブ虫におけるGFPシグナルの強い増強しました。これは、後述します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> ミトコンドリア複合体1図Iは、ロテノンは、Cのエネルギー状態を減少させた阻害剤エレガンス株PE254の生物発光により測定される。同期のL4段階のワームを0、2.5、5、10、20、40、80と2の1％DMSO中の160μMロテノンにさらされる（45〜46時間のL1幼虫に与え食べ物後）時間（短い）、またはそれぞれ48で24時間（長時間露光）生物発光の前の測定値とウォーム開発の69時間食物を提供した後。生物発光（単位相対光単位、RLU）は、車両（1％DMSのパーセンテージとして表しました。O）の値。エラーバーは、各ロテノンの濃度で技術的反復のSEMを示している（N = 6）。試験した全ての濃度は、ビヒクル対照（p &lt;0.001）との関係で非常に統計的に有意な差を生じました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> 酸化的ストレッサーパラコート2図は 、Cのエネルギー状態を減少させましたエレガンスは、（生物発光により測定）の濃度依存的にPE254株。同期L4段階のワームを（この例では便宜上41時間でL1幼虫に与え食品後）0、0.25、0.5、1、2、4又は8に暴露されました24時間ミリモルのパラコート。 GFP蛍光（単位相対蛍光単位、RFU）は、生物発光データ（RLU単位）、65時間の開発で得られた両方のエンドポイントを正規化するために使用しました。データを対照のパーセンテージ（1％DMSO）のように表現されます。エラーバーは、技術的反復のSEMを示しています（N =異なる濃度について5であり、n = 18コントロール用）。一方向ANOVA：車両制御に*** P &lt;0.001相対。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> 図3.クエン酸サイクル中間オキサロ酢酸（8 mM）をCの生物発光を強化しましたエレガンス株 PE254。同期のL4段階のワーム（L1幼虫に与えられる食物後45-46時間）がたて30分±18時間8ミリモルのオキサロ酢酸を準備するために曝露しました。生物発光（RLU単位）は63.5時間±1時間の発生時に読み込まれた車両制御（のddH 2 O）のパーセンテージとして表しました。別の列は、同じ実験内の別の96ウェルプレートに割り当てられた8技術的反復の異なるデータセットを表します。エラーバーは、技術的複製物のSEMを示している（N = 8）。 2ウェイANOVA要因としての「設定」と「集中」を持ちます：̵6;セット「P&gt; 0.05、「濃度」はp &lt;0.001との相互作用項p&gt; 0.05。 A <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> ホタルルシフェラーゼ発光の既知の阻害活性を有する（DDD00023047：DDD00001434、C2：DDD0001477、C3：DDD00000635とC4 C1）ダンディー創薬化合物ライブラリー13から4化合物に対する応答の図4.テスト。 （A）（光単位、RLUとして測定）で精製ホタルルシフェラーゼの活性に対する化合物の効果を、ビヒクル対照のパーセンテージとして表しました。 ATP生物発光CLSIIキット（Roche、マンハイム、ドイツ）をウェルに分注しルシフェラーゼ酵素の同量（白色96ワットでの指示に従って使用しましたエルマイクロタイタープレート）。 ATP、10μMおよび化合物の1μlの最終濃度で提供された（最終濃度を示す）またはDMSO（1％）を添加しました。発光シグナルは10秒間統合されました。エラーバーは、技術的複製物のSEMを示している（N = 4）。分析：一元配置ANOVA; * P &lt;0.05または*** P &lt;車両制御に0.001相対。 、およびC2、C3のための重要な（それぞれDDD0001477とDDD00000635; P &lt;0.05）。GFP蛍光に（B）生物発光のインビボ測定、正規化された生物発光と、C1た（p &lt;0.001 DDD00001434）のために非常に重要な25および100μMの違いCの GFP蛍光22時間のための試験化合物への曝露後67時間発育時エレガンス株 PE254。エラーバーは、技術的複製物のSEMを示している（N = 8）。統計解析（片道-ANOVA）は、3つのデータセット（3 XN = 8）からのプールされたデータに対して実施。 * P &lt;0.05または*** P &lt;それぞれの車両制御に0.001相対。 DifferenC4（DDD00023047）への曝露後に正規化された生物発光のための25および100μMのみ統計学的に有意な（p &lt;0.05）の間のCES。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>時刻</td><td> 1日目</td><td> 2日目</td><td> 3日目</td><td> 4日目</td><td> 5日目</td><td> 6日目</td><td> 7日目</td><td> 8日目</td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>ステップ5 </td></tr><tr><td> 10月11日</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>ステップ5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>ステップ4 </td><td>ステップ5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>ステップ4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><tD&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td>ステップ1 </td><td></td><td></td><td></td><td>ステップ3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td>ステップ2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> プロトコルステップの表1の概要は、線虫の実験のそれぞれの日に（セクション3）を実施し、タイミングを示唆したことができます。

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A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

スクリーニング可能<em&gt;インビボ</em&gt;トランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K ビュー.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

ビデオ: A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

生物学

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

IVISスペクトラムを用いた乳腺腫瘍の in vivo生物発光イメージングに

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

培養<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em &gt;微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

結合されたヌクレオチドおよび線虫のタンパク質抽出

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...