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1. Producción de dorsales Sustratos <ol><li> La producción de una película plana de PLLA por colada solvente. <ol><li> El trabajo en una campana de humos para preparar una solución de 2% (w / v) PLLA en cloroformo (2 g PLLA en 100 ml de cloroformo) por agitación a temperatura ambiente (RT) hasta que se disuelva completamente (3 hr aproximadamente). </li><li> Coloque las arandelas en una placa de Petri de vidrio. Nota: Use arandelas de acero inoxidable con un diámetro interior de 10,5 mm (ligeramente menor que el diámetro de la muestra ventral) de manera que la arandela se coloca en la parte superior del sustrato ventral. Otros materiales tales como politetrafluoroetileno (PTFE) o arandelas de vidrio podrían ser utilizados también. </li><li> Añadir 200 l de la solución de PLLA en la lavadora y dejar evaporar lentamente durante 30 min a TA. Con el fin de permitir la evaporación lenta del disolvente, cerrar la placa de Petri con papel de aluminio con unos pocos agujeros. </li><li> Calentar las muestras a 120 ° C durante 5 min con el fin de evaporar trazas de disolvente. </li><li> Deje que las muestras refrescan hacerwn a TA. </li><li> Una vez que las muestras se hayan enfriado (30 min aproximadamente), cubrir con 18,2 mO · cm de agua en la placa de Petri y se incuba durante 8 min a TA. Nota: Si las muestras no están completamente enfrían, pueden tardar hasta 18,2 mO · cm de agua y adoptar un estado gomoso. Además, la incubación en 18,2 mO · cm de agua durante menos de 8 min puede resultar en el desprendimiento inadecuada, y durante más de 8 min en el desprendimiento de la lavadora. </li><li> Con una hoja de afeitar, levante las arandelas de pelarlos la placa de Petri. </li><li> Retire cualquier imperfección desde el borde de la lavadora con pinzas y dejar que las muestras de aire seco. </li><li> Almacenar las muestras en un desecador de vacío (80 mbar) hasta el día del experimento porque PLLA es degradable por hidrólisis. </li></ol></li><li> Producción de fibras de PLLA por electrospinning. <ol><li> El trabajo en una campana de humos para preparar una solución de 8% (w / v) PLLA en hexafluoroisopropanol (8 g PLLA en 100 ml hexafluoroisopropanol) por stirrción a temperatura ambiente hasta que se disuelva completamente (3 horas aproximadamente). </li><li> Coloque el politetrafluoroetileno (PTFE) arandelas en una lámina de aluminio o en un tambor para el electrospinning el fin de obtener fibras aleatorias o alineados respectivamente. Nota: El uso de politetrafluoroetileno (PTFE) arandelas con un diámetro interior de 10,5 mm (ligeramente menor que el diámetro de la muestra ventral) de manera que la arandela se coloca en la parte superior del sustrato ventral. Otros materiales tales como arandelas de acero inoxidable o de vidrio podrían ser utilizados también. El tambor debe girar a una velocidad angular de 160.7 seg -1 (radio = 7 cm) con el fin de obtener fibras alineadas. Una velocidad más lenta podría no activar la alineación de la fibra y una mayor velocidad se traducirá en fibras rotas. </li><li> Cargue la jeringa con la solución de polímero y colocarlo en la bomba de jeringa. </li><li> Electrospin la solución de PLLA utilizando una tasa de flujo de 0,9 ml / hr con una tensión de 30 kV y una distancia de colector de 12 cm. </li><li> Detener el proceso de electrospinning popaer 20-30 min, una vez que se logra una buena densidad de fibra (ya que las células tienen que interactuar con varias fibras simultáneamente). </li><li> Calentar las muestras a 120 ° C durante 5 min con el fin de evaporar trazas de disolvente. </li><li> Almacenar las muestras en un desecador de vacío (80 mbar) hasta el día del experimento porque PLLA es degradable por hidrólisis. </li></ol></li></ol> 2. Sandwich Cultura <ol><li> Montar la cultura de sándwich, una vez las células se adhieren al sustrato 2D ventral. <ol><li> Trabajo en una campana de cultivo para garantizar condiciones de esterilidad y esterilizar todos los materiales (cubreobjetos de vidrio, sustratos dorsales, pinzas, etc.) por la exposición UV durante 30 minutos. </li><li> Escudo con el fin sustrato ventral y dorsal con fibronectina dirigir adhesión específica de proteínas de la célula. Para ello, se incuban las muestras en 20 g / ml de fibronectina disueltos en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) que contiene Ca 2+ y Mg 2+ (200 l / samplio) durante 1 hr. Nota: Debido al proceso de fabricación, los sustratos dorsales tienen unos lados superior e inferior designadas porque la película y electrospun fibras de disolvente fundido unidos a uno de los lados de la lavadora. Por tanto, este lado es la que da las células (Figura 3). <ol><li> Después de que el recubrimiento de proteína, lavar las muestras dos veces con DPBS con el fin de eliminar la proteína en exceso. Entonces incubar muestras en DPBS hasta su uso a fin de evitar muestras de conseguir seco ya que esto provoca desnaturalización de proteínas. Use DPBS que contenía Ca 2+ y Mg 2+ desde cationes divalentes regulan el plegamiento de proteínas. </li></ol></li><li> Células de semillas en el cristal cubreobjetos 13. Nota: Como la cultura de sándwich se basa en sustratos 2D, la siembra de células se realizará de manera similar como en una muestra 2D. Por ejemplo, C2C12 mioblastos se sembraron a 17.500 células cm -1 para los experimentos de diferenciación y NIH3T3 fibroblastos se sembraron en 7000 canas cm -1 para cultivos aislados para estudiar la morfología celular y la adhesión. </li><li> Colocar las muestras en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 y permiten que las células se adhieran al sustrato ventral durante 3 h. </li><li> Coloque el sustrato cabeza de serie ventral en un nuevo pocillo de una placa de 12 pocillos múltiples (donde arandelas encajar). Nota: Montaje de la cultura de sándwich en un nuevo pozo es una forma de deshacerse de las células que se han adherido a la parte inferior del pozo después de la siembra, ya que estos consumen nutrientes y secretar factores de crecimiento y de residuos que influyen en células cultivadas dentro de la de sándwich sistema. Esta es también una necesidad para extracciones celulares con el fin de lisar sólo las células cultivadas en el medio ambiente de sándwich. </li><li> Con cuidado y con la ayuda de un par de pinzas, superponer el sustrato dorsal sobre las células. Vuelva a llenar con medio (1 ml) y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. Nota: El peso de la lavadora evitará que el sub dorsaltrar desde flotante. </li><li> Cambie el medio dos veces por semana como en las culturas 2D estándar. No mueva el sustrato dorsal ya que esto podría resultar en el daño celular. </li></ol></li><li> Montar la cultura de sándwich justo después de la siembra de células. <ol><li> Trabajo en una campana de cultivo para garantizar condiciones de esterilidad y esterilizar todos los materiales (cubreobjetos de vidrio, sustratos dorsales, pinzas, etc.) por la exposición UV durante 30 minutos. </li><li> Escudo con el fin sustrato ventral y dorsal con fibronectina dirigir adhesión específica de proteínas de la célula. Para ello, incubar las muestras en 20 g / ml de fibronectina disueltos en DPBS que contenía Ca 2+ y Mg 2+ (200 l / muestra) durante 1 hora. <ol><li> Después de que el recubrimiento de proteína, lavar las muestras dos veces con DPBS con el fin de eliminar la proteína en exceso. Entonces incubar muestras en DPBS hasta su uso a fin de evitar muestras de conseguir seco ya que esto provoca desnaturalización de proteínas. Use DPBS que contenía Ca 2+ y Mg <sarriba&gt; 2+ desde cationes divalentes regulan el plegamiento de proteínas. </li></ol></li><li> Células de semillas sobre cubreobjetos de vidrio en un pocillo de una placa de 12 pocillos múltiples (donde arandelas encajar). Para ello, utilice una suspensión celular de alta concentración para evitar la pérdida de células después de la colocación del sustrato dorsal. </li><li> Con cuidado y con la ayuda de un par de pinzas, superponer el sustrato dorsal sobre las células. Vuelva a llenar con medio (1 ml) y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. Nota: El peso de la lavadora evitará que el sustrato dorsal de flotante. </li><li> Cambie el medio dos veces por semana como en las culturas 2D estándar. Nota: No mueva el sustrato dorsal ya que esto podría resultar en el daño celular. </li></ol></li></ol> 3. Análisis Nota: Las culturas de sándwich se basan en sustratos 2D, y así se pueden comúnmente analizadas por procedimientos ya desarrollados por las culturas 2D estándar. Por ejemplo, desde PLLA es transparente y cells están obligados a moverse dentro del plano xy, la microscopía se realiza como sobre sustratos de 2D. La migración celular se puede por lo tanto analizarse como para cultivos 2D, sin la necesidad de rastrear células en el eje z como para cultivos en 3D, lo que simplifica el análisis experimento y la imagen. Para estudiar el ensayo de la curación de la herida mediante un ensayo cero sigue este protocolo: <ol><li> Estudio migración celular (ensayo de la curación de la herida) dentro de la cultura de sándwich. <ol><li> Trabajo en una campana de cultivo para garantizar condiciones de esterilidad y esterilizar todos los materiales (cubreobjetos de vidrio, sustratos dorsales, pinzas, etc.) por la exposición UV durante 30 minutos. </li><li> Escudo con el fin sustrato ventral y dorsal con fibronectina dirigir adhesión específica de proteínas de la célula. Para ello, se incuban las muestras en 20 g / ml de fibronectina disueltos en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) que contiene Ca 2+ y Mg 2+ para 1 hr. <ol><li> Después de que el recubrimiento de proteína, lavar las muestras dos veces con DPBScon el fin de eliminar la proteína en exceso. Entonces incubar muestras en DPBS hasta su uso a fin de evitar muestras de conseguir seco ya que esto podría causar la desnaturalización de proteínas. Use DPBS que contenía Ca 2+ y Mg 2+ desde cationes divalentes regulan el plegamiento de proteínas. </li></ol></li><li> Células de semillas en los cubreobjetos de vidrio en una alta densidad de 13. </li><li> Colocar las muestras en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 y permiten a las células para lograr la confluencia. </li><li> Utilice una punta de pipeta para rascarse la monocapa de células con el fin de obtener 2 poblaciones celulares separadas por un espacio. </li><li> Coloque el sustrato cabeza de serie ventral en un nuevo pozo adecuado para la adquisición de lapso de tiempo y donde sustratos dorsales se ajustan (es decir, 12 placa de múltiples pocillos). </li><li> Con cuidado y con la ayuda de un par de pinzas, superponer el sustrato dorsal en las células y luego rellenar con medio (1 ml para una placa de 12 pocillos múltiples). Nota: El peso de la lavadora evitará tél dorsal sustrato a partir flotante. </li><li> Coloque la muestra en el microscopio de lapso de tiempo (establecido en 37 ° C y 5% de CO 2) y tomar imágenes de la reducción de distancias cada 20 minutos. </li><li> Analizar la reducción de distancias en el uso de software específico, como el MiToBo plugin desde ImageJ. 14 </li></ol></li></ol> Nota: Las proteínas y extracción de ácidos nucleicos se lleva a cabo de manera similar como en sustratos de 2D. Sólo hay un paso adicional que consiste en desmontar la cultura de sándwich para añadir el tampón de lisis directamente sobre las células con el fin de aumentar la eficiencia de la extracción. Por ejemplo, para la extracción de mRNA: <ol start="2"><li> Extracto de ARNm de las Culturas-Sandwich como <ol><li> Preparar todos los tampones del kit comercial según las instrucciones del fabricante. </li><li> Tome la cultura de sándwich fuera de la incubadora. </li><li> Retire el medio de cultivo de las muestras. </li><li> Lavar las muestras una vez con DPBS que contenía Ca2+ y Mg 2+ (1 ml) y quitar toda la solución. </li><li> Con la ayuda de un par de pinzas, retire el sustrato dorsal y añadir el tampón de lisis (350 l) al sustrato ventral. Superposición de nuevo el sustrato dorsal ventral sobre el sustrato con el fin de lisar las células adheridas al sustrato dorsal. </li><li> Retire el sustrato dorsal para aislar la solución de lisis. </li><li> Siga las instrucciones del fabricante para obtener el ARNm. </li></ol></li></ol> Nota: La inmunodetección de las proteínas se puede también realizar como sobre sustratos de 2D. Desde culturas-sándwich como podrían obstaculizar la correcta difusión de los anticuerpos y tampones, los tiempos de incubación debe ser aumentada. Además, el sándwich se puede desmontar antes de iniciar el protocolo de tinción pero en este último caso algunas células permanecerá unido al sustrato dorsal y algunos al sustrato ventral. <ol start="3"><li> Proteínas Immunodetect dentro de una cultura de sándwich <ol&gt; <li> Lavar la muestra una vez con DPBS y fijar con formaldehído al 4% en PBS durante 20 min a 4 ° C. Nota: sustrato Dorsal puede ser removido durante el proceso de fijación de modo que se evitan los problemas de difusión. </li><li> Enjuague con DPBS (1 ml) y luego permeabilizar con 0,5% Triton X-100 en DPBS (1 ml) durante 5 min a TA. </li><li> Bloquear los sitios de unión no específica con 1% de albúmina en DPBS (1 ml) durante 30 min a TA. </li><li> Incubar con el anticuerpo primario (2 mg / ml; 1 ml) en solución de bloqueo durante 3 h a RT. </li><li> Lavar 3 veces durante 10 min con DPBS / 0,5% de Tween 20 (1 ml). </li><li> Incubar 2 h con anticuerpos secundarios (2 g / ml) y 1 mg / ml DAPI en solución de bloqueo (1 ml) a TA. </li><li> Lavar 3 veces durante 10 min en DPBS / 0,5% de Tween 20 (1 ml). </li><li> Lave en DPBS. Nota: Las muestras se pueden montar en una diapositiva con Vectashield y sellados con esmalte de uñas cuando sustratos dorsales se retiran antes de la inmunodetección. </li><li> Observe bajo la micro fluorescenciaalcance como para sustratos de 2D estándar. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Sci. 2 (3), 381-389 (2014).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+cell-material+interactions:+effect+on+cell+morphology.">Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology.</a> Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+within+confined+sandwich-like+nanoenvironments.">Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments.</a> Nanomedicine. , (2015).</li><li>Gla&#223;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration+Analysis:+Segmenting+Scratch+Assay+Images+with+Level+Sets+and+Support+Vector+Machines.">Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines.</a> Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. 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The authors have nothing to disclose.

Hoy en día, la cultura 3D es un tema importante para la industria farmacéutica y biotecnológica, así como la investigación en biología celular, incluyendo el cáncer y células madre. Como consecuencia de ello se han desarrollado varios sistemas de cultivo 3D. Desafortunadamente, las diferencias entre los sistemas 3D suelen dar lugar a un comportamiento celda diferente, lo que dificulta la comprensión del destino celular. Además, los procedimientos experimentales no suelen ser tan sencillo como para los sistemas...

Tradicionalmente, el cultivo celular se ha llevado a cabo en sustratos bidimensionales (2D), aunque la mayoría de los microambientes celulares in vivo tienen una naturaleza tridimensional (3D). Este entorno 2D antinatural desencadena cambios en el comportamiento celular como una forma de auto-adaptación a un mundo plano, lo que afecta directamente el destino celular 1,2. Por lo tanto, los resultados obtenidos en cultivos de células 2D no siempre son reproducibles in vivo. Esto ha favorecido el desarrollo de nuevos sistemas de cultivo relevantes que buscan ofrecer condiciones más fisiológicas similares a obtener más conocimientos sobre cualquier mecanismo biológico 3,4-dimensión dependiente. Una de las principales diferencias entre la cultura 2D y 3D en el entorno vivo es la distribución de receptores de las células ancladas a la matriz extracelular (ECM): mientras que en sustratos 2D células se adhieren ventralmente, la mayoría de las células in vivo son completamente rodeado por el ECM y por tanto, cell adhesión se produce a través de una distribución 3D de los receptores. Esto desencadena diferentes vías de señalización que modulan la adhesión celular así los procesos importantes tales como el crecimiento celular, la diferenciación celular y la expresión génica. Durante las últimas décadas, muchos sistemas de cultivo 3D diferentes se han establecido 5-8, aunque su variabilidad y complejidad dificultan su estandarización en los procedimientos de cultivo celular común. Por otra parte los sistemas 3D no suelen ser fáciles de manejar y procedimientos experimentales actuales sobre sustratos 2D no se pueden establecer fácilmente por las culturas 3D. Además, la literatura raramente compara culturas 3D con la condición 2D equivalente u otros sistemas 3D, lo que dificulta la comprensión adecuada de comportamiento celular en estos modelos. Una vez que tiene las células adheridas sobre un sustrato de 2D, la excitación de los receptores de dorsales - por superposición de una película de un nuevo material (cultivo de sándwich) - pueden desencadenar respuestas de las células por igual entornos 3D. El reahijo detrás de esto es la activación simultánea de ambos dorsal y ventral receptores de adherirse y propagación en el medio ambiente sándwich (Figura 1) 9,10. Como consecuencia, las células sufren cambios importantes con respecto a las culturas 2D 11,12. Por lo tanto, el destino celular se determina durante el montaje debido a la cultura de sándwich, ya que la estimulación dorsal provoca cambios en las vías celulares clave. Por lo tanto, el destino de la célula está altamente determinada por el tiempo cuando la cultura de sándwich se ensambla 11. Debido a la naturaleza del sistema, una cultura de sándwich es una herramienta sencilla y versátil que permite el estudio de diferentes parámetros en las interacciones célula / materiales tales como revestimientos de química, topografía, rigidez y proteínas en ambos los lados ventral y dorsal. Esto ofrece un mayor grado de versatilidad en comparación con otros sistemas 3D (Figura 2) debido a la dorsal independiente y combinación ventral de una amplia variedad de condiciones de la superficie. Además, diferentes líneas celulares y diferentes momentos para ensamblar la cultura de sándwich pueden ser estudiados, aumentando el ancho espectro de posibilidades. Un protocolo estándar de la cultura-sándwich como se detalla a continuación utilizando poli-L-láctico (PLLA) electrospun fibras o películas como sustratos dorsales, cubreobjetos de vidrio como sustrato ventral y fibronectina como recubrimiento de proteína. Culturas de sándwich se reunieron poco después de la siembra de células o después de 3 horas de la cultura 2D. Sin embargo, tenga en cuenta que otros sistemas materiales y proteínas podrían utilizarse; Del mismo modo la cultura de sándwich puede ser montado en diferentes puntos temporales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ploy(lactic acid)</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses (12 mm&#216;)</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>631-0666</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>CL0200</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105228</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010-200V0</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE1000</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage DC Power Supply</td>
			<td>Glassman High Voltage</td>
			<td>Series FC</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hucoa-Herl&#246;s</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow&#160; hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>AV30/70</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

El cultivo celular se ha llevado a cabo tradicionalmente en sustratos bi-dimensional (2D) donde las células se adhieren utilizando receptores ventral a la superficie del biomaterial. Sin embargo, en vivo, la mayoría de las células están completamente rodeados por la matriz extracelular (ECM), lo que resulta en un (3D) la distribución tridimensional de los receptores. Esto puede provocar diferencias en el exterior, en las vías de señalización y por lo tanto en el comportamiento celular. Este artículo muestra que la estimulación de los receptores de las células dorsales ya adheridos a un sustrato 2D superponiendo una película de un nuevo material (una cultura de sándwich) provoca cambios importantes con respecto a las culturas 2D estándar. Además, la excitación simultánea de los receptores de ventral y dorsal se desplaza el comportamiento celular más cerca de la que se encuentra en entornos 3D. Además, debido a la naturaleza del sistema, una cultura de sándwich es una herramienta versátil que permite el estudio de diferentes parámetros en células / material de interacciones, por ejemplo, la topografía, la rigidez y diferentes recubrimientos de proteínas en ambos los lados ventral y dorsal. Por último, dado que las culturas-sándwich como se basan en sustratos 2D, varios procedimientos de análisis ya desarrollados por las culturas 2D estándar se puede utilizar normalmente, la superación de los procedimientos más complejos necesarios para sistemas 3D.

La estimulación de los receptores dorsales dentro de la cultura de sándwich provoca cambios en la morfología celular, la adhesión celular y las vías de señalización intracelular (por ejemplo, quinasa de adhesión focal, FAK) 10-12. Como un ejemplo, fibroblastos cultivados dentro del sistema de sándwich sobreexpresa la integrina subunidad α 5 en comparación con el 2D, como se ha observado para otros cultivos 3D 15,16. Destino celular es alta...

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Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K vistas.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

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Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Superficies micropatterned para estudiar las interacciones de ácido hialurónico con células de cáncer

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Investigación

Bioingeniería

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Microfluídica endotelizado para estudiar las interacciones microvasculares en Enfermedades Hematológicas

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo perfusión placentaria humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabricación de los patrones de oro Nanoporous de Estudios de interacción célula-materiales

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membrana-COLUMNA: una herramienta bioquímica para identificar las interacciones proteína-proteína de Proteínas de la Membrana<em&gt; En Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

El uso de un análisis de biosensores conductimétricos β-lactamase-base para detectar las interacciones biomoleculares

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...